液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定山銀花中有機(jī)酸和黃酮類化合物的含量

史穎珠，侯建波，謝文，錢艷，黃超群，張雅琴，劉翠平，張輝

（1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

（2.杭州海關(guān)技術(shù)中心，浙江杭州 310016）（3.浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院，浙江杭州 310016）

山銀花是從忍冬科植物灰氈毛忍冬Lonicera macranthoidesHand.-Mazz.，紅腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.，華南忍冬Lonicera confusaDC.或黃褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C. Cheng 的干燥花蕾或帶初開的花，并在夏初花開放前采收獲得，自《中國(guó)藥典》2005 年版起，與金銀花進(jìn)行區(qū)分。具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱的功效，可用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱[1]。也具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[2-5]。因此，2014 年正式被國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委批準(zhǔn)為“按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)”[6,7]。

圖1 有機(jī)酸和黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structures of investigated organic acids and flavonoids

研究發(fā)現(xiàn)山銀花的有效成分除綠原酸，灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙外，還有黃酮類化合物、揮發(fā)油類化合物、有機(jī)酸類和三萜類化合物[8-12]，研究人員通過HPLC，LC-MS/MS、高分辨質(zhì)譜法和波譜學(xué)等方法來測(cè)定和鑒別山銀花中各成分的結(jié)構(gòu)和含量[13-15]，以及開展指紋圖譜、產(chǎn)品和品種的鑒別研究[16-20]。目前已發(fā)表的分析方法中除高分辨質(zhì)譜儀檢測(cè)可一次性篩查出山銀花中較多的有效成分外，其他檢測(cè)均較難獲得很多有效成分信息。但高分辨質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴，影響了它的應(yīng)用范圍。本文通過文獻(xiàn)調(diào)研篩選出山銀花中4 種主要有機(jī)酸和14 種黃酮類化合物，采用酸性甲醇溶液超聲提取，HLB 固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，建立了如圖1 所示的山銀花中綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮素、蘆丁、木犀草素、木犀草苷、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆樹苷、黃芩素、黃芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香葉木素、白楊素和山奈素含量測(cè)定的方法，實(shí)現(xiàn)了山銀花中主要的4種有機(jī)酸和14種黃酮類化合物含量的同時(shí)測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器設(shè)備

API 4000 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源ESI，AB 公司，美國(guó)）；1100 型液相色譜儀（Agilent公司，美國(guó)）；Milli-Q Synergy 185 超純水器（Millipore公司，美國(guó)）；IKA MS3 Basic 型渦旋器（IKA 公司，德國(guó)）；24 孔固相萃取裝置（Supelco 公司，美國(guó)）；Heraeus Multifuge X1R 型臺(tái)式離心機(jī)（Thermo 公司，美國(guó)）；P 300 H 型超聲波清洗機(jī)（Elma 公司，德國(guó)）；G&G JJ500 型電子天平（雙杰公司產(chǎn)品，中國(guó)）；Mettler AE260 型電子天平（Mettler Toledo 公司產(chǎn)品，瑞士）。

1.1.2 主要耗材和試劑

甲醇（色譜純），Tedia 公司；甲酸（質(zhì)譜級(jí)），Scharlau 公司；乙腈（色譜純），Scharlau 公司；鹽酸（優(yōu)級(jí)醇），永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；叔丁基對(duì)苯二酚（tert-Butylhydroquinone，簡(jiǎn)稱：TBHQ，分析純），Aladdin 公司；L-(+)-抗壞血酸（L(+)-Ascorbic acid，分析純），廣東光華科技股份有限公司；CNW C18固相萃取柱（6 mL，500 mg），Anpel 公司；Waters HLB 固相萃取柱（6 mL，200 mg），Waters 公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：綠原酸（純度99.9%），ANPEL 公司；咖啡酸（純度98.1%），ANPEL 公司；異綠原酸A（純度98.8%），ANPEL 公司；異綠原酸C（純度99.5%），ANPEL 公司；槲皮素（純度96.4%），ChromaDex公司；蘆丁（純度95.0%），TRC 公司；木犀草素（純度96.9%），ChromaDex 公司；木犀草苷（純度98.9%），ANPEL 公司；山萘酚（純度95.5%），中國(guó)食品藥品檢定研究院、紫云英苷（純度99.1%），ANPEL 公司；芹菜素（純度98.5%），Bepure 公司；野漆樹苷（純度98.9%），ANPEL 公司；黃芩素（純度99.2%），ANPEL 公司；黃芩苷（純度96.8%），ChromaDex公司；槲皮素-3-甲基醚（純度97.0%），TRC 公司；香葉木素（純度97.8%），ChromaDex 公司；白楊素（純度98.0%），TRC 公司；山奈素（純度97.8%），ChromaDex 公司。用甲醇將各化合物固體標(biāo)準(zhǔn)品溶解，稀釋并定容獲得10 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)需要用甲醇將其儲(chǔ)備液稀釋至所需濃度。

1.1.3 儀器工作條件

色譜參數(shù)：色譜柱：Mightysil RP-18，3 μm，4.6×150 mm，流動(dòng)相：甲醇（A）-0.15%甲酸溶液（B），流動(dòng)相梯度洗脫程序：0～10.0 min時(shí)40%（A）線性增加至75%；10.0～15.0 min時(shí)75%（A）線性增加至90%；15.0～22.0 min時(shí)90%（A）保持不變；22.0～23.0 min線性下降至40%（A）；23.0～30.0 min 40%（A）進(jìn)行系統(tǒng)平衡；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫25 ℃。

質(zhì)譜參數(shù)：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描模式：負(fù)離子掃描；監(jiān)測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）：-4500 V；霧化氣壓力（GS1）：289 kPa（42 psi）；氣簾氣壓力（GS2）：310 kPa（45 psi）；輔助氣流速（CUR）：172 kPa（25 psi）；離子源溫度（TEM）：540 ℃，駐留時(shí)間30 ms；其它質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 各化合物基本信息及質(zhì)譜測(cè)定條件Table 1 Standard information and optimized mass spectrometric parameters of compounds

1.1.4 試驗(yàn)方法

稱取0.5 g 試樣（精確到0.01 g）置于50 mL 具塞離心管中，加0.5 g TBHQ，加入40 mL 50%的甲醇溶液，渦旋均勻，超聲40 min（100 W，37 kHz，30 ℃），靜置冷卻至室溫后，于8500 r/min 高速離心5 min，濾紙過濾上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，加水定容至50 mL，混勻，取1 mL 加8.5 mL 水和0.5 mL 濃鹽酸，渦旋混勻并轉(zhuǎn)移至HLB 固相萃取柱中（依次用5 mL甲醇和5 mL 5%甲醇溶液活化），加入5 mL 5%甲醇溶液淋洗，抽干，加10 mL 甲醇進(jìn)行洗脫，控制流速1～2 mL/min，收集全部洗脫液，定容至10 mL，搖勻，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，取1.0 mL 定容溶液，加40%的甲醇溶液稀釋定容至25 mL，混合均勻，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)驗(yàn)溶液通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)試，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y 為縱坐標(biāo)，以待測(cè)物質(zhì)量濃度X（g/kg）為橫坐標(biāo)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并對(duì)實(shí)驗(yàn)溶液進(jìn)行定量計(jì)算。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

本試驗(yàn)參考中國(guó)藥典的方法[1]，采用超聲方式進(jìn)行提取，并考察了超聲波清洗儀參數(shù)、抗氧化劑對(duì)提取情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲頻率在37 kHz 和80 kHz，有效功率100 W，對(duì)提取結(jié)果顯示無明顯差別。比較超聲時(shí)間在10、20、30、40、50、60 min 的提取情況，在40 min 時(shí)的回收率最高，當(dāng)超聲時(shí)間大于40 min 后，山銀花本底中的綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A 和異綠原酸C 含量，和通過外部添加方式加入的黃芩素和黃芩苷回收率下降10%～15%。對(duì)比TBHQ和抗壞血酸兩種不同抗氧化劑的保護(hù)情況，結(jié)果表明，在沒有抗氧化劑的情況下，山萘酚的回收率低于70%，在TBHQ加入后，山萘酚的回收率可以達(dá)到80%以上，山奈素回收率提高約10%。綜上情況，最終選擇超聲頻率37 kHz，有效功率100 W，超聲時(shí)間40 min，50%甲醇溶液，TBHQ 保護(hù)下開展提取實(shí)驗(yàn)。

2.2 凈化條件的選擇

本試驗(yàn)考察了C18和HLB 兩種類型固相萃取柱的凈化情況，以降低基質(zhì)效應(yīng)對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量測(cè)定的基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。取1 mL 200 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液（50%甲醇溶液，0.5 g TBHQ），加入9 mL 水，考察鹽酸濃度分別為0%、2.5%、5%、10%、15%的凈化情況，混勻上樣后，采取5 mL 的10%、20%、30%、40%、50%甲醇溶液進(jìn)行淋洗和10 mL 甲醇進(jìn)行洗脫。結(jié)果如圖2 所示，酸性環(huán)境有助于提高固相萃取凈化時(shí)化合物的穩(wěn)定性，不加鹽酸時(shí)蘆丁、木犀草素、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆樹苷、黃芩素、槲皮素-3-甲基醚和香葉木素的凈化回收率均低于含有鹽酸的情況，對(duì)不同濃度的鹽酸考察發(fā)現(xiàn)，鹽酸濃度5%時(shí)化合物回收率整體較好。淋洗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在甲醇含量為20%時(shí)，在C18固相萃取柱中綠原酸和咖啡酸會(huì)被洗脫，在HLB 固相萃取柱中，甲醇含量大于30%時(shí)綠原酸和咖啡酸會(huì)被洗脫，HLB固相萃取柱的凈化回收率和穩(wěn)定性好于C18固相萃取柱。因此試驗(yàn)采用HLB 固相萃取柱，甲醇溶液上樣（含有5%鹽酸），5%甲醇淋洗，甲醇洗脫的方式進(jìn)行凈化。

圖2 不同鹽酸濃度在HLB 固相萃取柱中的凈化情況對(duì)比圖Fig.2 The results of different HCl concentrations in HLB solid phase extraction columns

2.3 色譜條件的考察

實(shí)驗(yàn)對(duì)比Mightysil RP-18，3 μm，4.6×150 mm 或Inertsil ODS-3，3 μm，4.6×150 mm 色譜柱，甲醇或乙腈為有機(jī)相，0.15%甲酸溶液或水為水相對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離情況。結(jié)果表明，相同色譜條件下，綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C 在Mightysil RP-18 的分離效果好于Inertsil ODS-3，黃芩苷在Mightysil RP-18 為分離柱時(shí)譜峰峰形更好，信號(hào)提升約4 倍。因此采用Mightysil RP-18 為分離柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。在相同色譜柱和流動(dòng)相梯度洗脫程序下，甲醇為有機(jī)相時(shí)大部分化合物的信號(hào)響應(yīng)和峰形好于乙腈有機(jī)相（其中野漆樹苷、蘆丁、木犀草苷在甲醇為流動(dòng)相時(shí)信號(hào)響應(yīng)提升3～5 倍），綜合考慮前處理采用甲醇進(jìn)行洗脫凈化，因此采用甲醇為有機(jī)相對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。對(duì)比相同色譜柱下甲醇為有機(jī)相，水和0.15%甲酸溶液為水相的分離情況，以Mightysil RP-18 色譜柱為例，在0.15%甲酸溶液中信號(hào)的峰形和響應(yīng)好于水（其中綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C 和黃芩素在含0.15%甲酸時(shí)信號(hào)提升5 倍以上）。綜上情況，實(shí)驗(yàn)以Mightysil RP-18為分離柱，甲醇和0.15%甲酸溶液為流動(dòng)相，分析結(jié)果如圖3 所示，該條件下相近離子對(duì)的化合物如異綠原酸A 和異綠原酸C，山奈素和香葉木素可以實(shí)現(xiàn)很好的分離。

2.4 質(zhì)譜條件的考察

實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射的方式在負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描獲得準(zhǔn)分子離子峰，再以準(zhǔn)分子離子峰為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描。按照歐盟EC/657指令和《質(zhì)譜分析方法通則》的要求，選擇兩個(gè)特征子離子對(duì)目標(biāo)化合物定量確證，以信噪比高、峰形好、干擾小的離子對(duì)作為定量離子對(duì)。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)負(fù)離子模式下優(yōu)化的各質(zhì)譜參數(shù)和最佳質(zhì)譜條件參見表1。

圖3 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法分離結(jié)果（2 ng/mL）Fig.3 The separation result of LC-MS/MS

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的考察

試驗(yàn)通過計(jì)算離子抑制率的方式來考察基質(zhì)效應(yīng)情況[21]。[離子抑制率/%=（溶劑工作液中響應(yīng)強(qiáng)度-基質(zhì)加標(biāo)溶液響應(yīng)強(qiáng)度）×100%/溶劑工作液中響應(yīng)強(qiáng)度]。測(cè)試相同濃度（40 ng/mL）的溶劑工作液和基質(zhì)加標(biāo)溶液中各化合物的信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度，如表2 所示，各化合物離子抑制率均小于15%，即試驗(yàn)條件下獲得的基質(zhì)溶液無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，因此采用甲醇-0.15%甲酸溶液（體積比4:6）稀釋獲得線性工作曲線溶液進(jìn)行定量計(jì)算。

2.6 方法的線性關(guān)系，定量限和回收率實(shí)驗(yàn)

在確定實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)，方法定量限（以S/N＞10 計(jì)）0.005 g/kg（槲皮素、蘆丁、木犀草苷、紫云英苷、芹菜素、黃芩苷和槲皮素-3-甲基醚），0.025 g/kg（木犀草素、野漆樹苷、香葉木素和山奈素）和0.05 g/kg（綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C、山奈酚、黃芩素和白楊素）。對(duì)濃度0.05、0.10、0.20、0.50 和1.00 g/kg 的線性工作曲線溶液進(jìn)行測(cè)試，以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積Y 為縱坐標(biāo)，以待測(cè)物質(zhì)量濃度X（g/kg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如表3 所示，線性方程的相關(guān)系數(shù)r2大于0.993。

表2 山銀花基質(zhì)對(duì)各化合物的基質(zhì)效應(yīng)情況Table 2 The matrix effect of Lonicerae flos on the investigated compounds (n=3)

表3 待測(cè)化合物的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 The linear equation and correlation coefficients (r2) of compounds

表4 山銀花中3 個(gè)水平下的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 The results of recoveries and correlation coefficients (n=6)

注：回收率=（測(cè)定結(jié)果-空白值）/添加濃度×100%。

表5 山銀花中有機(jī)酸和黃銅類化合物含量測(cè)定結(jié)果Table 5 The contents of organic acid and flavonoids in Lonicerae flos

對(duì)山銀花樣品（樣品含綠原酸21.0 g/kg，咖啡酸1.50 g/kg，異綠原酸A 11.2 g/kg，異綠原酸C 10.3 g/kg），進(jìn)行3 個(gè)濃度水平的添加回收實(shí)驗(yàn)（添加水平綠原酸10.0、20.0 和40.0 g/kg，咖啡酸1.0、2.0 和4.0 g/kg，異綠原酸A 和異綠原酸C 5.0、10.0 和20.0 g/kg，其他化合物0.05、0.10 和0.20 g/kg），每個(gè)濃度水平取6 個(gè)平行樣。測(cè)定綠原酸，咖啡酸，異綠原酸A 和異綠原酸C 時(shí)，將測(cè)試溶液進(jìn)行稀釋至溶液濃度在線性范圍內(nèi)。結(jié)果如表4 所示，采用外標(biāo)法定量，方法總體回收率69.2%～116%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：3.3%～12.0%。

2.7 實(shí)際樣品測(cè)試

應(yīng)用實(shí)驗(yàn)方法對(duì)11 個(gè)山銀花進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表5 所示，山銀花中綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C的含量最高，其次是木犀草苷和紫云英苷。樣品中有8 個(gè)化合物（山奈酚、野漆樹苷、黃芩素、黃芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香葉木素、白楊素和山奈素）含量低于方法定量限。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過甲醇溶液超聲提取，酸性溶液上樣，HLB 固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)，外標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)山銀花中18 種主要有機(jī)酸和黃酮類化合物（綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸C、槲皮素、蘆丁、木犀草素、木犀草苷、山奈酚、紫云英苷、芹菜素、野漆樹苷、黃芩素、黃芩苷、槲皮素-3-甲基醚、香葉木素、白楊素和山奈素）含量的測(cè)定。對(duì)11 個(gè)山銀花樣品的測(cè)定結(jié)果顯示綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草苷和紫云英苷是其主要成分。研究結(jié)果對(duì)后續(xù)分析各化合物含量與藥物活性關(guān)系，山銀花品質(zhì)和品種研究具有重要的輔助作用。