絞股藍(lán)皂苷微丸的制備工藝

趙夢(mèng)娜，繆怡燁，喻樊,3，劉岐

（1.鹽城師范學(xué)院藥學(xué)院，江蘇鹽城 224051）（2.江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鹽城224002）（3.南京工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 210000）（4.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225001）

絞股藍(lán)為葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物[1]，其皂苷（Gypenoside）是屬于達(dá)瑪脂烷醇類皂苷，其結(jié)構(gòu)中有甾體母核，為四環(huán)三萜類甾體衍生物，因其分子量較大，故為無色或是白色無定形的粉末。絞股藍(lán)皂苷通過直接的細(xì)胞毒的作用能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長繁殖；還能夠強(qiáng)化人體內(nèi)的超氧化物-歧化酶（SOD）的活性和降低脂質(zhì)過氧化物（LPO）含量，阻止細(xì)胞衰老。另外，絞股藍(lán)皂苷還具有降血脂及抑制肥胖的作用，皂苷本身能抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)生游離的脂肪酸以及合成中性脂肪，同時(shí)也能夠阻止腸道吸收脂肪和蔗糖、防止肝臟組織過氧化作用[2]。因絞股藍(lán)內(nèi)含有多種與人參皂苷類似的成分，故絞股藍(lán)皂苷還具有強(qiáng)壯補(bǔ)益、促進(jìn)代謝旺盛、提高耐力和應(yīng)激能力的作用。

微丸是是一種新型的制劑，直徑為0.5～2.5 mm 的球形或者是類球形的顆粒，屬于多單元口服制劑，單次給藥量可高達(dá)幾十甚至幾百顆，優(yōu)于片劑、丸劑等固體制劑。與單劑量型給藥系統(tǒng)相比釋藥更穩(wěn)定[3]，在胃腸道中自由分散、最大限度地增加藥物吸收、減少血藥波動(dòng)和減少潛在的副作用，從而提高藥物的生物利用度[4]；并且還具有生產(chǎn)工藝簡潔、載藥量大、脆碎度小、流動(dòng)性好等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)在市面上未見絞股藍(lán)皂苷微丸。

微丸的制備方法有很多種，如擠出滾圓法、離心造粒法、流化床制粒法及包衣鍋制備法等[5]，用擠出滾圓法制備的載藥微丸的藥物含量分布均勻，粒徑分布窄。本課題以碳酸鈣、微晶纖維素、淀粉漿為輔料，采用擠出滾圓法制備空白微丸，采用流化床包衣將絞股藍(lán)噴于空白微丸上，制備出絞股藍(lán)皂苷微丸，利用紅外光譜、電子顯微鏡、X-射線粉末衍射等方法對(duì)其進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 原料

絞股藍(lán)皂苷，西安小草植物科技有限責(zé)任公司；玉米淀粉（批號(hào)：2016032601），廣饒麗楓生物科技有限公司；碳酸鈣（批號(hào)：070601），宜興市第二化學(xué)試劑廠；微晶纖維素（批號(hào)：20130802），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑為分析純等。

1.2 主要儀器設(shè)備

Mini 型流化制粒包衣機(jī)，深圳市信宜特科技有限公司；E-50 擠出制粒機(jī)、R-250 離心滾圓機(jī)，重慶英格制藥設(shè)備制造有限公司；CS-2 脆碎度測(cè)試儀，天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克光譜儀器公司；電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；三目生物顯微鏡XSP-8C，上海嚴(yán)豐精密儀器有限公司；休止角測(cè)定儀，寧波瑞柯偉業(yè)儀器有限公司；Lambda950 紫外分光光度計(jì)，美國PE 公司。

1.3 溶液配制

絞股藍(lán)皂苷對(duì)照品溶液：精密稱取20 mg 絞股藍(lán)皂苷對(duì)照品，將其溶于10 mL 甲醇中，即可制得2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

絞股藍(lán)皂苷供試品溶液：將微丸研細(xì)，精密稱取0.5 g 至錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL 稱重，超聲處理（300 W，50 Hz）20 min，放冷，再稱重，后用甲醇補(bǔ)足損失溶液，濾過，棄去初濾液后，精密吸取濾液100 μL，置于具塞試管中，水浴蒸去甲醇，分別精密加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL 與高氯酸0.8 mL 搖勻；密塞；置60 ℃水浴中加熱15 min 左右，后立即用流水冷卻至室溫，精密加入冰乙酸5 mL 搖勻即得。

絞股藍(lán)皂苷包衣懸浮液：取3 g 絞股藍(lán)皂苷溶于200 mL 純化水中。

人工胃液：取4.5 mL 濃鹽酸溶于500 mL 純水中即可得pH 1.2 的人工胃液。

物理混合物：取1.2 g 碳酸鈣、0.3 g 微晶纖維素和0.1 g 絞股藍(lán)皂苷于研缽混勻。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取上述對(duì)照品溶液0、30、60、90、120、150 μL，在550 nm 的波長處測(cè)定吸光度，以取樣量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制出絞股藍(lán)皂苷的紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.9658x-0.0004，R=0.9983。

1.5 空白微丸的制備

分別稱取微晶纖維素12.5 g 和碳酸鈣50 g，混勻后加入淀粉漿捏合，制成軟材。經(jīng)擠出機(jī)的篩板（孔徑為0.8 mm）擠出直徑相同且光滑致密的細(xì)條狀物，選擇適當(dāng)?shù)臐L圓頻率，將擠出物置于高速旋轉(zhuǎn)的滾圓機(jī)內(nèi)，制成微丸。然后經(jīng)60 ℃干燥，過篩，以24～50目之間的微丸進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。

1.6 絞股藍(lán)皂苷微丸的制備[6]

將微丸干燥24 h 后進(jìn)行流化床上藥包衣，調(diào)節(jié)噴氣壓力為0.1 MPa，進(jìn)風(fēng)溫度設(shè)為75 ℃，物料溫度為40 ℃，風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)速為700 r/min；打開蠕動(dòng)泵，將絞股藍(lán)皂苷緩釋包衣液連續(xù)噴至空白丸芯表面，使包衣液充分包裹在微丸表面，設(shè)置流化床的流速為4 mL/min。噴液結(jié)束后，維持原有溫度繼續(xù)流化10 min，將所得微丸進(jìn)行干燥處理即得絞股藍(lán)皂苷微丸。

1.7 粉體學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.7.1 粒度分布

將微丸放置于一套標(biāo)準(zhǔn)的藥篩上層，手動(dòng)搖蕩藥篩振蕩5 min 左右，后稱量每層藥篩上微丸的質(zhì)量，計(jì)算出每層藥篩上的微丸所占總質(zhì)量的百分比，并畫出累積粒度分布圖。

1.7.2 微丸得率計(jì)算

將制備的微丸稱量計(jì)總重（m），分別通過10、24、50、65、80 目標(biāo)準(zhǔn)篩，測(cè)定50 目篩上的微丸質(zhì)量（mi），計(jì)算各篩上的得率（D）。

1.7.3 休止角(Angle of repose)測(cè)定

采用休止角測(cè)定儀來測(cè)定微丸的休止角。將空白微丸倒入漏斗中，使其在重力的作用下做自由落體運(yùn)動(dòng)，空白微丸落到表面皿中形成圓錐體，測(cè)量空白微丸的錐形高度h 和微丸在表面皿中的半徑r，按下式計(jì)算，θ即為休止角。

1.7.4 堆密度（Tapdensity）測(cè)定

稱取20 g 微丸緩緩?fù)ㄟ^玻璃漏斗傾倒至一量筒內(nèi)，測(cè)出微丸的松容積即可計(jì)算微丸的堆密度，平行測(cè)定3 次取其平均值。

1.7.5 脆碎度（Friability）測(cè)定[7]

采用CS-2 脆碎度測(cè)試儀測(cè)定脆碎度，稱取微丸（m1）置于CS-2 脆碎度儀中，25 r/min 旋轉(zhuǎn)4 min，將物料過篩，稱量篩下的微丸質(zhì)量（m2），計(jì)算脆碎度（Fr）。

1.7.6 圓整度（Sphericity or roundness）測(cè)定

取至少300 個(gè)微丸，采用生物顯微鏡XSP-8C 測(cè)量微丸的圓整度。

1.8 微丸的表征

1.8.1 掃描電子顯微鏡法（SEM）[8]

選取完整的整丸和半丸、溶出3 h 后的包衣微丸，固定于樣品板上，利用噴金儀在樣品表面真空鍍膜，然后將其固定于樣品槽內(nèi)，設(shè)定工作電壓為15.0 V 進(jìn)行拍攝。

1.8.2 FT-IR 測(cè)定[9]

分別對(duì)絞股藍(lán)微丸粉末、空白微丸粉末、絞股藍(lán)原藥、微晶纖維素輔料、碳酸鈣輔料和物理混合物進(jìn)行測(cè)定。波數(shù)范圍為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，記錄數(shù)據(jù)，利用Origin Lab 8.0 軟件進(jìn)行作圖。

1.8.3 X-射線粉末衍射法（XRD）分析

對(duì)輔料、原料藥、空白微丸、藥物微丸、物理混合物分別進(jìn)行X 衍射測(cè)定。掃描方式：定性，步進(jìn)掃描；管壓/管流：40 kV/30 mA；掃描速度：2 °/min，步長為0.02°（2θ）；靶：Cu 靶；掃描范圍：（2θ）10°～80°。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010 以及Origin 8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)均設(shè)置3 次平行樣品，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）的形式表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 制備工藝參數(shù)

2.1.1 滾圓時(shí)間

將擠出頻率固定為30 Hz，滾圓頻率固定為50 Hz，分別測(cè)定滾圓時(shí)間為4、6、8 min 時(shí)所制備的空白微丸的圓整度。結(jié)果如表1 所示。

表1 滾圓時(shí)間對(duì)微丸圓整度的影響Table 1 Effect of spheronization time on pellet roundness

由表1 可知，在滾圓時(shí)間為4 min 時(shí)的圓整度最佳，因此在微丸制備的工藝過程中滾圓時(shí)間的最優(yōu)條件為4 min。

2.1.2 擠出頻率

將滾圓頻率固定為50 Hz，滾圓時(shí)間固定為4 min，分別測(cè)定擠出頻率為30、40、50、60 Hz 時(shí)所制備的空白微丸的圓整度。結(jié)果如表2 所示。

表2 擠出頻率對(duì)微丸圓整度的影響Table 2 Effect of extrusion velocity on pellet roundness

由表2 可知，當(dāng)擠出頻率為30 Hz 時(shí)的圓整度最佳。擠出頻率過快，擠出物料較疏松，表面粗糙呈鱗片狀，并且溫度升高現(xiàn)象嚴(yán)重，不利于物料性質(zhì)的穩(wěn)定，影響微丸的圓整度。此結(jié)果與呂志陽[10]所得結(jié)果一致。因此在微丸制備的工藝過程中擠出頻率的最優(yōu)條件為30 Hz。

2.1.3 滾圓頻率

將擠出頻率固定為30 Hz，滾圓時(shí)間固定為4 min，分別測(cè)定滾圓頻率為20、30、40、50 Hz 時(shí)所制備的空白微丸的圓整度，結(jié)果如表3 所示。

表3 滾圓頻率對(duì)微丸圓整度的影響Table 3 Effect of spheronization velocity on pellet roundness

當(dāng)滾圓頻率為20、30、40、50 Hz 時(shí)，圓整度情況分別為未成型、未成型、0.81±0.13、0.87±0.21，滾圓頻率為50 Hz 時(shí)的圓整度最佳，滾圓頻率越小，轉(zhuǎn)盤提供的離心力和剪切力越小，條狀軟材不易切斷，呈長條狀或者是短圓柱狀，圓整度下降，此結(jié)果與李丹[11]所得結(jié)果一致。因此在微丸制備的工藝過程中滾圓頻率的最優(yōu)條件為50 Hz。

2.2 絞股藍(lán)皂苷載藥微丸包衣工藝的篩選

采用流化床包衣技術(shù)對(duì)制備的空白微丸進(jìn)行緩釋包衣[12]。3 g 絞股藍(lán)皂苷溶于200 mL 純水。流化床包衣工藝：投料量為15～20 g，進(jìn)風(fēng)溫度75 ℃，物料溫度40 ℃，噴槍噴霧壓力為0.1 Pa，蠕動(dòng)泵流速為1.3 mL/min，風(fēng)機(jī)轉(zhuǎn)速為700 r/min；包衣增重20%。

2.3 微丸的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法

2.3.1 粒度分布

圖1 空白微丸粒度分布Fig.1 Particle size distribution of blank pellets

圖1 為累積粒度分布圖，表明空白微丸粒度均勻。

2.3.2 微丸得率

按照公式計(jì)算微丸的得率為61.90%。

2.3.3 休止角

按公式計(jì)算可得休止角38.70°，流動(dòng)性較好，能滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要。

2.3.4 堆密度

取20 g 微丸計(jì)算微丸的堆密度平行測(cè)定3 次，測(cè)得平均值為1.00 g/mL。

2.3.5 脆碎度

微丸物料的剝落趨勢(shì)可用微丸的脆碎度來進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過計(jì)算微丸的脆碎度為0.90%。

2.3.6 圓整度

微丸的圓整度用于反映微丸成球的好壞程度，能直接反映藥物在丸面的沉積和成型，從而影響到微丸的包衣質(zhì)量。經(jīng)測(cè)量，微丸的圓整度為0.80±0.17。

2.4 體外釋放度的測(cè)定

為考察絞股藍(lán)皂苷載藥微丸的速釋效果，采用體外釋放度進(jìn)行測(cè)定。稱取適量的絞股藍(lán)皂苷微丸，以100 mL pH 1.2 的人工胃液為釋放介質(zhì)[13]，設(shè)定溫度37±0.5 ℃，轉(zhuǎn)速為50 r/min，于第10、30、60、120、180 min 分別取樣2 mL，同時(shí)補(bǔ)充等溫等體積的新鮮介質(zhì)，樣品經(jīng)染色處理后，在550 nm 處測(cè)定吸光度A，計(jì)算累積釋放度為95.98%±8.92%。

圖2 絞股藍(lán)皂苷微丸的體外釋放度曲線Fig.2 In vitro release curve

2.5 絞股藍(lán)皂苷微丸的表征

2.5.1 絞股藍(lán)皂苷掃描電鏡

為了解絞股藍(lán)皂苷載藥微丸表面結(jié)構(gòu)、載藥層厚度以及比較微丸溶出前后的形態(tài)[14]，采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下圖3。

由圖3 可知，絞股藍(lán)皂苷載藥微丸的表面相對(duì)光滑，而未包衣微丸表面粗糙。圖b、圖c，可見絞股藍(lán)皂苷緩釋微丸釋放藥物，且表面包衣層多有破壞；比較圖c、圖d 和圖e，可以看出圖d 中的包衣微丸表面的包衣層厚度，而圖c 中未包衣的微丸表面粗糙并且沒有包衣層。

圖3 微丸掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.3 The SEM image of pellet

2.5.2 絞股藍(lán)皂苷紅外光譜分析

圖4 紅外光譜圖Fig.4 The pattern of UV absorbance

對(duì)絞股藍(lán)皂苷載藥微丸進(jìn)行紅外表征（圖4），絞股藍(lán)皂苷（曲線A）在3406 cm-1是O-H 的伸縮振動(dòng)峰，在1649 cm-1是C=C 的伸縮振動(dòng)峰[15]，1649 cm-1處為H-OH 的變形振動(dòng)，1457、1382 cm-1分別為H-C-H，H-O-C 的變形振動(dòng)峰，1043 cm-1是C-O、C-C的伸縮峰，2935 cm-1為C-H 的伸縮振動(dòng)峰[16]。微晶纖維素（曲線B）在3326、3421 cm-1的寬吸收峰為纖維素分子中O-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰，2857 cm-1處是C-H 的伸縮振動(dòng)峰，1166 cm-1處是C-O 的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1665 cm-1處是C-O 的伸縮振動(dòng)峰，1374、1453 cm-1處是C-H 的彎曲振動(dòng)吸收峰，1058 cm-1處是C-O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。碳酸鈣（曲線C）在1795 cm-1處是C-O 伸縮振動(dòng)峰，在1403 cm-1是C-O 反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，在873 cm-1為碳酸鈣的CO32-面外變形振動(dòng)峰，在710 cm-1為O-C-O 的面內(nèi)變形振動(dòng)峰?？瞻孜⑼瑁ㄇ€D）在873 cm-1處是碳酸鈣的CO32-出現(xiàn)面外變形振動(dòng)峰，在1795 cm-1出現(xiàn)的是碳酸鈣的C-O 伸縮振動(dòng)峰，在3341 cm-1處是纖維素分子中O-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰，1027 cm-1處是微晶纖維素的C-O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰。物理混合物（曲線E）在873 cm-1處是碳酸鈣的CO32-出現(xiàn)面外變形振動(dòng)峰，在710 cm-1處的峰是碳酸鈣的O-C-O 面內(nèi)變形振動(dòng)峰，1036 cm-1是絞股藍(lán)皂苷的C-O、C-C 的伸縮峰，在3440 cm-1的為纖維素分子中O-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰。絞股藍(lán)皂苷微丸（曲線F）在873 cm-1處是碳酸鈣的CO32-出現(xiàn)面外變形振動(dòng)峰，在710 cm-1處的是碳酸鈣的O-C-O 面內(nèi)變形振動(dòng)峰，在1795 cm-1出現(xiàn)的是碳酸鈣的C-O 伸縮振動(dòng)峰，1156 cm-1處是微晶纖維素的C-O的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，1027 cm-1處是微晶纖維素C-O的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，在3339 cm-1的為纖維素分子中O-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰，2906 cm-1為絞股藍(lán)皂苷的C-H 伸縮振動(dòng)峰。

2.5.3 絞股藍(lán)皂苷X-射線粉末衍射法分析

圖5 X 射線粉末衍射圖譜Fig.5 Infrared spectra

X 射線粉末衍射法是指用特定波長的X 射線波長照射化合物后，得到一定量的衍射信息，既能用衍射圖來表達(dá)，也能用衍射峰的衍射角及衍射強(qiáng)度的數(shù)據(jù)來表述。對(duì)絞股藍(lán)皂苷載藥微丸進(jìn)行表征（圖5），曲線A 在17 度附近呈現(xiàn)一鈍衍射峰，表明絞股藍(lán)皂苷為非晶體結(jié)構(gòu)；曲線B 為碳酸鈣，因其結(jié)晶性質(zhì)，存在數(shù)個(gè)較強(qiáng)衍射峰，在30°處的衍射峰尤為明顯；曲線C 也存在數(shù)個(gè)衍射峰，同樣也是由于微晶纖維素的結(jié)晶體性質(zhì)，在20°處的衍射峰尤為明顯；曲線D、E、F 只出現(xiàn)了碳酸鈣的衍射峰，因?yàn)橹苽涞奈⑼杓拔锢砘旌衔镆蕴妓徕}為主要輔料，故微晶纖維素和絞股藍(lán)皂苷原料藥的衍射峰幾乎完全消失，表明絞股藍(lán)皂苷均勻分布在微丸中。

3 結(jié)論

本文運(yùn)用擠出滾圓法制備空白微丸，采用流化床底噴上藥，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察微丸圓整度的擠出頻率、滾圓頻率、滾圓時(shí)間對(duì)微丸圓整度的影響，得出最佳方案：擠出頻率為30 Hz，滾圓頻率為50 Hz，滾圓時(shí)間為4 min；采用流化床底噴上藥包衣的工藝技術(shù)對(duì)微丸進(jìn)行包衣。對(duì)載藥微丸進(jìn)行了粉體學(xué)、圓整度、釋藥等方面的評(píng)價(jià)，并對(duì)載藥微丸進(jìn)行了電鏡、紅外、X 射線粉末衍射等方面的表征，結(jié)果表明該微丸得率高，脆碎度低，圓整度好，適合工業(yè)化生產(chǎn)。