食管鱗癌細(xì)胞外泌體中miR-130a對(duì)血管新生的作用及其機(jī)制

鄭森元 劉芳 赫曉磊 張志強(qiáng)

作者單位：830054 烏魯木齊 1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化病二科；2新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院老年病科

食管鱗癌是食管癌最常見的分型，因臨床癥狀不明顯且缺乏早期診斷標(biāo)志物，大部分患者確診時(shí)往往已處于中晚期，即使術(shù)后患者預(yù)后也仍較差，5年生存率低于20%［1-4］。因此，探索食管鱗癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找新型有效的診斷和治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。外泌體是一類由多種活細(xì)胞分泌的納米級(jí)囊泡，穩(wěn)定存在于體液中，可發(fā)揮細(xì)胞間信息傳遞的作用［5-6］，其中腫瘤細(xì)胞外泌體可在腫瘤微環(huán)境中調(diào)控免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞而影響腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、血管新生等［7-8］。多種外泌體miRNA已被報(bào)道能夠通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能而影響血管新生［9］，其中miR-130a可調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管形成能力，且已有研究指出外泌體中miR-130a可調(diào)控胃癌血管新生［10］，然而其在食管鱗癌中的研究尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)差速離心法提取食管鱗癌細(xì)胞的外泌體并探討外泌體中的miR-130a在血管新生中的作用及機(jī)制，以期為食管鱗癌診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

食管鱗癌細(xì)胞TE-13和Eca-109，食管上皮細(xì)胞HEEC，人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；HiPerFect Transfection Reagent購(gòu)自QIAZEN公司；miRNA cDNA合成試劑盒、EvaGreen miRNA qPCR MasterMix購(gòu)自加拿大Abm公司；Matrigel膠、Transwell小室購(gòu)自福麥斯生物技術(shù)有限公司；CD9、CD63、TSG101抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH、山羊抗兔二抗購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物技術(shù)有限公司；miR-130a mimic、miR-130a inhibitor及其陰性對(duì)照（NC）均購(gòu)自漢恒生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

TE-13細(xì)胞、Eca-109細(xì)胞和HEEC細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的ECM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca-109細(xì)胞接種于24孔板（1.6×105/孔）中，按照 HiPerFect Trasfection Reagent說(shuō)明書操作步驟分別轉(zhuǎn)染miR-130a mimic、miR-130a inhibitor及NC，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換新的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，備用。

1.3 外泌體的提取與鑒定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEEC、TE-13和Eca-109細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染 miR-130a mimic、miR-130a inhibitor和 NC的Eca-109細(xì)胞分別接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基更換為含10%無(wú)外泌體胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，48 h后收集上清液，根據(jù)差速離心法提取各組細(xì)胞的外泌體（即HEEC exo、TE-13 exo、Eca-109 exo、Eca-109/miR-130a mimic exo、Eca-109/miR-130a inhibitor exo、Eca-109/miR-130a NC exo），于-80℃冰箱保存。在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，Western blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101的表達(dá)情況。

1.4 MTT法檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的增殖能力

將HUVEC細(xì)胞接種至96孔板（1×104/孔），待細(xì)胞貼壁后，分別加入含10 μg/mL的HEEC exo、TE-13 exo和Eca-109 exo及等體積PBS（或Eca-109/miR-130a mimic exo、Eca-109/miR-130a inhibitor exo、Eca-109/miR-130a NC exo）的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h向每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，孵育4 h后，每孔加入150 μL 二甲亞砜溶液繼續(xù)培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的小管形成能力

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至3×105/mL并接種至含Matrigel膠的96孔板（100 μL/孔）培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁后，每孔更換為含10 μg/mL的HEEC exo、TE-13 exo和 Eca-109 exo及等體積PBS（或 Eca-109/miR-130a mimic exo、Eca-109/miR-130a inhibitor exo、Eca-109/miR-130a NC exo）的完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，在顯微鏡下觀察并拍照，比較各組小管擬態(tài)形成情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的遷移能力

用不含胎牛血清及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的ECM培養(yǎng)基重懸 HUVEC 細(xì)胞（密度為 5×104/mL）后，取 200 μL細(xì)胞懸液接種至Transwell小室上室，每孔加入HEEC exo、TE-13 exo和 Eca-109 exo及等體積PBS（或Eca-109/miR-130a mimic exo、Eca-109/miR-130a inhibitor exo、Eca-109/miR-130a NC exo），并調(diào)整外泌體濃度至10 μg/mL；下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室，清洗，用甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，清洗并晾干后，于顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)食管鱗癌外泌體中miR-130a的表達(dá)

用The exoRNeasy serum/Plasma Kit試劑盒提取各組細(xì)胞外泌體中的miRNA，按照miRNA cDNA Synthesis試劑盒說(shuō)明書的操作步驟將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并用核酸定量?jī)x進(jìn)行定量。根據(jù)EvaGreen miRNA qPCR試劑盒指示配置反應(yīng)體系，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)熱5 min；95℃反應(yīng)15 s，60℃反應(yīng) 30 s，72℃反應(yīng) 30 s；反應(yīng)序列：miR-130a Forward 為 5′-CATAAACATTGCCGTGGGAGAGC-3′，Reverse 為 5′-TCTGACTCTACCACAGC-3′；miR-39a Forward 為 5′-GCTCCCAAAGCCGTGGGATCGA-3′，Reverse為5′-CATACTCGGAGACTCT-3′。以miR-39 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-130a mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Western blot檢測(cè)HUVEC細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)

用RIPA蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，并用BCA進(jìn)行蛋白定量，沸水浴加熱變性后，行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉 2 h，分別加入 CD9、CD63、TSG101、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、PTEN、Ang1 和 iNOS 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜；加入二抗，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，曝光并拍照。以GAPDH為內(nèi)參，采用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad Prsim 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定結(jié)果

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，采用差速離心法所提取的HEEC、TE-13和Eca-109細(xì)胞外泌體均具有雙層膜結(jié)構(gòu)，形狀呈“杯托”狀，粒徑分布在50～100 nm，符合外泌體的結(jié)構(gòu)特征，見圖1A。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，HEEC、TE-13和Eca-109細(xì)胞外泌體均表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白CD9、CD63、TSG101，符合外泌體的生物學(xué)特征，見圖1B。

圖1 HEEC、TE-13和Eca-109細(xì)胞外泌體的結(jié)構(gòu)及相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況Fig.1 The morphology and expression of related marker proteins of HEEC,TE-13 and Eca-109 cell exosomes

2.2 食管鱗癌細(xì)胞外泌體對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移及血管擬態(tài)形成的影響

MTT法、Transwell小室及小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，共培養(yǎng)后各組HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移及小管形成數(shù)目比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=189.80，472.10，43.50；均 P＜0.001），其中與 PBS 組相比，HEEC exo組細(xì)胞增殖、遷移及小管形成數(shù)目差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但 TE-13 exo組和 Eca-109 exo組細(xì)胞的增殖、遷移及小管形成數(shù)目均明顯升高（P＜0.01）。見圖2。

圖2 食管鱗癌細(xì)胞外泌體對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移及血管擬態(tài)形成的影響Fig.2 Effects of esophageal squamous cell carcinoma exosomes on the proliferation,migration and vascular mimicry of HUVEC cells

2.3 miR-130a在食管鱗癌細(xì)胞外泌體中的表達(dá)情況

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，HEEC、TE-13和Eca-109細(xì)胞外泌體中miR-130a的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=91.24，P＜0.001），其中 TE-13和 Eca-109細(xì)胞外泌體中miR-130a的表達(dá)水平均高于HEEC細(xì)胞（P＜0.01），見圖 3A。

Eca-109細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 miR-130a mimic、miR-130a inhibitor和NC后，細(xì)胞外泌體均符合外泌體的生物學(xué)特征，3組細(xì)胞外泌體中miR-130a的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=298.60，P＜0.001），其中與Eca-109/miR-130a NC exo組相比，Eca-109/miR-130a mimic exo組中 miR-130a的表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.001），而Eca-109/miR-130a inhibitor exo組miR-130a的表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.001），見圖3B～D。說(shuō)明成功獲得差異表達(dá)miR-130a的外泌體，可用于后續(xù)研究。

圖3 miR-130a在食管鱗癌細(xì)胞外泌體中的表達(dá)Fig.3 Expression of miR-130a in exosomes of esophageal squamous cell carcinoma

2.4 食管鱗癌細(xì)胞外泌體中miR-130a對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移及血管擬態(tài)形成的影響

差異表達(dá)miR-130a的外泌體與HUVEC共孵育后，MTT法、Transwell小室及小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，各組HUVEC細(xì)胞增殖、遷移細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=196.40，186.60，118.60；P＜0.001）。其中，與Eca-109/miR-130a NC exo組相比，Eca-109/miR-130a mimic exo組HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移細(xì)胞數(shù)及血管擬態(tài)形成能力均增強(qiáng)（P＜0.01），Eca-109/miR-130a inhibitor exo組HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移細(xì)胞數(shù)及血管擬態(tài)形成能力均降低（P＜0.01）。見圖4。

圖4 食管鱗癌細(xì)胞外泌體中miR-130a對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移及血管擬態(tài)形成能力的影響Fig.4 Effects of exosomal miR-130a in esophageal squamous cell carcinoma on the proliferation,migration and vascular mimicry formation of HUVEC cells

2.5 食管鱗癌細(xì)胞外泌體中的miR-130a可激活PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路

將PBS及各組外泌體與HUVEC細(xì)胞共孵育，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組HUVEC細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平、PI3K和AKT磷酸化水平及Ang1與iNOS的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=432.30，100.50，302.40，174.20，131.70；均 P＜0.001），且 TE-13 exo 和Eca-109 exo組細(xì)胞PI3K和AKT磷酸化水平及Ang1與 iNOS的表達(dá)水平較 PBS組增加（P＜0.001），PTEN表達(dá)水平較PBS組降低（P<0.001）。見圖5A。

差異表達(dá)miR-130a的外泌體與HUVEC共孵育后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組HUVEC細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平、PI3K和AKT磷酸化水平及Ang1和iNOS表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=202.70，472.20，221.50，105.80，418.20；均 P＜0.001）。與 Eca-109/miR-130a NC exo組相比，Eca-109/miR-130a mimic exo組HUVEC細(xì)胞PI3K與AKT磷酸化水平及Ang1與iNOS的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.001），而PTEN表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.001）；與 Eca-109/miR-130a NC exo組相比，Eca-109/miR-130a inhibitor exo組HUVEC細(xì)胞PI3K與AKT磷酸化水平及Ang1與iNOS的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.001），而PTEN表達(dá)水平上調(diào)（P＜0.001）。見圖5B。

圖5 食管鱗癌細(xì)胞外泌體中miR-130a對(duì)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響Fig.5 Effects of exosomal miR-130a in esophageal squamous cell carcinoma on PTEN/PI3K/AKT signaling pathway

3 討論

血管是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，腫瘤微環(huán)境血管新生增加為腫瘤生長(zhǎng)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，因此抑制血管新生成為腫瘤治療的重要措施［11］。腫瘤外泌體對(duì)腫瘤血管新生的調(diào)控作用主要是通過(guò)將腫瘤細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，如miRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)等遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至血管內(nèi)皮細(xì)胞，調(diào)控其細(xì)胞增殖、遷移等功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的血管新生［12-15］。miR-130a被報(bào)道可促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖和遷移并誘導(dǎo)腫瘤耐藥［16-17］。本研究將食管鱗癌細(xì)胞外泌體與HUVEC細(xì)胞共孵育后，發(fā)現(xiàn)HUVEC細(xì)胞增殖和遷移能力及血管擬態(tài)形成增強(qiáng)，說(shuō)明食管鱗癌細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)血管新生。進(jìn)一步在食管鱗癌細(xì)胞外泌體中高表達(dá)miR-130a，同樣發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖、遷移以及小管形成，而抑制其表達(dá)則HUVEC細(xì)胞增殖、遷移以及小管形成受抑制，提示食管鱗癌細(xì)胞外泌體可能通過(guò)高表達(dá)miR-130a而促進(jìn)血管新生。

PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤血管新生的重要信號(hào)通路，既往研究表明，激活PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路可促進(jìn)下游Ang1、iNOS等促血管生成因子的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤血管新生［18-21］。本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-130a的食管鱗癌細(xì)胞外泌體亦可顯著抑制PTEN的表達(dá)，并且促進(jìn)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路激活，而抑制miR-130a表達(dá)則獲得相反的結(jié)果，說(shuō)明食管鱗癌細(xì)胞可能通過(guò)分泌高表達(dá)miR-130a的外泌體激活PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)血管新生。

綜上所述，本研究初步證實(shí)食管鱗癌細(xì)胞能夠通過(guò)分泌高表達(dá)miR-130a的外泌體而激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路而誘導(dǎo)血管新生，但miR-130a發(fā)揮調(diào)控功能所調(diào)控的具體靶基因需進(jìn)一步研究。