獸醫(yī)生物制品中常用滅活劑和凍干保護劑研究進展

趙成龍，王素春，莊青葉，3，李 陽，潘子豪，孫瑞妮，張富友，5，肖志宇，，梁晚楓，孫福亮，汪 洋，黃禹豐，，陳海燕，，劉華雷，王楷宬，7

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.延邊大學(xué)，吉林延吉 133000；3.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261061；4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095；5.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東泰安 271018；6.河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，河南洛陽 471023；7.青島易邦生物工程有限公司，動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東青島 266114）

滅活劑是指能致死細菌或病毒，使其失去復(fù)制能力和/或致病力（毒力）的化學(xué)物質(zhì)。微生物學(xué)意義上的滅活有兩層含義：一是指破壞或殺死微生物，使其成為沒有生物物質(zhì)的過程；二是指使一些活性物質(zhì)（微生物及其代謝產(chǎn)物、激素、酶、血清因子和抗體等）失去活力的過程。生物制品意義上的滅活是指利用物理或化學(xué)方法，破壞微生物生物學(xué)活性，使其喪失繁殖能力和致病能力，但仍然保留反應(yīng)原性和免疫原性的過程。

凍干保護劑是指冷凍真空干燥的生物制品中抗原活性物質(zhì)以外的添加物，其作用是防止制品在凍干過程中活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水，阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶，以保護微生物活性物質(zhì)的活性與抗原性，降低細胞內(nèi)外滲透壓，保持干燥狀態(tài)下弱毒疫苗微生物的活力。保護劑既有生物學(xué)作用，也有物理學(xué)效應(yīng)。

滅活和凍干對生物制品的抗原含量、核酸含量、免疫原性、穩(wěn)定性和保存期影響較大。不同滅活和凍干技術(shù)的原理并不同，需根據(jù)微生物類型和制備目的，針對性選擇適用的滅活劑和凍干劑。本文主要以禽流感病毒等研究內(nèi)容為例，綜述了目前獸醫(yī)生物制品制備過程中常用滅活劑和凍干劑的研究進展。

1 滅活劑

常用的滅活劑有β-丙內(nèi)酯、甲醛、烷化劑、Trizol 試劑等。對于生物制品的制備，在滅活劑的選擇上應(yīng)多方面考量，根據(jù)滅活原理和制備目的，盡可能選擇適用的滅活劑。

1.1 β-丙內(nèi)酯

β-丙內(nèi)酯（β-propiolactone，BPL）對病毒有較強的滅活作用，其作用機制不是直接作用于殼蛋白，而是通過改變微生物核酸結(jié)構(gòu)達到滅活的目的。大劑量BPL 是一種潛在的致癌物，但其極易水解。BPL 滅活周期短，經(jīng)濟效益高，但相較甲醛價格較高；對病毒有較強的殺滅作用，低質(zhì)量濃度的BPL（2～4 mg/L）可以破壞病毒核酸，但不改變病毒蛋白質(zhì)。試驗結(jié)果[1]顯示：BPL 對禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）的最佳滅活條件為1:3 000 滅活24 h，或1:1 000 滅活18 h；對H9N2亞型AIV 滅活能力強，對血凝素（hemagglutinin，HA）效價影響小，易水解成無害無殘留產(chǎn)物；分別以BPL、甲醛為滅活劑制備H9N2 亞型AIV 滅活疫苗，免疫SPF 雞和廣西土雞，其免疫效果接近。

1.2 甲醛

甲醛對微生物核酸和蛋白都有破壞作用。甲醛可與核酸中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等含氨基堿基結(jié)合，使微生物核酸變性；與微生物蛋白的氨基結(jié)合形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物，后者與酰胺交聯(lián)，使微生物蛋白變性，從而阻止其核酸逸出。甲醛滅活微生物也存在一些缺點：作用于病毒殼蛋白時，容易與酰胺交聯(lián)形成屏障而使作用于核酸的效率下降，導(dǎo)致滅活周期較長；滅活效果容易受到溫度、pH、微生物種類、濃度的影響；具有致癌性，會使機體產(chǎn)生刺激反應(yīng)。甲醛對單鏈核酸最有效，因此常被用來滅活RNA 病毒。適當(dāng)濃度的甲醛可使被滅活微生物的抗原性和血凝性保持不變。陳慧婧等[2]進行了AIV 滅活試驗，發(fā)現(xiàn)用0.1%的甲醛滅活A(yù)IV 16 h 后，病毒全部死亡，18 h為最佳滅活時間。

1.3 烷化劑

烷化劑主要包括二乙烯亞胺（binaryethylenimine，BEI）、乙?；蚁﹣啺罚╝cetylethyleneimine，AEI），是常用滅活劑，化學(xué)性質(zhì)活潑。其滅活機理是使核酸中的腺嘌呤和鳥嘌呤烷基化，導(dǎo)致核酸單鏈斷裂和雙螺旋鍵交聯(lián)，從而干擾核酸合成，抑制其復(fù)制。烷化劑可以與蛋白質(zhì)相互作用，破壞蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，使病毒完全喪失傳染性，但不損傷表面結(jié)構(gòu)蛋白，從而保留其抗原性，因此是制備滅活病毒疫苗的良好滅活劑。目前，用BEI 滅活制備的疫苗已使用于動物中，尚未在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)BEI 殘留。烷化劑作為滅活劑，對生產(chǎn)成本、保存條件要求較高，對細菌滅活效果一般。國內(nèi)外專家[3-5]分別使用BEI 和甲醛對流感病毒進行滅活，通過血凝、RT-PCR 和免疫擴散法檢測，發(fā)現(xiàn)BEI在滅活流感病毒感染性的同時，能夠較好地保持病毒的抗原性。

1.4 Trizol 試劑

Trizol 試劑由苯酚和異硫氰酸胍組成。其滅活機制是使微生物蛋白質(zhì)變性，抑制脫氨酶、氧化酶等酶系統(tǒng)活性，從而導(dǎo)致微生物死亡。幾十年來，使用Trizol 試劑滅活病毒已成為研究人員普遍采用的方法[6]。2018 年，李瑜霞等[7]用Trizol 滅活甲型流感病毒陽性樣品并比較其差異，發(fā)現(xiàn)滅活后的樣品變異系數(shù)較小，滅活穩(wěn)定性較好；經(jīng)過40 次反復(fù)凍融，樣品中依然可以檢測到病毒核酸，對核酸保護效果好；應(yīng)用Trizol 滅活甲型流感病毒制備的質(zhì)控樣品，在熱穩(wěn)定性、保存期、穩(wěn)定性和適用性等方面都具有較好的表現(xiàn)。目前，使用Trizol 試劑滅活微生物尚未發(fā)現(xiàn)其不足之處，具有廣闊的研究前景。

1.5 聚維酮碘

聚維酮碘是一種常見的生物滅活劑，常用于皮膚黏膜殺菌。也有研究將其用于病毒滅活：王玲等[8]用此消毒液滅活脊髓灰質(zhì)炎病毒，發(fā)現(xiàn)所需劑量比滅活細菌和真菌的劑量高10～50 倍，原因可能是聚維酮碘對微生物核酸物質(zhì)作用較差；劉梅等[9]通過試驗證明，聚維酮碘溶液消毒劑對基因VII 型NDV 具有良好的滅活效果；計慧琴等[10]通過雞胚感染試驗和Klein-Defors 懸浮滅活試驗，證明聚維酮碘滅活H3N2 亞型豬流感病毒的最佳質(zhì)量濃度為2%。

1.6 雙氧水

有包膜的病毒對雙氧水滅活較為敏感，1.5%雙氧水在1 min 內(nèi)可使流感病毒全部滅活[11]。雙氧水具有價格低、滅活周期短、對病毒表面蛋白結(jié)構(gòu)破壞較小等優(yōu)點。有研究[12]表明，相對于傳統(tǒng)的甲醛滅活，雙氧水滅活對病毒表面蛋白結(jié)構(gòu)破壞較小，滅活后的病毒具有良好的免疫原性，可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的保護性抗體。使用雙氧水已成功制備日本腦炎病毒滅活疫苗[12]。目前關(guān)于雙氧水用作滅活劑的研究較少，但它仍是一種潛在的滅活劑。

1.7 過硫酸氫鉀復(fù)合鹽

過硫酸氫鉀復(fù)合鹽是一種新型過氧化物滅活劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。其滅活機制主要是利用氧化作用破壞微生物的生物膜屏障，干擾核酸復(fù)制，使蛋白質(zhì)凝固變性，從而滅活微生物，具有廣譜、高效、安全、無殘留等優(yōu)點[13]。張玉霞等[14]研究表明，質(zhì)量濃度為313 mg/L 的過硫酸氫鉀溶劑，可在短時間內(nèi)使H9N2 亞型AIV 全部滅活。

2 凍干保護劑

微生物凍干后存活率降低的最主要原因是凍干過程中冰晶的形成，由于細胞內(nèi)溶質(zhì)濃度高，引起滲透壓增高，導(dǎo)致微生物細胞膜破壞。此外，凍干破壞了親水性大分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)受到破壞，最終影響了微生物存活率[15]。為減少凍干對病毒的影響，需要加入合適的保護劑，以減少或避免外部惡劣環(huán)境對其造成破壞，防止干燥或者復(fù)水對病毒的損壞。凍干保護劑技術(shù)是保證生物制品穩(wěn)定的關(guān)鍵技術(shù)，它不僅為生物制品的冷鏈運輸和貯藏提供了便利，還可提升疫苗效力。凍干保護劑的主要作用機制：（1）將病毒凍結(jié)，使其中冰晶升華，從而達到低溫脫水，防止活性物質(zhì)流失結(jié)構(gòu)水的目的，以降低對生物活性的影響；（2）降低胞內(nèi)外滲透壓差，維持細胞活力；（3）保護或提供病毒恢復(fù)所需營養(yǎng)物質(zhì)，使活性物質(zhì)自我修復(fù)。在選擇凍干保護劑時，要考慮保護核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)和核酸穩(wěn)定性[16]。

常用的凍干保護劑有糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)和大分子明膠等。碳水化合物和蛋白質(zhì)是生物制品相關(guān)研究中最為常見的兩種保護劑[17]。對多品種生物制品分析發(fā)現(xiàn)，因微生物（或抗原蛋白）結(jié)構(gòu)特點各不相同，適用于它的凍干保護技術(shù)也不同，所以沒有一種通用于各種生物制品的“萬能”保護劑。

2.1 糖類保護劑

糖類在微生物凍干過程中的保護作用機制有兩種假說：一是糖類的羥基在干燥和脫水過程中與蛋白質(zhì)的極性基團形成氫鍵，進而取代蛋白質(zhì)上的水分子，形成一層水化膜，防止氫鍵暴露，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，維持病毒的抗原性；二是含糖溶液在凍干過程中會玻璃化，而糖類所處的狀態(tài)為玻璃態(tài)。在玻璃態(tài)下，糖類保護劑黏度較高，分子擴散系數(shù)較低，因而會將蛋白質(zhì)分子包裹，形成一種碳水化合物玻璃體，從而維持了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，起到保護作用[18-19]。研究[20-21]表明：（1）單糖中，半乳糖的保護效果最佳；（2）二糖的保護效果普遍較好；（3）三糖中的棉子糖對細菌的保護作用最好。Costa 等[22]對成團泛菌（Pantoea agglomerans）研究表明，海藻糖和蔗糖用作保護劑時效果最好，當(dāng)使用50 g/L 的海藻糖時，菌群存活率達到83%左右，當(dāng)使用100 g/L 的蔗糖時，存活率達到75%左右。此外，海藻糖分子較小，能填補蛋白質(zhì)分子的空隙，有效限制蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，從而起到保護病毒蛋白外殼的作用[23]。

2.2 氨基酸保護劑

在冷凍過程中，低濃度的甘氨酸可以抑制由于磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致的pH 變化，并防止蛋白質(zhì)變性。結(jié)晶型甘氨酸的主要作用是提升凍干品的塌陷溫度，防止破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。常見氨基酸保護劑主要包括精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、色氨酸、酪氨酸[24-25]。王穎等[26]研究發(fā)現(xiàn)，2%谷氨酸鈉、2% L-精氨酸鹽酸鹽、2%D-山梨醇、7.6%酶解酪蛋白、1%海藻糖、4%明膠、15.2%蔗糖、2%牛血清白蛋白的配方，可使豬偽狂犬病病毒凍干保護率達到80.40%。

2.3 蛋白質(zhì)保護劑

蛋白質(zhì)保護劑主要包括脫脂乳、血清白蛋白、大豆蛋白、膠原蛋白，其能夠阻止病毒蛋白質(zhì)表面吸附，從而對凍干過程中多數(shù)蛋白都能起到保護作用。此外，蛋白質(zhì)可以在微生物細胞外形成保護，在冷凍干燥過程中，蛋白質(zhì)溶液中的保護劑與蛋白質(zhì)分子之間相互作用，增加冷凍混合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，大大增加微生物蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[21，27]。采用質(zhì)量濃度為10.49%脫脂乳與4.22%葡萄糖混合后凍干副干酪乳酸菌，當(dāng)凍干厚度為0.3 cm 時，菌體細胞存活率最高，達到94.90%[28]。

2.4 明膠保護劑

在凍干生化過程中，大分子物質(zhì)（如明膠、蛋白胨、果膠等天然混合物）促進形成耐熱的骨架，從而有效阻斷熱輻射和熱傳導(dǎo)，這種構(gòu)架能增強對病毒的耐熱保護作用。我國大部分獸用凍干活疫苗，根據(jù)生產(chǎn)工藝和保存條件不同，可分為常規(guī)保護劑活疫苗和耐熱保護劑活疫苗。用于疫苗生產(chǎn)的明膠要去掉雜質(zhì)蛋白，使其無抗原性、無過敏反應(yīng)、無熱源，其分子質(zhì)量小、均質(zhì)、易溶于水，對微生物的保護作用要高出普通明膠10%以上[29]。韓志玲等[30]研究發(fā)現(xiàn)，選用20%蔗糖、10%明膠凍干保護劑，與菌液以1:6 的體積配比混合，再加入終質(zhì)量濃度約1%的硫脲，制備布魯氏菌活疫苗（Rev.1 株），凍干前后活菌數(shù)損失比例小于5%。李星等[31]研究發(fā)現(xiàn)，明膠不僅可以增加黏性，使凍干品形成良好的外觀狀態(tài)，還可以增加抗原的穩(wěn)定性。

3 展望

滅活和凍干是獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中必不可少的技術(shù)之一。目前，我國大部分生物制品主要使用甲醛滅活。該方法技術(shù)成熟，價格低廉，但使用甲醛作滅活劑存在破壞免疫原性、有致癌風(fēng)險、滅活時間長等問題[32]，難以適應(yīng)新型疫苗發(fā)展。雖然新型滅活劑研究也已逐步開展，但大多仍局限于實驗室研究階段。未來需要研制新型滅活劑，以增強滅活疫苗的免疫力，減少疫苗的毒副作用，并將新型滅活劑的安全性、有效性、選擇性和可控性有機結(jié)合[33]。

凍干工藝技術(shù)直接影響生物制品的保存、運輸和使用。由于不同保護劑的保護機制各不相同，單一保護劑不能滿足微生物抵抗惡劣環(huán)境的需求，因此在凍干過程中常采用不同類型的保護劑，按照合適的濃度配比進行協(xié)同保護，從而強化保護效果，保證微生物存活率最大化。未來既要開發(fā)常溫凍干保護劑，也要開發(fā)穩(wěn)定的液態(tài)保護劑[34]。