新舊版國家標準《高致病性禽流感診斷技術》血凝和血凝抑制試驗內容比較

張智瑜，袁 凱，徐秀榮，王慧敏，蘭鄒然

（1.淄博市動物疫病預防與控制中心，山東淄博 255000；2.山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250100）

高致病性禽流感（high pathogenic avian influenza，HPAI）是嚴重威脅全球養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的禽病之一，為此世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病[1-2]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類動物疫病。2004 年開始，我國對H5 亞型HPAI 實施強制免疫，并要求開展免疫效果評估[3]。2020 年以前，開展免疫效果評估主要根據(jù)《高致病性禽流感診斷技術》[4]（GB/T 18936—2003，以下簡稱“舊版標準”）中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗，并結合《國家動物疫病監(jiān)測方案》要求進行，但舊版標準對某些內容闡述不清。2020年12 月14 日，國家市場監(jiān)督管理總局和國家標準化管理委員會聯(lián)合發(fā)布了新版《高致病性禽流感診斷技術》[5]（GB/T 18936—2020，以下簡稱“新版標準”），內容較舊版標準有所變化。本文中，筆者對新、舊版標準HA 和HI 試驗進行比較分析，以期為廣大獸醫(yī)實驗室檢測人員更好地理解新、舊版標準差異以及新版標準優(yōu)點，從而提高試驗結果準確性提供參考。

1 新舊版標準主要不同之處

1.1 新版標準HI 試驗增加了4 HAU 抗原配制的驗證內容

舊版標準HI 試驗3.2.2.1 中，只對4 HAU 抗原如何稀釋進行了闡述，但對如何驗證配制是否準確并沒有介紹。直接根據(jù)HA 試驗結果進行4 HAU 抗原配制，使HI 試驗結果存在一定不準確性。在新版標準發(fā)布之前，檢測人員通常根據(jù)試驗原理開展“回歸試驗”驗證4 HAU 抗原準確性。盡管“回歸試驗”能有效驗證4 HAU 抗原準確性，但舊版標準中并無明確闡述。

新版標準HI 試驗7.4.1 中，增加了對4 HAU抗原配制的驗證內容，而且要求對4 HAU 抗原進行系列稀釋，可根據(jù)檢測結果進行抗原效價調整，這大大提高了4 HAU 抗原配制的精確性和最終結果的準確性。根據(jù)新版標準7.4.1 示例“血凝的終點滴度為1:256（28或8log2）”，4 HAU 抗原系列稀釋度為1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 及1:7，這樣能很大程度地避免抗原效價落入29和210之間的配制困惑。如果配制的抗原液是4 HAU，則1:2、1:3、1:4 稀釋度會出現(xiàn)100%凝集，1:5、1:6、1:7稀釋度會出現(xiàn)淚珠樣流淌，因此1:4 稀釋度即為凝集終點。如果凝集終點沒有落在1:4 稀釋度，則代表配制的抗原液不是4 HAU。因為配制4 HAU抗原液體積比為1:64（256/4=64），如果凝集終點落入1:5 稀釋度，則血凝的終點滴度為1:320（64×5=320），配制4 HAU 抗原液體積比則應改為1:80（320/4=80）。

新版標準7.4.1 示例中給出了4 HAU 抗原配制和驗證的操作方法，但對剛接觸該試驗的實驗室操作人員來說比較抽象，難以理解。因此筆者所在實驗室相關人員對該試驗進行了實操分析，并對操作過程進行了通俗易懂的闡述。具體為：

第1 步：在96 孔V 型微量反應板第1 排第1孔加入0.020 mL PBS，第2～6 孔依次加入0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 mL PBS。

第2 步：在第1 排第1 孔加入4 HAU 抗原0.020 mL，第2～6 孔各加入4 HAU 抗原0.010 mL。

第3 步：從第1 排的第1～6 孔各吸取0.025 mL加至第2 排相應孔中，此時第2 排第1～6 孔抗原稀釋度依次為1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7。

第4 步：第2 排第1～6 孔加入0.025 mL PBS。

第5 步：第2 排第1～6 孔加入1%雞紅細胞懸液0.025 mL。

第6 步：室溫（約20 ℃）放置40 min 或4 ℃放置60 min，進行結果判定。

1.2 新版標準HI 試驗增加了鴨、鵝水禽血清預處理內容

某些禽類（尤其是水禽）血清，在HI 試驗中可能呈現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象。稀釋度低的孔出現(xiàn)凝集，而稀釋度高的孔出現(xiàn)淚珠樣流淌，和正常結果相反，從而干擾試驗人員對結果的判定。

針對禽類血清的非特異性凝集現(xiàn)象，新版標準7.4.3 提到了“鴨、鵝血清在檢測時建議進行預處理”，且專門在附錄C 里說明了血清非特異性凝集和非特異性抑制因子的處理方法。檢測人員可以參考附錄C.1 中處理方法對可能產(chǎn)生非特異性凝集的血清樣品進行預處理。

根據(jù)筆者多年開展HA 和HI 試驗操作的經(jīng)驗，并不是所有水禽血清都出現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象，試驗人員可以根據(jù)具體情況來確定是否需要對樣品進行預處理。當實驗室大批量檢測水禽血清樣品時，可以先按常規(guī)操作開展試驗，結果判定發(fā)現(xiàn)有非特異性凝集的，再單獨挑出相應血清樣品按照附錄C.1 方法進行處理，然后對該樣品重新進行HI 試驗；當實驗室檢測少量水禽血清樣品時，可以將所有樣品先做HA 試驗，如果待檢樣品出現(xiàn)紅細胞非特異性凝集現(xiàn)象，則說明樣品中有非特異性凝集因子存在，選取相應樣品再按照C.1 方法進行處理操作即可。

1.3 新版標準HI 試驗增加了“用于檢測抗體”的結果判定，并在“用于檢測抗原”方面，把HI效價1:16（24 或4log2）判定為陽性

新版標準HI試驗7.4.6結果判定中，增加了“用于檢測抗體”的結果判定，豐富了該標準HI 試驗的檢測用途，既可以檢測抗原，又可以檢測抗體。

舊版標準HI 試驗3.3 結果判定中，HI 效價為4log2 時判為可疑，需進行重復試驗。新版標準HI 試驗7.4.6 結果判定中，則改為HI 效價不低于4log2 時均判為陽性。相比舊版標準，新版標準省去了重復試驗，大大縮短了檢測時間。

此外，舊版標準3.3 結果判定中，HI 效價只用log2 來表示，而新版標準7.4.6 結果判定中HI效價可以用1:16、24、4log2 3 種方式來表示，更便于試驗結果記錄。

1.4 新版標準HA 試驗結果判定中，增加了對反應板傾斜角度的闡述

舊版標準HA 試驗3.2.1.7 結果判定中，僅描述為“將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌”。在新版標準發(fā)布之前，試驗人員往往通過個人習慣傾斜反應板以方便讀取結果。新版標準7.3.6 結果判定部分對反應板傾斜角度進行了明確闡述：“判定時，將反應板傾斜60°（此處原文為℃），觀察紅細胞有無淚珠狀流淌”。這可以使試驗人員有據(jù)可依，確保了結果判定的準確性。

2 新版標準存在的錯別字問題

新版標準HA 試驗7.3.6 結果判定中，有“判定時，將反應板傾斜60 ℃”的描述。錯將幾何單位的度（°）寫成了溫度單位的攝氏度（℃），建議修訂為“判定時，將反應板傾斜60°”。

3 小結

HA 和HI 試驗是目前我國對HPAI 免疫抗體評估的主要手段。整個試驗過程難度不大，但是步驟繁瑣，如果操作不規(guī)范，將會影響整體試驗結果。同時，新、舊版標準發(fā)布時間間隔長達17 年之久，在新版標準出臺之前，舊版HA、HI 試驗操作標準不能完全滿足實際檢測要求。HI 試驗中，4 HAU抗原配制和驗證是該試驗能否成立的關鍵所在，新版標準對4 HAU 抗原的配制驗證進行了補充，這提高了抗原配制的精確性，從而確保了最終結果的準確性。本文總結提煉了新版標準中4 HAU 抗原配制和驗證的操作方法，使得整個操作過程更為簡單易懂，便于試驗人員理解掌握。

此外，新版標準增加了鴨、鵝水禽血清的預處理，避免了HI 試驗中非特異性凝集現(xiàn)象的出現(xiàn)，確保結果更加準確；新版標準規(guī)定，HI 效價不低于4log2 時均可判為陽性，因而減少了重復試驗，提高了檢測效率；新版標準中HI 效價的表示形式更加多樣化，可以用1:16、24、4log2 3種方式來表示，在結果記錄時更加人性化。但是，新版標準7.3.6中錯將幾何單位的度（°）寫成溫度單位的攝氏度（℃），提示標準制定時應該更加嚴謹，注意細節(jié)，及時更正存在的不足之處。

新版標準的發(fā)布實施，使得HPAI HA、HI 試驗在操作步驟上更精準詳細，在結果判定上更科學準確，彌補了舊版標準存在的諸多不足。它使試驗人員更加有標準可依，有步驟可循，提高了試驗流程的規(guī)范性，為進一步指導HPAI 防控提供了技術支撐與標準依據(jù)。