基于HPLC 指紋圖譜鑒別四個(gè)不同品種的金銀花葉

童凱，沈國(guó)強(qiáng)，黃月，李潔媛，曾繁富，閆蒙，甘婉瑩，李東

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644000）

（2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川宜賓 644000）

金銀花一般指忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.），是一種重要的藥食兩用物質(zhì)，其花、莖、葉均具有較高的醫(yī)療和食用價(jià)值。在中醫(yī)實(shí)踐中，常用金銀花的花蕾和藤莖治療風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥候，在食品行業(yè)中，常用金銀花的花蕾或花朵生產(chǎn)植物飲料或代用茶[1]。金銀花的葉因產(chǎn)量相對(duì)較高，富含綠原酸、黃酮等活性物質(zhì)，且具有抑菌、抗氧化等藥理作用，在許多功能性食品、中成藥、動(dòng)物飼料、化妝品、日化品中均具有廣泛的應(yīng)用[2,3]。

我國(guó)金銀花及其近緣種的遺傳資源十分豐富，有忍冬屬植物98 種，5 亞種，18 變種[4]?，F(xiàn)流通于市的常見近緣種主要包括灰氈毛忍冬L. macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L. hypoglaucaMiq.、華南忍冬L. confuseDC.、黃褐毛忍冬L. fulvotomentosaHsu et S.C. Cheng，該4 種近緣種也可被統(tǒng)稱為“山銀花”[5]。此外，在長(zhǎng)期的人工栽培歷史中，逐漸形成了毛花系列、雞爪花系列、野生系列等一系列金銀花栽培品種。前人研究表明，不同種質(zhì)來源的金銀花，在農(nóng)藝性狀、營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味、藥理活性、經(jīng)濟(jì)價(jià)值等方面具有顯著的差異，一旦誤用或混用則可能導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[6-9]。因此，準(zhǔn)確鑒別金銀花的種質(zhì)來源，是金銀花種植、加工、流通、消費(fèi)等各環(huán)節(jié)，保障金銀花產(chǎn)品品質(zhì)和安全的重要內(nèi)容。

現(xiàn)已開發(fā)的各類鑒別技術(shù)具有各自不同的適用條件，在實(shí)際工作中需要根據(jù)具體情況靈活使用[10,11]。例如，基于原植物形態(tài)特征的鑒別方法，具有簡(jiǎn)便易行的優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于野外鑒別，但對(duì)鑒別者的專業(yè)水平和經(jīng)驗(yàn)依賴較強(qiáng)，而且對(duì)于局部樣、破損樣、粉末樣等往往難于做出準(zhǔn)確鑒定?；谥参顳NA 序列特征的分子鑒別方法，具有專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，尤其適用于精準(zhǔn)鑒別，但因靈敏度過高，可能對(duì)極少量的、無意引入的異種DNA 污染造成誤判[12]。近年來，基于樣品內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)群的組成和含量特征建立的化學(xué)指紋圖譜技術(shù)，由于在準(zhǔn)確度和靈敏度方面具有較好的平衡，已在咖啡[13]、陳皮[14]、橄欖油[15]等眾多產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和真?zhèn)舞b別中得到成功應(yīng)用，表現(xiàn)出廣闊的潛力。

本研究以4 種不同種質(zhì)來源的金銀花葉為研究材料，利用高效液相色譜儀（HPLC）建立化學(xué)指紋圖譜，結(jié)合主成分分析、聚類分析等多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，比較分析4 種金銀花葉的化學(xué)物質(zhì)群差異，以期為不同種質(zhì)金銀花的鑒別及其產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

供試金銀花葉于2019 年11 月采集自四川省雅安市天全縣，經(jīng)植物學(xué)形態(tài)考察初步鑒定，來自于4 個(gè)不同的種質(zhì)資源，分別為忍冬栽培品種“北花1 號(hào)”（Bei Hua 1,L.japonicaThunb.）、忍冬栽培品種“四季金銀花”（Si Ji,L. japonicaThunb.）、紅腺忍冬(L.hypoglaucaMiq.)和灰氈毛忍冬（L. macranthoidesHand.-Mazz.）。每個(gè)種質(zhì)類型采集8 批次樣品，依次編號(hào)為B1-B8，S1-S8，H1-H8 和Y1-Y8，每批次樣品由相同種質(zhì)的不同植株的葉片混合構(gòu)成，合計(jì)采集32批樣品。

圖1 供試金銀花原植物Fig.1 Honeysuckle plants from 4 different genetic varieties

1.1.2 主要設(shè)備

Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；KQ-700DE 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101-3B 電熱恒溫干燥箱，浙江力辰儀器科技有限公司；101-3AB 高速中藥粉碎機(jī)，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；UPT-1-100L 超純水器，成都超純科技有限公司。

1.1.3 主要試劑

色譜級(jí)乙腈、甲醇、甲酸，購(gòu)自于賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；無水乙醇，購(gòu)自于成都科隆化學(xué)品有限公司；超純水由超純水儀提供；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%），購(gòu)自于成都德思特生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)為DST190906-021。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

選擇各批次樣品中無病斑和蟲眼的新鮮健康葉片，除去泥塵、雜質(zhì)，在105 ℃下殺青5 min 后，于60 ℃恒溫干燥約4 h，粉碎過60 目篩，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 溶液制備

精密稱量0.5 g 樣品粉末，加入20 mL 50%乙醇溶液，稱定重量。40 kHz 下超聲提取30 min，期間震蕩兩次。靜置冷卻到室溫后再次稱重，用50%乙醇溶液彌補(bǔ)損失的重量。靜置30 min 后，取上清液1 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，取濾液低溫保存?zhèn)溆?。另精密稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用50%甲醇（色譜級(jí)）溶解后，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 色譜條件

在陳魁霞等[16]研究的基礎(chǔ)上略作修改，采用如下色譜條件：色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC C18柱（150 mm×4.6 mm）；流動(dòng)相（A：0.1%甲酸，B：甲醇，C：乙腈）；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)柱溫：30 ℃；檢測(cè)時(shí)間：40 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；梯度洗脫程序：0～36 min，流動(dòng)相A：90%～67%，流動(dòng)相B：0%～3%，流動(dòng)相C：10%～30%；36～40 min，流動(dòng)相A：67%～10%，流動(dòng)相B：3%～10%，流動(dòng)相C：30%～80%。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Open LAB Chemstation 化學(xué)工作站提取色譜數(shù)據(jù)，采用Microsoft Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用MetaboAnalyst 4.0 軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜檢測(cè)與數(shù)據(jù)提取

圖2 不同種質(zhì)金銀花葉典型指紋圖譜Fig.2 Typical HPLC fingerprint of different honeysuckle leaves

32 批次樣品溶液按1.2.3 所述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，得到相應(yīng)的HPLC 色譜圖。4 種不同種質(zhì)來源的金銀花葉典型HPLC 色譜圖見圖2。各個(gè)色譜圖可在0～40 min 內(nèi)基本出峰完畢，且出峰數(shù)量豐富，峰形良好，從中提取出特征色譜峰34 個(gè)，按照保留時(shí)間先后順序，依次編號(hào)1～34。同時(shí)記錄各色譜峰的峰面積數(shù)據(jù)，組成32×34 的分析數(shù)據(jù)集。

2.1.2 色譜峰指認(rèn)

根據(jù)《中國(guó)藥典》（2015 版），金銀花以綠原酸和木犀草苷作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分。因此，在相同色譜條件下，分別進(jìn)樣測(cè)定綠原酸和木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，記錄其保留時(shí)間并與樣品溶液色譜圖比對(duì)。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)色譜圖中第7 號(hào)色譜峰為綠原酸的物質(zhì)信號(hào)（圖3），而木犀草苷在該色譜條件下未被檢出。

圖3 色譜峰指認(rèn)結(jié)果Fig.3 Result of chromatographic peak identification

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)

以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄并計(jì)算其色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值，為3.02%，變異幅度較小，說明所建立的色譜方法精密度較好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備混合葉片樣品，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 后進(jìn)行測(cè)定，記錄并計(jì)算綠原酸色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值，為4.78%，變異幅度較小，說明所建立的色譜方法穩(wěn)定性較好。

2.2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

平行制備5 份四季金銀花樣品溶液，依次進(jìn)樣測(cè)定，記錄并計(jì)算7 號(hào)峰（綠原酸）的色譜峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 值，為1.55%，變異幅度較小，說明所建立的色譜方法重現(xiàn)性較好。

2.3 主成分分析

主成分分析（PCA）是一種降維技術(shù)，其基本思想是用少數(shù)幾個(gè)具有代表性的綜合指標(biāo)（主成分）代替多個(gè)原始變量，從而實(shí)現(xiàn)降維觀察數(shù)據(jù)特征的多元統(tǒng)計(jì)分析方法[17,18]。例如，宋九華[19]等人針對(duì)不同產(chǎn)地金銀花樣品構(gòu)建了HPLC 指紋圖譜，然后利用主成分分析方法，對(duì)圖譜中13 個(gè)共有峰面積所構(gòu)成的數(shù)據(jù)集進(jìn)行降維比較后發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)自于四川、山東、貴州、安徽、河南等不同產(chǎn)地的16 批次金銀花可以分為3個(gè)大產(chǎn)區(qū)，為金銀花的產(chǎn)地識(shí)別和質(zhì)量控制提供了有益的方法參考。

本研究以32 個(gè)不同品種來源的金銀花葉為對(duì)象構(gòu)建HPLC 指紋圖譜，對(duì)從中提取的34 個(gè)色譜峰的峰面積組成的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析。結(jié)果顯示，前兩個(gè)主成分（PC1 和PC2）分別表征了原始變量35.1%和16.2%的變異信息。在以PC1 和PC2 為橫縱坐標(biāo)繪制的二維得分圖中，32 個(gè)供試樣品的分布呈現(xiàn)4 種明顯不同的聚集趨勢(shì)，來自于相同品種的樣本傾向于聚集為相同一組，而不同品種的樣品則相互遠(yuǎn)離。尤其，在PC1 方向上，8 個(gè)灰氈毛忍冬樣品（Y1-Y8）與其他3 種樣品均相距較遠(yuǎn)。以上結(jié)果說明，4 種不同品種來源的金銀花葉的總體化學(xué)物質(zhì)群具有顯著差異，通過主成分分析可以對(duì)不同品種來源的金銀花葉取得較好的區(qū)分效果，這為實(shí)際應(yīng)用中區(qū)別使用不同品種的金銀花原料，以及相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。類似的，Qingxia Wang[20]等人從植物學(xué)形態(tài)、ITS 序列、花蕾中活性成分積累等方面，詳細(xì)比較了忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、紅腺忍冬等4種不同品種的金銀花的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正品金銀花（L.japonicaThunb.）與其他3 種易混淆金銀花品種均具有較大差異，這與本研究的結(jié)果是一致的。

圖4 主成分分析得分圖Fig.4 Score plot of PCA

圖5 聚類分析結(jié)果Fig.5 Result of cluster analysis

2.4 聚類分析

系統(tǒng)聚類法的基本思想是將多個(gè)樣品各自作為一類，然后計(jì)算各類之間距離的遠(yuǎn)近，首先將距離最近的兩類合并成新的一類，然后用所得到的新的一類和其他類的樣品再進(jìn)行距離分析，將此時(shí)距離最近的再歸為一類，直至將所有樣品合為一大類，最終形成聚類樹狀圖[21,22]。邵林[23]等人利用聚類分析的方法，對(duì)山東地區(qū)10 個(gè)不同栽培品種金銀花花蕾的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)金銀花花蕾的化學(xué)物質(zhì)群特征，不僅在植物物種之間，也包括在不同栽培品種之間仍然具有較大差異。本研究利用系統(tǒng)聚類的方法，以歐氏距離為度量，對(duì)32 個(gè)樣品進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，32 個(gè)樣品中所有供試的灰氈毛忍冬樣本首先被單獨(dú)聚為一類（圖5，組1），提示其化學(xué)物質(zhì)群特征最大程度區(qū)別于其他3 個(gè)品種的樣品（圖5，組2），這與上述主成分分析的結(jié)果是一致的。繼續(xù)聚類分析顯示，8 個(gè)紅腺忍冬的樣本可再繼續(xù)被單獨(dú)聚為一類（圖5，組2-1），以區(qū)別于“北花1 號(hào)”和四季金銀花的樣本（圖5，組2-2）。值得注意的是，“北花1 號(hào)”和四季金銀花雖同為忍冬植物的不同栽培品種，但仍然具有相對(duì)穩(wěn)定和特殊的內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)群，在聚類分析時(shí)還可繼續(xù)被各自聚為一類（圖5，組2-2a 和組2-2b），這與上述邵林[23]等人的研究結(jié)果是類似的。在本研究中，相較于四季金銀花，其他品種中與之具有相似化學(xué)特征的金銀花品種依次為“北花1 號(hào)”，紅腺忍冬和灰氈毛忍冬。這提示金銀花葉的化學(xué)物質(zhì)群差異，反映了各品種之間的親緣關(guān)系強(qiáng)弱，并可據(jù)此建立HPLC 指紋圖譜用以輔助不同品種的鑒別分析。

進(jìn)一步地，對(duì)各色譜峰面積在各種質(zhì)之間的差異進(jìn)行方差分析，根據(jù)P 值大小取前10 個(gè)最顯著差異的色譜峰，并按峰面積相對(duì)大小值繪制熱力圖（圖5）。結(jié)果顯示，指紋圖譜中第16 號(hào)、24 號(hào)、18 號(hào)、14 號(hào)、6 號(hào)、29 號(hào)、8 號(hào)、5 號(hào)、7 號(hào)、11 號(hào)色譜峰是各種質(zhì)金銀花葉化學(xué)差異的最主要來源。其中，7 號(hào)峰經(jīng)指認(rèn)為綠原酸，其相對(duì)含量按高低依次為灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、北花1 號(hào)和四季金銀花。這與肖作為[24]等人關(guān)于金銀花和山銀花中綠原酸含量的定量測(cè)定結(jié)果是吻合的。其他具有顯著差異的色譜峰，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)等方法進(jìn)一步鑒定后，可開發(fā)作為穩(wěn)定的化學(xué)標(biāo)記，用以輔助金銀花不同種質(zhì)之間的鑒別分析。朱姮[25]等人利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS 技術(shù)建立了山東金銀花花蕾的多指標(biāo)定量指紋圖譜，從中準(zhǔn)確鑒定了32 種化學(xué)成分，并且實(shí)現(xiàn)了不同品種金銀花和湖南山銀花的正確區(qū)分。而關(guān)于金銀花葉片的化學(xué)成分構(gòu)成，前人的相關(guān)研究表明，綠原酸、木犀草苷、蘆丁等酚酸類、環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類物質(zhì)是金銀花葉發(fā)揮抑菌、抗病毒、抗氧化、抗血小板聚集等藥理活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[26]。陳魁霞[16]等人建立了金銀花中10 種酚酸類成分的HPLC 同時(shí)測(cè)定方法，趙金娟[27]等人測(cè)定了不同品種金銀花的花和葉中活性成分含量，發(fā)現(xiàn)金銀花的葉中木犀草苷含量高于花，且不同品種之間存在顯著差異。這些研究為金銀花葉的化學(xué)鑒別和開發(fā)利用研究提供了良好的方法和思路參考。

3 結(jié)論

本研究所建立的HPLC 指紋圖譜，揭示了灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、“北花1 號(hào)”、四季金銀花4 種不同種質(zhì)的金銀花葉具有顯著不同的化學(xué)物質(zhì)群特征。指紋圖譜中第5、6、7（綠原酸）、8、11、14、16、18、24、29 號(hào)色譜峰是各個(gè)種質(zhì)金銀花葉化學(xué)差異的主要來源，結(jié)合主成分分析和聚類分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)金銀花不同種質(zhì)之間的鑒別分析。