牛角膜渾濁和滲透性試驗方法結(jié)合組織病理學(xué)對化妝品眼刺激性的預(yù)測價值

謝 珍 陳舒懷 劉 璐 何立成 朱社敏 匡榮

浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052

日常生活中，人們的眼睛偶爾會暴露于化妝品，如沐浴露及染發(fā)類產(chǎn)品等。因此，化妝品引起的潛在眼刺激性的評估對于確保產(chǎn)品安全是至關(guān)重要的[1-2]。近年來，許多發(fā)達(dá)國家已經(jīng)立法，以禁止動物試驗并推廣替代技術(shù)。全球目前有近40 個國家/地區(qū)已經(jīng)正式實施了化妝品動物試驗禁令，還有數(shù)十個國家正在立法的過程中，這些法規(guī)的變化對全球化妝品的產(chǎn)品研發(fā)、安全風(fēng)險評估、立法監(jiān)督和國際貿(mào)易均產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[3-5]。而國內(nèi)的化妝品安全性評價法規(guī)還是依據(jù)動物實驗為主，依據(jù)2015 版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[6]中“急性眼刺激性/腐蝕性”項下規(guī)定，結(jié)合本實驗室多年的化妝品檢測經(jīng)驗，沐浴露、染發(fā)類化妝品的眼刺激反應(yīng)等級多為無刺激性、微刺激性至輕刺激性，加之傳統(tǒng)的Draize 試驗存在較多缺陷[7]，有必要尋找合適的體外測試方法。

牛角膜渾濁和滲透性（bovine corneal opacity and permeability，BCOP）試驗是經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（OECD）認(rèn)可的眼刺激試驗的替代方法之一，可對無刺激性（不分類）和嚴(yán)重刺激性（1 類）的物質(zhì)進行準(zhǔn)確分類[8]，但對弱到中等刺激程度（2B 和2A 類）的樣品不能完全準(zhǔn)確判斷[9]。到目前為止，沒有單一的體外替代方法能夠完全代替Draize 試驗[10]。角膜的組織病理學(xué)評估可作為BCOP 測試的附加參數(shù)，提供病變類型和損傷深度這些重要的補充信息[11]。盡管OECD TG 437[12]中尚未將角膜的組織病理學(xué)評估納入其中，但OECD 已發(fā)布了相關(guān)指導(dǎo)文件以促進這一評估的應(yīng)用[13]。已有學(xué)者[14]將其與牛角膜的組織學(xué)觀察相結(jié)合建立預(yù)測模型，包括上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮3 層結(jié)構(gòu)，來對化學(xué)品的眼刺激性進行評估。本研究將BCOP 測得的結(jié)果與每種受試物對應(yīng)的角膜上皮的相應(yīng)組織病理學(xué)檢查結(jié)果進行比較，包括市售的沐浴露及染發(fā)劑，將角膜上皮的病變損傷分級與體外刺激評分值（IVIS）及Draize試驗的體內(nèi)數(shù)據(jù)相結(jié)合，建立化妝品眼刺激性的預(yù)測模型，為化妝品的安全評估提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛眼球 牛眼球來源于浙江省富陽市九鮮肉牛定點屠宰場。試驗前日晚由屠宰場受訓(xùn)人員于牛死亡后立即摘除眼球放入HBSS 溶液中，置運輸冷藏箱中運至實驗室。

1.1.2 實驗動物 普通級新西蘭家兔，購于浙江省桐鄉(xiāng)市銀海牧業(yè)專業(yè)合作社，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2018-0002，動物質(zhì)量合格證號：No.1907170115，體重：1.9～2.6 kg，雌雄皆用。動物飼養(yǎng)于浙江省食品藥品檢驗研究院實驗動物中心，實驗動物房使用許可證號：SYXK（浙）2016-0009。動物飼料由江蘇協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：蘇飼證（2019）01008。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25℃，相對濕度40%～70%。實驗動物試驗前在動物房適應(yīng)環(huán)境至少3 d。動物實驗方法經(jīng)浙江省食品藥品檢驗研究院動物福利和倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.1.3 試劑與儀器 MEM 培養(yǎng)液（2053121）、MEM 培養(yǎng)液（含酚紅，2048092）、HBSS 緩沖液（1897082）購于美國gibco 公司；熒光素鈉（20170426）、無水乙醇（20190618）購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

CTHI-150B 型恒溫恒濕箱[施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]；OPACITOMETER 混濁度儀（德國DURATEC Analysentechnik GmbH）；MAX190 型紫外可見連續(xù)光譜酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices Corporation）。ST5010 自動載玻片染色機、EG1150 包埋機、HI1220 烘片機、RM2235 切片機、DM4000BLED 顯微鏡（德國徠卡公司）。

1.2 方法

1.2.1 Draize 試驗法 參照2015 版《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》[6]“急性眼刺激性/腐蝕性”項下所示方法。每個樣品取沒有眼病的健康家兔3 只，染發(fā)劑類（#1、#2、#3、#4、#5）樣品按說明書進行配制，沐浴露類（#1、#2、#3、#4）樣品使用原液，將0.1 mL 的樣品加入一側(cè)結(jié)膜囊中，眼閉合1 s，至第4 秒（染發(fā)劑類）/第30 秒（沐浴露類）時用足量、流速較快但又不會引起動物眼損傷的水流沖洗30 s，另側(cè)眼睛不處理作自身對照，按要求對動物眼睛進行檢查并判定受試物對眼的刺激強度。

1.2.2 BCOP 試驗法 試驗方法按照OECD TG 437[12]，將分離的角膜安裝在角膜固定器中，平衡后測量初始濁度值，每個樣品平行3 個角膜，陰性對照為純化水，陽性對照為無水乙醇。分組后將角膜暴露于受試物中，染發(fā)類產(chǎn)品依據(jù)樣品說明書現(xiàn)配現(xiàn)用，其余受試物使用原液。孵育結(jié)束后讀取終末濁度值。加入熒光素鈉溶液孵育后在490 nm 波長處讀取后室液體的吸光度值并計算IVIS。IVIS≤3，無刺激性（GSH 不分類）；3＜IVIS≤55，輕微到中等刺激（GSH 為2A 或2B 類）；IVIS＞55，嚴(yán)重刺激（GSH 為1 類）。

1.2.3 組織制片及分析方法 測試結(jié)束后取下角膜，置于10%的中性福爾馬林溶液中固定，取材部位為角膜中間區(qū)域，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，角膜橫切面進行切片，厚度4 μm，使用蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，用光學(xué)顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞，基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的組織病理學(xué)變化并拍照。角膜上皮的病變分級評分（H）標(biāo)準(zhǔn)如下：0 表示不值得注意；1 表示輕微；2 表示輕度；3 表示中度；4 表示嚴(yán)重。刺激分級根據(jù)角膜的病變部位：鱗狀細(xì)胞（輕微），鱗狀細(xì)胞至上翼狀細(xì)胞（輕度），鱗狀細(xì)胞至翼狀細(xì)胞下層（中度），基底細(xì)胞（嚴(yán)重）。

2 結(jié)果

2.1 受試物眼刺激性試驗結(jié)果

依據(jù)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)，眼刺激性檢驗結(jié)果均合格，BCOP結(jié)合H 分類結(jié)果與Draize 試驗結(jié)果一致。見表1。

表1 受試物眼刺激性結(jié)果（n=3）

2.2 角膜組織病理學(xué)變化

暴露于不同受試物的角膜的具體組織學(xué)變化情況見圖1。（1）陰性對照：角膜3 層結(jié)構(gòu)完整，最外層細(xì)胞由于生命周期的原因可見輕微脫落,H 值為0，見圖1A。（2）陽性對照：上皮表層鱗狀細(xì)胞凝固，翼狀細(xì)胞和基底細(xì)胞顯示出明顯的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核空泡化，在基質(zhì)的上半部分觀察到松散的膠原束和角膜細(xì)胞的腫脹，內(nèi)皮完整，H 為4 分，見圖1B。（3）組織病理學(xué)評分較低（輕微），病變僅限于鱗狀細(xì)胞層，H 值為1：①沐浴露#1：最外層的鱗狀細(xì)胞可見輕微腫脹和脫落。其余未見明顯病理變化。內(nèi)皮完整，見圖1C。②沐浴露#4：鱗狀細(xì)胞表現(xiàn)出連續(xù)的水腫及腫脹，可觀察到細(xì)胞核融合及腫脹。內(nèi)部鱗狀細(xì)胞層未顯示出明顯的病理變化，維持了角膜上皮的分層結(jié)構(gòu)。角膜基質(zhì)無變化。內(nèi)皮完整，見圖1D。③染發(fā)劑#1：最外層的鱗狀細(xì)胞可見輕微脫落。其余未見明顯病理變化。內(nèi)皮完整，見圖1E。（4）組織病理學(xué)評分仍較低（輕度），且病變局限于鱗狀細(xì)胞和上翼狀細(xì)胞層，H值為2：①沐浴露#3：鱗狀細(xì)胞層部分缺失，細(xì)胞質(zhì)的空泡化延伸至翼狀細(xì)胞層表層細(xì)胞。角膜基質(zhì)無變化。內(nèi)皮完整，見圖1F。②染發(fā)劑#4：鱗狀細(xì)胞呈圓形或橢圓形。在上翼狀細(xì)胞層中可觀察到細(xì)胞質(zhì)的空泡化。與病變部位直接接觸的翼狀細(xì)胞表現(xiàn)出核凝結(jié)。其余未觀察到明顯變化。內(nèi)皮完整，見圖1G。③染發(fā)劑#5：鱗狀細(xì)胞層完全缺失，在上翼狀細(xì)胞層中可觀察到細(xì)胞腫脹。其余未觀察到明顯變化。內(nèi)皮完整，見圖1H。（5）組織病理學(xué)評分為中度，病變位于鱗狀細(xì)胞層至上、下翼狀細(xì)胞層，或嚴(yán)重至延伸到基底細(xì)胞，H 值為3 或4：①染發(fā)劑#2：整個鱗狀細(xì)胞層及表層翼狀細(xì)胞缺失，其余翼狀細(xì)胞可見顯著的細(xì)胞質(zhì)空泡化?；准?xì)胞保持完整。角膜基質(zhì)無變化。內(nèi)皮完整，見圖1I。②沐浴露#2：鱗狀和上翼狀細(xì)胞層缺失，深層翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞仍存在，在向基底細(xì)胞過渡區(qū)域的翼狀細(xì)胞周圍存在小空泡。角膜基質(zhì)無變化。內(nèi)皮完整，見圖1J。③染發(fā)劑#3：整個鱗狀細(xì)胞層缺失及剩余細(xì)胞之間的粘附喪失，連接斷裂。上翼狀細(xì)胞層腫脹明顯，呈圓形或橢圓形，深層翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞仍存在，均顯示出更廣泛的細(xì)胞質(zhì)空泡化和腫脹（細(xì)胞之間空隙清晰）。角膜基質(zhì)無變化。內(nèi)皮完整，見圖1K。

圖1 角膜組織病理學(xué)變化（HE 染色）

2.3 BCOP 結(jié)合角膜上皮組織學(xué)變化預(yù)測化妝品眼刺激性的分級標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)表1 和圖1，建立IVIS 結(jié)合角膜上皮病變評分的眼刺激性等級的預(yù)測模型，見表2。如果IVIS≤3，且H=0，則判定為無刺激性；如果IVIS≤6，且H≤1，則判定為微刺激性；如果6＜IVIS＜25，且角膜基質(zhì)及內(nèi)皮無異常，則判定為輕刺激性。

表2 BCOP 結(jié)合角膜上皮組織學(xué)變化預(yù)測化妝品眼刺激性的分級標(biāo)準(zhǔn)

3 討論

BCOP 測試由渾濁度和熒光素鈉通透性這兩個主要終點組成，來間接量化由測試物質(zhì)引起的對角膜的損傷。渾濁度受角膜上皮蛋白質(zhì)的沉淀或變性的影響。角膜上皮由從前到后由3 層組成：鱗狀細(xì)胞層、翼狀細(xì)胞層和基底細(xì)胞層，上皮細(xì)胞起源于基底細(xì)胞并分化成為翼細(xì)胞，然后分化成鱗狀細(xì)胞。角膜上皮在成人中大約每7 天會更新?lián)Q代1 次。眼部創(chuàng)傷后上皮細(xì)胞有絲分裂活躍[15-17]。此外，上皮細(xì)胞具有細(xì)胞間連接，例如緊密連接和黏附連接，其中緊密連接是角膜最頂端的結(jié)構(gòu)，可消除細(xì)胞間隙以提供滲透性屏障。細(xì)胞間連接的破壞，如上皮層細(xì)胞變性、壞死或缺失，會增加上皮的通透性，進而顯著影響物質(zhì)的眼刺激性潛力[18]。同時，物質(zhì)對角膜上皮的細(xì)胞毒性是其作用的重要方式[19]，加之BCOP 方法對弱到中等刺激程度的樣品不能準(zhǔn)確判斷。作為BCOP 測定的補充參數(shù)，病理組織學(xué)分析可確定角膜病變的深度及程度[20]。因此，角膜上皮的組織病理學(xué)評估可為眼刺激性分類提供更可靠的依據(jù)。

文中展示了9 種市售沐浴露和染發(fā)劑在BCOP測定中所觀察到的組織病理學(xué)特征，結(jié)果顯示組織，病理學(xué)結(jié)果與測試物質(zhì)的IVIS 相當(dāng)。IVIS 越大，物質(zhì)損傷角膜的深度越深，組織學(xué)評分的分值越大[21]，提示角膜上皮的組織病理學(xué)特征為化妝品體外眼刺激性分類為無刺激性至輕刺激性提供更好的佐證。依據(jù)受試物的IVIS、角膜上皮組織學(xué)特征及Draize 試驗結(jié)果，本文建立了IVIS 結(jié)合角膜上皮組織學(xué)的預(yù)測模型來評估化妝品的眼刺激性，本研究將微刺激性和輕刺激性的IVIS 臨界值定為6，這與已有的文獻(xiàn)報道[22]一致，認(rèn)為IVIS≤6 的物質(zhì)引起的組織病理學(xué)變化僅限于鱗狀細(xì)胞層，且可迅速恢復(fù)。此外，即如果IVIS≤3，且H=0，則判定為無刺激性；如果IVIS≤6，且H=1，則判定為微刺激性；如果6＜IVIS＜25，且角膜基質(zhì)及內(nèi)皮無異常，則判定為輕刺激性。結(jié)合實驗室多年的化妝品檢測經(jīng)驗，沐浴露、染發(fā)類化妝品的眼刺激反應(yīng)等級多為無刺激性、微刺激性至輕刺激性，極少為中刺激性，未見腐蝕性[23]，依據(jù)文中9 種受試物的有限數(shù)據(jù)，該預(yù)測模型目前未把中刺激性和腐蝕性納入其中，雖尚未覆蓋全部刺激譜，但可將微刺激性和輕刺激性進行區(qū)分，滿足日?；瘖y品眼刺激性的評估工作?？傊Y(jié)合角膜上皮組織病理學(xué)評分的BCOP 法可作為微刺激性或輕刺激性分類的依據(jù)，適用于化妝品眼刺激性的檢測。