非洲豬瘟病毒細胞傳代致弱株研究進展

戈勝強，張瀟月，呂 艷，王振忠，韓乃君，張永強，錢鶯娟，蔡玉梅，吳曉東，王志亮

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032；2.山東農(nóng)業(yè)大學，山東泰安 271001；3.南京農(nóng)業(yè)大學，教育部動物健康與食品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇南京 210095）

自1921年報道以后，在很長一段時間里非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）一直在非洲流行，并沒有引起大多數(shù)國家，特別是主要豬肉生產(chǎn)國的重視，直到1957年ASFV傳入葡萄牙、1960年傳入西班牙后才引起國際廣泛關(guān)注。1957年，葡萄牙因ASFV傳入導致?lián)p失17 000頭豬后才開始研究ASFV，發(fā)現(xiàn)ASFV感染的紅細胞吸附現(xiàn)象和ASFV可以在細胞上繁殖傳代[1-3]。早期研究就已發(fā)現(xiàn)，分離強毒株在細胞上連續(xù)傳代后再次接種豬不再出現(xiàn)典型的臨床癥狀，而且這些豬可以經(jīng)受住同源強毒株的攻擊[3]。但后期的一些研究卻發(fā)現(xiàn)，某些毒株在傳代細胞系連續(xù)傳代后雖然毒力減弱，卻不能提供同源保護[4]。同時，不同ASFV在不同細胞上的適應(yīng)性傳代結(jié)果并不相同。面對上述進展，國內(nèi)尚無專業(yè)材料進行論述，因此本文將對國際上ASFV細胞傳代致弱毒株相關(guān)研究進行整理，分析其傳代致弱規(guī)律，從而為我國ASFV細胞適應(yīng)株研究及新型疫苗研制提供參考。

1 細胞傳代致弱株研究歷程

自1957年ASFV傳入葡萄牙后，就在西歐逐步擴散蔓延并傳至南美洲。因流行毒株只有基因I型，早期研究主要使用基因I型毒株進行細胞適應(yīng)研究，代表適應(yīng)株如L'60BM89、BA71v、E75CV1等。ASFV細胞適應(yīng)株研究最早開始于20世紀60年代，首先研究的母本毒株主要有Lisbon 60毒株（1960年分離自葡萄牙里斯本發(fā)病家豬）、葡萄牙分離株1455（1961年分離自葡萄牙）和Hinde毒株（分離自肯尼亞）。1961年，Ribeiro等將Lisbon 60毒株在骨髓細胞傳代89代后（L'60BM89[3]），又在Vero細胞上繼續(xù)傳代15代[5]，證明ASFV可在傳代細胞系繁殖。1963年，Ribeiro等[6]又將葡萄牙1455毒株在骨髓細胞上連續(xù)傳代并發(fā)現(xiàn)其毒力逐漸致弱。葡萄牙1455毒株傳代至40代后接種動物仍可導致典型的臨床癥狀，當傳代至70代時，臨床癥狀大大減輕并能抵御強毒株攻擊[7]。

1962年，Malmquist等將Hinde毒株（分離自肯尼亞）在豬腎細胞（PK-2a）上傳代，當傳至75代或更高代次后（90、103和104代），發(fā)現(xiàn)傳代毒株接種豬完全存活[2]；使用90代毒株免疫豬后再使用親本強毒株接種（105TCID50），發(fā)現(xiàn)接種豬均死亡，但先使用103代毒株免疫再使用50代毒株免疫的接種豬能抵御親本強毒株攻擊[8]，證明細胞傳代致弱毒株可以產(chǎn)生部分保護力。1963年Botija[9]將5株西班牙分離株在PK-2a細胞和白細胞上連續(xù)傳代，也發(fā)現(xiàn)毒力減弱，其中一株毒株在傳至60代以后對豬無任何致病力。1965年Hess等也利用PK-2a細胞傳代致弱多株ASFV[10]，1974年利用幼倉鼠腎細胞（baby hamster kidney cells，BHK21）傳代致弱Tengani毒株[11]。

1967年，Bannister等[12]使用葡萄牙疫苗候選株進行動物試驗。該毒株以Lisbon 60毒株為母本，在豬骨髓細胞上繼續(xù)傳至81代所得。疫苗株接種1頭豬后（114號），將第3天體溫反應(yīng)最大時采集的肝素抗凝血肌肉注射另外4頭健康豬（115、116、117和118號），結(jié)果未出現(xiàn)體溫升高和臨床反應(yīng)。接種后第71天，4頭豬飼喂含有葡萄牙強毒株的血液和組織，進行口腔感染試驗（第1次攻毒），4頭豬均未出現(xiàn)體溫升高和臨床反應(yīng)。為進一步驗證疫苗效果，對其中的2頭豬（115和117號）在第87天時（飼喂強毒后第16天），進行第二次攻毒試驗（肌肉注射3 mL強毒血液），結(jié)果115和117號豬初期均未出現(xiàn)體溫升高和臨床反應(yīng)，但115號豬在第108天后（第2次攻毒后第22天）開始出現(xiàn)4輪溫度上下波動隨后逐漸升溫，直至按計劃撲殺時達到最高溫度（41.3 ℃）。同年，Greig等[13]對Spencer株（1951年分離自南非約翰內(nèi)斯堡）、Portuguese challenge株（分離自葡萄牙）、Gasson株（1950年分離自肯尼亞）進行細胞連續(xù)傳代并使用親本毒株攻毒驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Spencer株傳至35代后，接種豬無臨床癥狀且能保護接種豬免受親本毒株攻擊；Portuguese challenge株傳至34代后，接種豬出現(xiàn)體溫小幅波動且能為接種豬提供針對親本毒株的保護；Gasson株傳至23代后，接種豬毒力減弱但不能保護接種豬免受親本毒株攻擊（接種2頭豬，其中1頭死亡，1頭升溫后恢復(fù)正常但未能抵抗親本毒株攻擊）。

1968年，Stone等[14]利用致弱的Lisbon 60毒株肌肉注射免疫22頭豬（接種劑量每頭105TCID50/mL）并于免疫后第117天進行同源毒株攻毒試驗（使用Lisbon 60攻毒發(fā)病豬脾臟勻漿液，稀釋至104LD50）。所有免疫豬健康存活，但隨后攻毒的18頭豬中有17頭豬出現(xiàn)體溫反應(yīng)，其中4頭死亡；攻毒后第23天撲殺存活的14只豬，制備肺臟和脾臟混合勻漿液并繼續(xù)接種2頭健康非免疫豬，結(jié)果2頭豬均死亡。同年，Coggins等將肯尼亞強毒株（Hinde WH II virus）[15]和烏干達強毒株（Uganda ASF virus）[16]在細胞上連續(xù)稀釋傳代，發(fā)現(xiàn)部分毒株的紅細胞吸附功能丟失，但繼續(xù)更換到豬體內(nèi)傳代，可能會重新獲得紅細胞吸附功能。無紅細胞吸附功能的毒株毒力減弱，接種豬后大部分豬存活并能抵御強毒株攻擊。

從1976年開始，有研究人員將BA71株（1971年分離自西班牙巴達霍斯省一發(fā)病豬脾臟，已在豬骨髓細胞傳代36代）在Vero細胞上適應(yīng)傳代100代，最終獲得無致病力的Vero細胞適應(yīng)株（BA71v）[17-19]。1979年，Thomson等[20]使用致弱的CV毒株（1962年分離自南非，在細胞上連續(xù)傳44代致弱）接種2頭豬，發(fā)現(xiàn)使用強毒株攻毒后不能產(chǎn)生足夠的保護力。俄羅斯國家獸醫(yī)病毒學和微生物學研究所（National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology，VNIIVViM）也制備了多株細胞傳代致弱株，如剛果KK-262株（將剛果1949年分離株在豬腎細胞傳至 50代后再在豬骨髓細胞傳262代）和法國FK-32/135株（將法國1964年分離株在豬骨髓細胞上傳135代）[21-22]等。但上述毒株未進行免疫接種及攻毒保護試驗。

1981年，Ruiz-Gonzalvo等[23]將E75強毒株（1975年分離自西班牙）在猴腎成纖維細胞（CV1）上連續(xù)傳4代，獲得E75CV1毒株（也稱258-CV1-4），將其接種25頭家豬后發(fā)現(xiàn)有20頭豬存活，且能部分抵御同源強毒株的攻擊。后期研究使用類似策略對E70強毒株（1970年分離自西班牙）進行了更多代次傳代，如MS14和MS44（在猴腎細胞分別傳14代[24]和44代[24-25]），但其主要目的是將該毒株用于基因組比對分析[26]或作為代表毒株進行毒力基因研究。2015年對E75CV1進行更深入研究時發(fā)現(xiàn)，該毒株以105和102HAU50劑量肌肉注射接種家豬出現(xiàn)部分死亡，以104HAU50接種卻能全部存活且能抵御同源毒株攻擊[27]。

2007年ASFV傳入格魯吉亞并相繼傳入俄羅斯、羅馬尼亞、德國等東歐、中歐國家后，該病毒研究方向開始向基因II型毒株傾斜。2015年，Krug等[4]將格魯吉亞毒株（ASFV-G）Vero細胞適應(yīng)株第30代、60代、80代和110代傳代毒株進行全基因序列分析和攻毒保護試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Vero細胞適應(yīng)株全基因組序列在左臂和右臂特定位置發(fā)生了漸進性丟失，各代次毒株以104HAD50劑量接種易感豬后，第110代毒已無任何臨床反應(yīng)，但攻毒后無法提供有效保護。

2015年Balysheva等[28]將Stavropol 01/08強毒株在豬腎胚胎細胞系與豬淋巴細胞混合細胞系上（the hybrid cell line SPEV TK with pig lymphocytes，A4C2）傳14代、24代和33代，在CV細胞和豬腎細胞（PSGK-60）上分別傳20代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A4C2/9k細胞的14代毒和PSGK-60細胞的20代毒均表現(xiàn)強毒特性，接種豬全部死亡。A4C2/9k細胞的24代、33代毒和CV細胞的20代毒毒力減弱，接毒豬全部存活，但無法保護豬免于強毒株攻擊。

2020年，俄羅斯聯(lián)邦病毒學和微生物學研究中心（原全俄獸醫(yī)病毒學與微生物學研究所）Alexey等[29]將其實驗室研制的弱毒株按照血清群分類進行了詳細比對分析。這些弱毒株絕大多數(shù)通過細胞傳代致弱（主要是豬骨髓細胞），如血清I型的LK-111株、Katanga-350株，血清II型的KK-202株，血清III型的MK-200株，血清IV型的FK-32/135株，血清V型的TSP-80/300株，血清VI型的TS-7/230株，血清VII型的UK-50株和血清VIII型的RK-30株。這些毒株均已致弱并可對強毒株攻擊提供不同水平的免疫保護。

ASFV細胞傳代致弱株是疫苗研究歷史中的重要組成部分，也是未來有望推向市場的候選方向之一。如歐盟正在主導實施疫苗研制計劃（Vacdiva project），將俄羅斯研制的傳代細胞適應(yīng)弱毒株（Arriah CV-1株）作為未來重點研究的3個疫苗候選株之一[30]。此外，經(jīng)過大量比對試驗驗證，俄羅斯聯(lián)邦病毒學和微生物學研究中心挑選出的FK-32/135株也具有較好的研究潛質(zhì)，但仍需對其接種途徑進一步研究探索（模擬自然感染途徑）[29]。

2 細胞傳代致弱株研究意義

在ASFV傳播的100年中，很多國家曾經(jīng)借助嚴格的生物安全防控措施成功凈化了ASFV。但是ASFV具有致死率高，低溫環(huán)境抵抗力強，可借助冷凍豬肉制品、泔水和軟蜱傳播等特點，使得該病的疫苗使用需求高于其他疫病。2017年，歐盟發(fā)布ASFV疫苗可行性發(fā)展線路圖，仍將研制ASFV疫苗放到了控制和根除ASFV的重要位置[31]。早期ASFV弱毒株研制主要通過細胞傳代方式致弱，如BA71v，E75CV1等。但增加傳代次數(shù)會導致ASFV毒力降低，難以提供對親本毒株的攻毒保護，因而很難找到合適的傳代次數(shù)進行后續(xù)動物試驗，具有一定的盲目性和隨機性，更無法預(yù)判攻毒保護效果。因此，相較于減毒疫苗株制備，細胞傳代致弱株/適應(yīng)株在其他方向，如滴度測定方法建立[17]、基因組功能研究[26，32]和致病機理研究[33]等方向發(fā)揮的作用可能更大。特別在全基因組比對分析研究中，通過細胞傳代致弱株丟失基因的區(qū)域分析，對于基因敲除弱毒疫苗研究具有很好的指導借鑒作用。如，格魯吉亞株（ASFV-G）在Vero細胞上連續(xù)傳至60代后，其I177L基因編碼氨基酸序列發(fā)生了1個點突變（第42位由脯氨酸變?yōu)榻z氨酸）[4]，這可能為后期I177L基因缺失株[34]研制提供了一定線索。同時，20世紀60年代在西班牙和葡萄牙大范圍使用弱毒疫苗（在豬骨髓細胞上連續(xù)傳代所得）導致的“免疫失敗事件”，使得科學家認識到接種豬本身的免疫機能狀態(tài)會影響弱毒苗效果。如，無紅細胞吸附活性的Kc-160株，以107.5TCID50的劑量接種健康家豬，會有75%～80%的豬出現(xiàn)輕微或中等臨床反應(yīng)，但接種免疫機能降低的豬會發(fā)生20%的死亡[29]。

因ASFV一般不適應(yīng)在傳代細胞系中繁殖，所以傳統(tǒng)的細胞傳代致弱株在傳代細胞系連續(xù)傳代之前都需要進行一定的馴化，這也在一定程度上限制了弱毒疫苗株進行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。但近期有多篇報道稱找到了支持ASFV高效復(fù)制的傳代細胞系，如A4C2/9K[35]、WSL[36]（野豬肺細胞）、MA104（猴腎細胞）[37]、ZMAC-4（胎豬肺巨噬細胞）[38]和IPKM（豬腎巨噬細胞）[39]等。這些細胞系都在一定程度上滿足了ASFV連續(xù)傳代的科研目的，但連續(xù)傳代后是否像其他細胞系一樣發(fā)生基因丟失或免疫原性改變等，仍需大量試驗驗證和探討。