牛β-乳球蛋白膠體金免疫層析試紙條的研制及檢測(cè)應(yīng)用

薛海燕，吳劍，張穎，宋宏新，賀寶元

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）

（2.陜西科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021）

β-乳球蛋白是牛乳中的主要蛋白質(zhì)，分子量18.2 ku，等電點(diǎn)5.3[1]。β-乳球蛋白是反芻動(dòng)物如牛、羊和單胃動(dòng)物乳中的主要成分，容易引發(fā)免疫反應(yīng)出現(xiàn)過(guò)敏現(xiàn)象，是牛乳中最主要的過(guò)敏原之一[2]。羊乳β-lg與牛乳β-lg 的天然構(gòu)象不同，而且羊乳中的β-lg 含量低于牛乳，羊乳的過(guò)敏發(fā)生率較低[3]。羊乳的營(yíng)養(yǎng)成分和牛乳接近，但是羊乳的營(yíng)養(yǎng)比例比牛乳更加合理，更容易消化吸收[4]。Native-PAGE 電泳圖譜顯示，牛羊乳蛋白差異主要體現(xiàn)在清蛋白上，牛乳β-lg 位于凝膠底部，且是兩條變異條帶，而羊乳β-lg 僅有一條條帶，位于電泳圖的中間[5]。我國(guó)山羊養(yǎng)殖規(guī)模不大，山羊的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，泌乳期短，羊乳產(chǎn)量少，且極易受季節(jié)的影響[6,7]，因此羊乳資源相對(duì)匱乏，市場(chǎng)價(jià)格較高。牛乳與羊乳在外觀、營(yíng)養(yǎng)成分上極為相似，一些不法商家借在羊乳中摻入牛乳來(lái)降低生產(chǎn)成本，達(dá)到盈利的目的。這種行為不僅損害了消費(fèi)者的權(quán)益，還會(huì)對(duì)牛乳過(guò)敏的消費(fèi)群者造成極大的傷害。因此，迫切需要建立一種快速檢測(cè)羊乳中摻入牛乳的方法。

最常用的檢測(cè)牛羊乳摻假的方法有電泳檢測(cè)技術(shù)，色譜技術(shù)，PCR 技術(shù)，ELISA 技術(shù)等。傳統(tǒng)的SDS-PAGE 方法很復(fù)雜，難以量化，而且牛羊乳的成分和性質(zhì)也比較相似，用該技術(shù)檢測(cè)更加困難。如果電泳和色譜技術(shù)聯(lián)用，測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確，并且不僅可以實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)，還可以用于定量。但其實(shí)驗(yàn)設(shè)備繁重，時(shí)間長(zhǎng)；氣相和液相色譜法準(zhǔn)確且可重復(fù)[8,9]，但制備樣品過(guò)程繁瑣，時(shí)間長(zhǎng)且需要大量標(biāo)品；PCR檢測(cè)技術(shù)特異性強(qiáng)，速度快，但此法需要較高的專業(yè)技能，所需試劑成本也高，不適用于快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[10,11]；ELISA 技術(shù)靈敏度高，特異性好，操作也相對(duì)簡(jiǎn)單[12]。但該法不僅需要特定的儀器，實(shí)驗(yàn)時(shí)間也長(zhǎng)，現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模乳制品的檢測(cè)不適合采用此法。與其他技術(shù)相比，膠體金免疫層析技術(shù)是一種簡(jiǎn)單而快速的檢測(cè)技術(shù)[13,14]。它是目前快速準(zhǔn)確適用于現(xiàn)場(chǎng)的檢測(cè)技術(shù)手段。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，易攜帶，結(jié)果直觀，適合于現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模的檢測(cè)。

本文選擇牛乳β-乳球蛋白作為抗原，免疫小鼠，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合，篩選了6 株雜交瘤細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備特異性高的單克隆抗體。利用該抗體研制可快速檢測(cè)羊乳中牛β-乳球蛋白膠體金免疫層析試紙條。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠體金、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC 底板，上海杰一生物技術(shù)有限公司；牛β-乳球蛋白、牛α-乳白蛋白、BSA、牛α-酪蛋白、牛β-酪蛋白、牛κ-酪蛋白，西安優(yōu)博生物科技有限公司；單克隆抗體，上海友科生物科技有限公司；羊抗鼠IgG，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；全脂羊奶粉、脫脂羊奶粉，實(shí)驗(yàn)室自制；液態(tài)羊乳，本地牧場(chǎng)；配方羊奶粉，本地超市購(gòu)買。其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司（芬蘭）；移液槍，德國(guó)Brand 公司；酶標(biāo)板（聚苯乙烯板）96 孔，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；Smart系列超純水儀，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；101-2A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀MK3，熱電（上海）儀器有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗體制備

以牛β-乳球蛋白為免疫原，采用腹腔注射法免疫BALB/c 小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，篩選能穩(wěn)定分泌β-lg 單克隆抗體的細(xì)胞株，通過(guò)小鼠體內(nèi)誘生腹水法可以大量制備單克隆抗體，并對(duì)抗體的純度進(jìn)行鑒定。

1.3.2 抗體效價(jià)及親和力的測(cè)定

用碳酸鹽包被緩沖液（0.05 mol/L，pH 9.6）包被抗原（200 μL/孔），4 ℃放一夜，第二天，先倒出板內(nèi)前一天包被的液體，然后用300 μL PBST 溶液進(jìn)行洗滌，洗滌三次，每次3 min；每孔加100 μL 明膠進(jìn)行封閉，在37 ℃烘箱內(nèi)放置50 min，同上述洗滌一樣，加入抗體，100 μL/孔，37 ℃恒溫于濕盒內(nèi)孵育1.5 h，洗滌同上，加羊抗鼠酶標(biāo)二抗，100 μL/孔，再次于恒溫箱中孵育1.5 h，洗滌后加入顯色液和終止液，用酶標(biāo)儀在450 nm 的波長(zhǎng)下，測(cè)定其吸光值。

利用間接ELISA 測(cè)單抗親合力。牛β-lg 按5、2.5、1.25、0.625 μg/mL 包被酶標(biāo)板。單克隆抗體從10 倍開(kāi)始倍比稀釋。以單克隆抗體（mol/L）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、OD450nm為縱坐標(biāo)，繪制4 條S 形曲線。以S 形曲線的頂部為最大光密度ODmax，求出各曲線50%ODmax 對(duì)應(yīng)的單克隆抗體濃度（IC50，mol/L）。將4個(gè)濃度兩兩分組，根據(jù)公式計(jì)算親合力常數(shù)。

式中：Ka 為親合力常數(shù)；n 為每組中兩個(gè)包被抗原濃度的倍數(shù)；[Ab’]t 和[Ab]t 分別為每組中兩條曲線IC50 對(duì)應(yīng)的抗體濃度（mol/L）。

1.3.3 單抗特異性分析

以牛α-CN、羊α-CN、牛α-LA（α-Lactalbumin，α-LA）和牛血清白蛋白（BSA）為抗原，一抗為牛β-lg 單抗，二抗為酶標(biāo)羊抗鼠，以陰性血清作為對(duì)照，采用間接ELISA 法進(jìn)行測(cè)定，步驟參照小鼠血清效價(jià)的方法。

1.3.4 膠體金的制備和表征

用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金。100 mL 去離子水放在磁力攪拌器上加熱攪拌，沸騰后加入2 mL 1%氯金酸，煮沸后再迅速加入1 mL 1%檸檬酸三鈉溶液顏色變?yōu)榉€(wěn)定的酒紅色，冷卻后定容至100 mL，置于4 ℃避光保存。

1.3.4.1 最適標(biāo)記膠體金PH 值確定

取5 個(gè)1.5 mL 的EP 管，加入1 mL 膠體金，分別加入5、10、15、20、25 μL 0.02 M 的K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH，再分別加入4 μL 單抗，混勻放在4 ℃靜置20 min，加入100 μL 10% NaCl 溶液，混勻靜置10 min，觀察EP 管顏色變化，使溶液保持紅色的最低pH 值確定為最適pH 值。

1.3.4.2 最適標(biāo)記抗體濃度

取6 個(gè)1.5 mL 的EP 管，各加入1 mL 膠體金溶液，分別加入0.02 M K2CO3溶液10 μL，分別加入濃度50、25、12.5、6.25、3.1、1.5 μg/mL 的單抗5 μL?；靹蜢o置20 min，加入100 μL 10% NaCl 溶液，混勻靜置10 min，觀察EP 管顏色變化，使溶液保持紅色的最低pH 值確定為最適抗體濃度。

1.3.4.3 最適標(biāo)記抗體量

取6 個(gè)1.5 mL 的EP 管，各加入1 mL 膠體金溶液，分別加入0.02 M K2CO3溶液10 μL，分別加入濃度25 μg/mL 的單抗2、3、4、5、6、7 μL?；靹蜢o置20 min，加入100 μL 10% NaCl 溶液，混勻靜置10 min，觀察EP 管顏色變化，使溶液保持紅色的最低pH 值確定為最適抗體量。

1.3.5 膠體金試紙條的方法的建立

1.3.5.1 金標(biāo)墊和金標(biāo)溶液的制備

向10 mL 離心管中加入1 mL 膠體金溶液，加入最適K2CO3溶液，再加入最適濃度的單抗，混勻靜置20 min，加入20.0 μL 20%的BSA，混勻靜置20 min。4 ℃，10000 r/min 離心10 min，棄上清，使用金標(biāo)抗體復(fù)溶液200 μL 進(jìn)行復(fù)溶。

將玻璃纖維素膜裁剪成2 cm×1.4 cm大小的條帶，把制備的膠體金標(biāo)溶液均勻的覆蓋在玻璃纖維素膜條帶上，置于37 ℃烘箱烘干，4 ℃保存。

1.3.5.2 NC 膜的處理

將硝酸纖維素膜裁剪成2 cm×2 cm 大小的條帶，離膜上端0.75 cm 處用劃膜機(jī)包被1 mg/mL 的單克隆抗體作為檢測(cè)線，離膜下端0.5 cm 處包被l mg/mL 的羊抗鼠IgG二抗作為質(zhì)控線。置于37 ℃烘箱烘干，4 ℃保存。

1.3.5.3 膠體金試紙條的組裝

在PVC 板上依次粘貼NC 膜、金標(biāo)墊、樣品墊、吸水墊，各部分重疊約2 mm，用切條機(jī)切成0.5 cm寬的試紙條，裝入塑料外殼中。

1.3.6 試紙條靈敏度測(cè)試

用PBS 將牛β-lg 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至100、50、25、12.5、6.75、3.37、1.6 μg/mL。各加100 μL 于加樣處，反應(yīng)15 min，觀察NC 膜的顯色情況，以T 線顯色最淺時(shí)的稀釋度作為試紙條最低檢測(cè)濃度。

1.3.7 試紙條特異性測(cè)試

用PBS 緩沖液配制12 μg/mL 牛α-CN，β-CN，k-CN，BSA，α-LA，β-lg 標(biāo)品溶液。用試紙條檢測(cè)不同蛋白溶液，觀察NC 膜的顯色情況。

1.3.8 脫脂羊乳摻假的間接ELISA 法

向脫脂羊乳中加入脫脂牛乳，加入的體積分?jǐn)?shù)分別為0%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%，以摻入后的樣本為檢測(cè)目標(biāo)，采用間接ELISA 法進(jìn)行檢測(cè)，觀察牛乳摻入量與吸光值的關(guān)系，操作如1.3.2.

1.3.9 牛羊乳混合樣品及市售羊乳的檢測(cè)

向羊乳中分別加入1%、2%、5%、10%、30%、40%、60%、80%、100%的牛乳形成牛羊乳混合樣品。收集市售全脂羊乳粉及嬰幼兒配方羊乳粉樣本7 個(gè)（全脂羊奶粉，液態(tài)羊奶，配方羊奶粉），用所制備的試紙條檢測(cè)，并和ELISA 檢測(cè)方法做對(duì)照。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

單克隆抗體效價(jià)、特異性、親和力的測(cè)定均做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果以平均值表示，文中圖表采用Excel 2010 和Origin 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-lg 單克隆抗體純度的鑒定結(jié)果

篩選6 株細(xì)胞株用做亞克隆并制備單克隆抗體，編號(hào)為1-6，用SDS-PAGE 的方法檢測(cè)純化后的單克隆抗體純度。由圖1 可知，2-7 號(hào)泳道單抗的電泳圖譜只有2 個(gè)條帶，分子量分別為26 ku 和50 ku，和標(biāo)準(zhǔn)IgG 一致，表明純化后的抗體純度較高。Quantity One 軟件對(duì)泳道的條帶進(jìn)行分析，得出抗體純度都在90%以上，可用于進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

圖1 單抗純度鑒定結(jié)果Fig.1 Etermination of mouse antiserum titer

2.1.1 抗體效價(jià)和親和力的測(cè)定

圖2 單抗效價(jià)的檢測(cè)Fig.2 Monoclonal antibody titer assay

圖3 親和力測(cè)定結(jié)果Fig.3 Affinity measurement result

單抗效價(jià)檢測(cè)采用間接ELISA 法。由圖2 可知，這6 株單抗的效價(jià)均達(dá)到10000 以上，其中單抗4 的效價(jià)最高為 1:1.28×106，單抗 6 的效價(jià)最低為1:2.0×104。單抗4 的效價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他5 種單抗，如圖3 所示，經(jīng)計(jì)算，單抗4 的親和力常數(shù)為2.6×107，是高親和力抗體。因此本試驗(yàn)選擇效價(jià)高親和力高的抗體4 作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

2.1.2 單抗特異性鑒定結(jié)果

由表1 可知，牛β-lg 單克隆抗體與牛α-CN、羊α-CN、牛α-LA、牛β-lg 和BSA 發(fā)生反應(yīng)，算得P/N值都小于2.1，說(shuō)明該試驗(yàn)制得的單抗特異性高。

表1 單克隆抗體特異性Table 1 The immune scheme for mouse

2.2 膠體金的制備和表征

2.2.1 膠體金的鑒定

圖4 膠體金顆粒性質(zhì)Fig.4 Properties of colloidal gold nanoparticles

圖4a 為膠體金和免疫金的紫外-可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描，體系的最大吸收波長(zhǎng)和半峰寬并無(wú)明顯變化，說(shuō)明標(biāo)記結(jié)果穩(wěn)定。金納米粒徑為30～40 nm 之間最適合應(yīng)用于膠體金免疫層析檢測(cè)[15]。通過(guò)透射電鏡掃描，本實(shí)驗(yàn)所獲得的膠體金顆粒直徑為30 nm，適合用于抗體標(biāo)記。

2.2.2 最適標(biāo)記膠體金pH 值

圖5 膠體金標(biāo)記β-lgmAb 的最適pH 值的確定Fig.5 Determination of the optimal pH value of colloidal gold labeled β-lgmAb

抗體加進(jìn)膠體金后，其活性和結(jié)合效率受pH 值的影響[16]。但是金納米粒會(huì)對(duì)pH 計(jì)的電極有影響[17]，故本實(shí)驗(yàn)采用不同體積的0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH 值。如圖5a 所示，隨著K2CO3加入量的增加，免疫金的顏色也從藍(lán)紫色變?yōu)榫萍t色，通過(guò)同樣條件檢測(cè)（T 線1 mg/mL，C 線0.5 mg/mL，陰性為0.01 mol/L PBS 緩沖液，陽(yáng)性為50 μg/mL 牛β-lg 溶液），選擇陰性T 線顯色明顯，陽(yáng)性T 線褪色明顯的條件。如圖5b，選擇1.0 mL 膠體金溶液中加入0.2 mol/L 的K2CO3溶液10.0 μL。

2.2.3 最適標(biāo)記抗體濃度

圖6 膠體金標(biāo)記β-lgmAb 的最適抗體濃度的確定Fig.6 Determination of optimal antibody concentration of colloidal gold labeled β-lgmAb

在1.0 mL 膠體金中加入不同濃度β-lg 抗體，通過(guò)同樣條件檢測(cè)（同上），由圖6b 可知，抗體加入濃度小于3.13 μg/mL 時(shí)，T 線顏色不明顯，當(dāng)抗體濃度為12.5 μg/mL 時(shí)，T 線顏色明顯。當(dāng)T 線和C 線顯色明顯時(shí)，抗體用量越少，T 線上包被的抗原與待測(cè)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)越激烈，試紙條的反應(yīng)性越高[18]。當(dāng)標(biāo)記抗體濃度為12.5 μg/mL 時(shí)，符合檢測(cè)要求，而且在后期實(shí)驗(yàn)中有很好的穩(wěn)定性。

2.2.4 最適標(biāo)記抗體量

在1.0 mL 膠體金中加入不同體積的β-lg 抗體，通過(guò)同樣條件檢測(cè)（同上），由圖7a 可知，膠體金顏色為酒紅色，顏色穩(wěn)定不再變化，如圖7b 所示，標(biāo)記的抗體加入體積小于5.0 μL 時(shí)陰性T 線顏色不明顯，當(dāng)抗體加入量為6.0 μL 時(shí)陰性T 線顯色明顯。當(dāng)標(biāo)記抗體量6.0 μL 時(shí)，能滿足檢測(cè)要求。因此選擇1.0 mL膠體金溶液中加入6 μL 抗體進(jìn)行標(biāo)記。

圖7 膠體金標(biāo)記β-lgmAb 的最適抗體量的確定Fig.7 Determination of the optimal amount of antibody to colloidal gold labeled β-lgmAb

2.3 試紙條靈敏度試驗(yàn)

從圖8 和表2 可知，β-lg 濃度增加，NC 膜上T線顏色逐漸變淺。當(dāng)樣本中β-lg 濃度為0.78 μg/mL 和1.56 μg/mL 時(shí)，NC 膜的顏色清晰；當(dāng)β-lg 濃度大于3.13 μg/mL 時(shí)，NC 膜上T 線上沒(méi)有顏色，是因?yàn)闄z測(cè)溶液中的β-lg 與金標(biāo)抗體反應(yīng)，形成金標(biāo)抗體復(fù)合物，該復(fù)合物經(jīng)過(guò)NC 膜時(shí)，與T 線上的抗原結(jié)合較少，顏色會(huì)越來(lái)越淺。因此本試驗(yàn)牛β-lg 濃度為3.13 μg/mL 作為最低檢測(cè)限。

He[19]以β-LG 為抗原制備單克隆抗體，并建立間接ELISA 法來(lái)檢測(cè)牛乳，不僅有較高的特異性，靈敏度為5 μg/mL。ELISA 檢測(cè)方法特異性高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但該方法耗時(shí)，不適用在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本試驗(yàn)是以牛β-lg 為抗原制備單克隆抗體，并研制膠體金免疫層析試紙條，靈敏度是3.13 μg/mL。該方法提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，更適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

圖8 β-lg 快速檢測(cè)試紙條的靈敏度Fig.8 Detection limit of β-lg rapid test strip

表2 試紙條反應(yīng)性檢測(cè)的結(jié)果Table 2 The reactivity test results of the strip

2.4 試紙條特異性試驗(yàn)

圖9 β-lg 快速檢測(cè)試紙條的特異性Fig.9 Specificity of β-lg rapid test strip

用該試紙條檢測(cè)其他蛋白溶液，結(jié)果如圖9 和表3。由表3 和圖9 可知，檢測(cè)β-lg 溶液的試紙條T 線不顯色，其他五種蛋白溶液的檢測(cè)試紙條T 線均有顏色。這是因?yàn)棣?lg 溶液中的抗原與金標(biāo)抗體發(fā)生反應(yīng)，形成金標(biāo)抗體抗原復(fù)合物，移至NC 膜檢測(cè)線T 上時(shí)，T 線上的抗原表位沒(méi)有與抗體結(jié)合。其他五種蛋白溶液的檢測(cè)線上有顏色是因?yàn)槿芤褐械牡鞍卓乖瓫](méi)有與抗體發(fā)生反應(yīng)，當(dāng)金標(biāo)抗體經(jīng)過(guò)NC 膜上T 線時(shí)，金標(biāo)抗體被固定下來(lái)，膠體金顆粒發(fā)生聚集，在T 線上顯色紅色條帶。說(shuō)明該試紙條對(duì)β-lg 有良好的特異性。

表3 試紙條特異性檢測(cè)Table 3 Test strip specificity

2.5 間接ELISA 法檢測(cè)脫脂牛羊乳混合樣品

圖10 脫脂牛羊乳混合樣品的吸光值Fig.10 Absorbance value of mixed sample of skim cow and goat milk

如圖10 所示，把不同體積分?jǐn)?shù)的牛乳摻入脫脂羊乳中，隨著摻入牛乳體積分?jǐn)?shù)的增大，吸光值在逐漸增大，原因是牛乳蛋白質(zhì)在ELISA 板上吸附牢固，不易被洗掉，可以與抗體發(fā)生反應(yīng)的蛋白抗原多，吸光值升高；當(dāng)摻入量增加到40%以上后，吸光度在逐漸減小，是因?yàn)榕Ｈ榈鞍踪|(zhì)含量太高，在包被過(guò)程中，形成多層吸附，在洗板時(shí)，ELISA 板上的蛋白質(zhì)大都被洗掉，能與抗體發(fā)生反應(yīng)的蛋白抗原減少，吸光值降低。

2.6 競(jìng)爭(zhēng)法試紙條檢測(cè)脫脂牛羊乳混合樣品

由圖11 和表4 可知，隨著牛乳摻入量的增加，NC 膜上T 線的顏色由深變淺，再到看不見(jiàn)。加入1%脫脂牛乳時(shí)，NC 膜T 線顏色清晰；加入2%牛乳時(shí)，NC 膜上C 線的顏色變淡；可以檢測(cè)出羊乳中摻假的牛乳。當(dāng)加入的牛乳量大于5%時(shí)，NC 膜上T 線不顯色，這是因?yàn)榧尤肱Ｈ榈牧吭龆鄷r(shí)，能和抗體反應(yīng)的抗原多，可以與T 線上的抗原反應(yīng)的金標(biāo)抗體減少了，顏色就會(huì)變淺直至沒(méi)有。所以脫脂羊乳中加入5%的脫脂牛乳是該試紙條的最小檢測(cè)限。

圖11 牛羊乳摻假檢測(cè)Fig.11 Detection of milk adulteration

表4 牛羊乳摻假檢測(cè)Table 4 Detection of milk adulteration

Bulent 等[20]以牛IgG 為抗原，獲得特異性高，與羊乳交叉反應(yīng)小的單克隆抗體，并研制了膠體金免疫層析試紙條，該法可準(zhǔn)確檢出樣品中牛乳IgG 含量，確定牛乳IgG 的最小檢測(cè)濃度為60.5 μg/mL。張歡等[21]以牛β-lg 為研究對(duì)象，建立了競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析法，并檢測(cè)了羊乳中乳蛋白含量，可在3～10 min 內(nèi)出結(jié)果，得出最低檢出限為2%。本試驗(yàn)以牛β-lg 為抗原制備高特異性單克隆抗體，并建立競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析法，檢測(cè)了羊乳中牛β-lg 含量，得出最低檢測(cè)限為5%。

2.7 市售羊乳制品的摻假結(jié)果

圖12 羊乳制品的檢測(cè)Fig. 12 Detection of sheep milk products

用試紙條檢測(cè)采買的羊乳及其制品。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖12。結(jié)果顯示7 個(gè)樣品中，4 個(gè)顯示陽(yáng)性，表明這些樣品均有牛乳蛋白成分。同時(shí)，用牛乳蛋白ELISA試劑盒檢測(cè)，兩種檢測(cè)方法結(jié)果一致（表5），表明本方法結(jié)果準(zhǔn)確可靠。3 個(gè)陰性樣本，配料表上標(biāo)注了“生羊乳，羊奶粉”，而陽(yáng)性樣本配料表上均未表明乳清蛋白的動(dòng)物來(lái)源，只標(biāo)注“脫鹽乳清粉”。故陽(yáng)性樣本中的蛋白可能來(lái)自“脫鹽乳清粉或濃縮乳清蛋白粉”。該試紙條檢測(cè)實(shí)際樣品的結(jié)果表明，它可以應(yīng)用在羊乳及其制品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

表5 免疫層析法和ELISA 檢測(cè)結(jié)果的比較Table 5 Comparison of immunochromatography and ELISA results

3 結(jié)論

本試驗(yàn)根據(jù)半固體培養(yǎng)基的方法來(lái)進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的融合，篩選了6 株雜交瘤陽(yáng)性細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，腹腔法來(lái)獲得單克隆抗體，并對(duì)單克隆抗體的特性進(jìn)行鑒定，最后得到了純度高達(dá)90%，效價(jià)都在10000 以上，且特異性很高。研制了可快速檢測(cè)牛β-lg的膠體金免疫層析試紙條。該試紙條成本低廉，穩(wěn)定性良好，檢測(cè)范圍廣，樣品前處理簡(jiǎn)單，點(diǎn)樣后5 min后裸眼即可判定結(jié)果，對(duì)β-lg的LOD值是3.13 μg/mL，脫脂羊乳中摻假脫脂牛乳的LOD 值是0.5%。通過(guò)對(duì)市售羊乳制品檢測(cè)，結(jié)果和商品化ELISA 試劑盒一致，故本試驗(yàn)研制的免疫層析試紙條可用于摻雜牛乳的羊乳及其制品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。