新型兔出血癥病毒與經(jīng)典型病毒的差異

（長寧縣動物疫病預(yù)防控制中心，四川長寧 644300）

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由杯狀病毒科兔病毒屬的兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一類具有高度傳染性及急性致死性的烈性傳染病，被稱為養(yǎng)兔業(yè)頭號殺手，民間稱為兔瘟。1984 年我國在江蘇省用于商業(yè)配種的德國源安哥拉兔上首次發(fā)現(xiàn)RHD。RHD 以全身實(shí)質(zhì)器官高度敗血性為主要特征，死亡率可達(dá)100%，并于20 世紀(jì)末，在歐洲、非洲、亞洲等多個國家和地區(qū)暴發(fā)，給全球養(yǎng)兔業(yè)帶來巨大沖擊。2010 年，法國一家已免疫了RHD 疫苗的兔場暴發(fā)了非典型RHD，并從中分離得到一株新毒株[1]。該新毒株的基因序列及抗原性與經(jīng)典株有較大差異，兩者之間交叉免疫較弱，被命名為RHDV2（或RHDVb）。隨后該病毒在西班牙、英國（蘇格蘭）、意大利、澳大利亞等歐洲國家廣泛傳播，有替代經(jīng)典毒株的趨勢[2]。2020年4 月，我國四川省兩個家兔養(yǎng)殖場同時出現(xiàn)非典型癥狀的RHD。經(jīng)病原基因序列分析發(fā)現(xiàn)，引發(fā)疫情的病原與2010 年法國分離的RHDV2 處于同一進(jìn)化分支，最終診斷為我國首例新型RHD，并首次分離到RHDV2 毒株SC2020[3]。新型RHD 也具有較高發(fā)病率和致死率，且現(xiàn)有疫苗不能提供完全免疫保護(hù)，一旦發(fā)病嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展。因此，有必要了解新型與經(jīng)典型RHDV 病原學(xué)、流行病學(xué)以及診斷與防控方面的差異。

1 病原學(xué)特征

與杯狀病毒科其他屬成員相比，兔病毒屬病毒是基因組較小的未折疊單鏈RNA 病毒，病毒顆粒為包含有32 個杯狀凹陷的20 面體對稱結(jié)構(gòu)，大小為35～40 nm，包含有編碼衣殼蛋白VP1 和一些非結(jié)構(gòu)蛋白的ORF1 以及編碼VP2 的ORF2。

目前不同時間段分離得到的經(jīng)典RHDV 毒株之間基因差異較小[4]，根據(jù)其衣殼蛋白（VP60）差異，共分為G1 至G6 共6 個基因型，并具有明顯的流行時段性，其中G6 型為抗原變異株，又稱為RHDVa，是當(dāng)前的主要流行毒株[5]。

遺傳進(jìn)化分析[6]顯示，RHDV2 與經(jīng)典RHDV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（基因同源性為82.4%），且兩者的抗原表位存在明顯差異，大多數(shù)抗經(jīng)典RHDV單克隆抗體不能與RHDV2 抗原結(jié)合，在臨床癥狀及抗原性上，RHDV2 更靠近以歐洲褐色兔為宿主的歐洲褐色兔綜合征（European brown hare syndrome，EBHS）。有專家猜測，RHDV2 是由杯狀病毒兔病毒屬的其他病毒發(fā)生物種跳躍傳播到兔引起的，而非RHDV 進(jìn)化而來，兩者在易感動物、臨床癥狀、病原特性上均有差異，屬于不同的病毒分支[7]。

在易感動物上，經(jīng)典RHDV 主要感染成年家兔，對6～8 周齡兔感染性較低，對4 周齡以下的幼齡家兔不具備感染性；而RHDV2 可感染幼齡和成年家兔及歐洲野兔的Cape hares 品種，是該屬唯一一個可跨物種傳播的病毒，表現(xiàn)為對不同品種和年齡兔均易感。流行病學(xué)研究[7]發(fā)現(xiàn)，在2010 年10 月首例RHDV2 感染發(fā)現(xiàn)前，該病在同年4 月就已在法國其他兔場和野外發(fā)生，隨后迅速在法國及相鄰國家傳播，造成大量野生兔群和養(yǎng)殖場兔群發(fā)病死亡[6]。Fouchet 等[8]2008 年建立的數(shù)據(jù)模型表明，中等毒力的RHD 樣病毒（如RHDV2）在群體較為分散的野生兔子群體中致病性更高。仔兔對RHDV2 的高易感性，極大加劇了該病在兔群內(nèi)的傳播。研究[9-10]表明，RHDV2 不同毒株間的毒力存在明顯差異。經(jīng)典RHDV 可通過口腔、鼻腔、結(jié)膜和腸道傳播，也有通過食血昆蟲、帶毒鳥類傳播的相關(guān)報(bào)道。自然感染門戶主要是消化道和呼吸道，優(yōu)先通過糞便傳播，也可經(jīng)排泄物、分泌物或污染的飼料、飲水、籠子、設(shè)備等傳播[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)排毒的病兔是經(jīng)典RHDV 的主要傳染源，病毒粒子可在其血液、器官、皮膚甚至毛發(fā)中檢出，暴露在自然條件下的病兔尸體帶毒時間可長達(dá)3 個月。而RHDV2 在骨髓內(nèi)檢出[10]也證明了尸體可長時間持續(xù)帶毒，因此可作為流行病學(xué)追溯的采樣選擇。

2 引發(fā)的臨床癥狀及病理變化

在發(fā)病表現(xiàn)上，經(jīng)典RHD 常表現(xiàn)為急性癥狀，在流行初期常見無癥狀突然抽搐死亡，死亡率可達(dá)80%～100%，僅有5%～10%的病兔可表現(xiàn)為亞急性或慢性發(fā)?。ㄒ悦黠@肝損傷和脾大為特征），耐過病兔體內(nèi)可產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答，抗體水平較高可抵抗二次感染[13]。新型RHD 病癥以亞急性和慢性病癥為主，死亡率為50%～70%，部分急性病例死亡率較高，一般在發(fā)病3～4 d 內(nèi)死亡，部分感染動物可無任何臨床癥狀并可正常飼養(yǎng)（經(jīng)血清學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗體）[7]。新型RHD 伴有特別的皮下黃疸，肝臟大，呈灰白，以及脾臟大、小腸局灶性壞死等癥狀[7]，表現(xiàn)為EBHS 相似性。動物攻毒試驗(yàn)[7]發(fā)現(xiàn)：與經(jīng)典RHDV 相比，RHDV2感染病例病程持續(xù)時間更久。研究[13]發(fā)現(xiàn)：經(jīng)典RHDV 感染動物1 h 后可首先在肝臟檢出大量病毒復(fù)制，36～48 h 發(fā)病率達(dá)到頂峰，72～96 h 后大部分死亡。采取病死動物肝臟樣本，經(jīng)血凝試驗(yàn)檢測，在相同操作條件下，發(fā)現(xiàn)RHDV2 與經(jīng)典RHDV血凝效價(jià)相似[6]，說明兩種病毒致死動物的肝臟內(nèi)病毒含量相似。

3 致病機(jī)理

目前RHDV2 與經(jīng)典RHDV 都不能進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，因此關(guān)于其致病機(jī)理研究較少，主要以動物試驗(yàn)為主?，F(xiàn)已知杯狀病毒主要通過富含組織血型抗原（HBGA）受體的呼吸道和消化道上皮組織進(jìn)入宿主體內(nèi)。RHDV2 與經(jīng)典RHDV 基因序列相比較，有幾個衣殼序列區(qū)域出現(xiàn)了遺傳變異，表現(xiàn)為一定的抗原差異性，這可能是造成兩者對Cape hares 敏感性差異的原因。也可能表現(xiàn)為，在進(jìn)入途徑中與HBGA 的特異性結(jié)合差異[7，14]。經(jīng)典RHDV 首先攻擊肝臟組織[12]，大量增殖后經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肺臟、脾臟（特別是紅髓部分）等實(shí)質(zhì)器官，造成全身彌散性血管內(nèi)凝血（DIC，是主要致死原因）。目前經(jīng)典RHDV 對4 周齡以下幼兔不易感染的原理尚不清晰。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典RHDV 感染后只有少量病原能在肝臟細(xì)胞中被檢出，其他器官不能檢出或量低，猜想可能與仔兔肝臟中病毒組裝或傳遞受阻相關(guān)，也可能與仔兔自身病毒清理能力相關(guān)。Aleksija[10]等對成年和幼齡家兔進(jìn)行了RHDV2（澳大利亞毒株）攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明與經(jīng)典RHDV 一樣，RHDV2 最先攻擊肝臟并以肝臟病變最為明顯，不同的是幼兔表現(xiàn)出急性腎炎；隨后在不同年齡段的兔體肝臟、脾臟、骨髓、血清中檢測到大量抗原，腎臟體內(nèi)抗原檢出僅在未成年兔體內(nèi)，在淋巴及肺臟等微弱病變組織中未檢出病毒。該研究還發(fā)現(xiàn)，RHDV2 在幼齡及成年兔體內(nèi)均引起巨噬細(xì)胞、單核粒細(xì)胞等增多的嗜異性反應(yīng)，與經(jīng)典RHDV 入侵幼齡兔肝臟細(xì)胞引起的淋巴細(xì)胞增多不同（被認(rèn)為是機(jī)體清除病原的方式），這可能與RHDV2 可在幼體兔肝臟細(xì)胞內(nèi)復(fù)制有關(guān)，被認(rèn)為是兩者易感動物差異的主要原因。

4 檢測與疫苗研發(fā)

兩種病毒都能與人類O型血紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集，因此可參照我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《兔病毒性出血病血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法》（NY/T 572—2016）對疑似病例進(jìn)行初步篩選。但該法極易出現(xiàn)假陽性和假陰性，不可作為確診依據(jù)。目前已有關(guān)于經(jīng)典RHDV 的RT-PCR、巢式PCR、ELISA、熒光定量PCR、膠體金檢測卡等檢測手段的報(bào)道[16]，但這些方法能否用于RHDV2 檢測還待進(jìn)一步確認(rèn)。目前江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院對我國首株RHDV2 的VP60基因進(jìn)行了擴(kuò)增和測序[3]，并建立起兩者的RTPCR 鑒定方法[17]，可用于實(shí)驗(yàn)室區(qū)分鑒定。

目前注射疫苗是防控該病的最有效手段。已有多種針對經(jīng)典RHDV 的商品疫苗，也有相關(guān)DNA 基因疫苗報(bào)道[18]。受研究進(jìn)度所限，RHDV2商品疫苗研究相對滯后，但各國研究人員都在加快研發(fā)進(jìn)程。Montbrau 等[19]2016 年報(bào)道了關(guān)于RHDV2 滅活疫苗ERAVAC 的安全有效性。德國科學(xué)家Schinkthe[20]等2019 年報(bào)道了基于桿狀病毒重組載體RHDV2-VP1 疫苗。該疫苗能同時產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，在免疫后7 d 可檢測出體內(nèi)抗體并于14 d 達(dá)到有效免疫效價(jià)。我國已有RHDV2 單克隆抗體相關(guān)制備的研究[21]，并成功構(gòu)建了RHDV2 與經(jīng)典RHDV 的病毒樣顆粒[22]。這為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)，但關(guān)于我國本土毒株SC2020 的研究仍需加快。

5 結(jié)語

新型RHD 已在多個國家和地區(qū)暴發(fā)，其控制難度和危害遠(yuǎn)高于經(jīng)典RHD，一旦發(fā)生疫情將迅速在群體內(nèi)傳播，且定殖后清除難度較大，從而對肉兔、兔毛、寵物兔產(chǎn)業(yè)造成巨大沖擊。我國已有新型RHDV 的相關(guān)報(bào)道，因其與經(jīng)典RHDV 之間免疫交叉性較弱，免疫預(yù)防上存在較大空白，所以下一步應(yīng)針對本土毒株加大結(jié)構(gòu)功能研究，加快疫苗開發(fā)，做好可疑病例處置和流行病學(xué)研究，及時掌握我國疫情狀態(tài)。目前人類對杯狀病毒的認(rèn)識尚不清晰，缺乏有效的小動物和細(xì)胞培養(yǎng)模型，因此通過不同宿主來源的病毒研究，有利于豐富和了解杯狀病毒的致病機(jī)制。目前RHD 已被科學(xué)家提議作為人類急性暴發(fā)性肝病的疾病模型[23]，通過對RHD 中細(xì)胞死亡機(jī)制的持續(xù)研究，可能為不同物種中更廣泛的肝病發(fā)病機(jī)制研究提供參考。