中藥促骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展

李 姣，黃委委，陶 林，張 磊，楊 鋒

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046；3.陜西高校青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，陜西 咸陽 712046）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs) 作為骨髓中的多能干細(xì)胞，在一定的誘導(dǎo)條件下能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等成熟細(xì)胞，其多向分化的潛能在連續(xù)傳代培養(yǎng)或冷藏后未受明顯影響，是目前發(fā)現(xiàn)的較為理想的種子細(xì)胞，在組織工程、再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。通過近些年對(duì)BMSCs 的研究，發(fā)現(xiàn)其在治療慢性骨科疾病，以及骨傷后的修復(fù)重建的優(yōu)勢(shì)愈發(fā)明顯。大量研究選用中藥作為誘導(dǎo)劑，較之以往應(yīng)用的化學(xué)物質(zhì)和細(xì)胞因子，能選擇的作用靶點(diǎn)更廣泛，且更加廉價(jià)實(shí)用。通過這些研究發(fā)現(xiàn)，中藥、中藥復(fù)方及其有效成分能夠顯著促進(jìn)BMSCs 向成骨分化，為臨床應(yīng)用中藥治療骨缺損性及其他骨科疾病提供了科學(xué)依據(jù)。本文特從單味中藥、中藥復(fù)方、中成藥及有效成分促BMSCs 成骨分化及其機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 單味中藥對(duì)BMSCs 成骨分化的作用與機(jī)制分析

許多中藥及其有效成分（如含藥血清、醇提物、水提物等），均能對(duì)BMSCs 的成骨分化起著積極作用。其中一些藥物可提高成骨細(xì)胞增殖，或降低、或抑制破骨細(xì)胞生成，或具有雙向調(diào)節(jié)的作用。

1.1 淫羊藿 淫羊藿作為傳統(tǒng)補(bǔ)腎中藥，具有溫補(bǔ)腎陽、強(qiáng)壯筋骨的作用。李智奎等[1]通過采用不同濃度的淫羊藿苷對(duì)SD 大鼠分子機(jī)制進(jìn)行研究，認(rèn)為淫羊藿苷通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因核心結(jié)合蛋白因子 2（runt-related transcription factor 2，Runx2）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和成骨功能基因骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達(dá)，或是對(duì)過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、降脂蛋白（Adipsin）和脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP4）的表達(dá)進(jìn)行抑制，從而促進(jìn)了大鼠BMSCs成骨分化，并對(duì)其成脂分化也有抑制作用。陳花英等[2]研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能上調(diào)高糖環(huán)境下的骨鈣素、骨橋蛋白和Ⅰ型膠原基因表達(dá)，通過抑制BMSCs 的凋亡進(jìn)而促進(jìn)成骨分化，且能對(duì)高糖環(huán)境下骨損傷的預(yù)后有所改善。

1.2 骨碎補(bǔ) 骨碎補(bǔ)為骨傷科常用中藥，具有補(bǔ)腎、活血、續(xù)傷、強(qiáng)骨的功效。其含藥血清、醇提液以及黃酮類物質(zhì)（主要包括柚皮苷和新北美圣草苷）都具有一定的抗骨質(zhì)疏松活性。陳云剛等[3]研究發(fā)現(xiàn)不同劑量（中等劑量為佳）骨碎補(bǔ)含藥血清通過激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，能明顯上調(diào)β-catenin、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（low-density lipoprotein related proteins 5，LRP5）、Runx2、Osterixm RNA 的表達(dá)，下調(diào)GSK-3β的表達(dá)，提高ALP 的活性，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)BMSCs 成骨分化的促進(jìn)作用。申意偉等[4]研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)活性成分柚皮苷對(duì)BMSCs 的成骨性分化、成骨細(xì)胞的增殖和鈣化成熟均有良好的促進(jìn)作用。

1.3 巴戟天 巴戟天為補(bǔ)陽藥，具有溫補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋健骨的功效。其有效成分包括巴戟天多糖、巴戟天多糖含藥血清及其水提取物等。賴滿香等[5]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天多糖能夠提高ALP 活性，并增加其礦化結(jié)節(jié)數(shù)，說明巴戟天多糖在一定程度上具有促進(jìn)大鼠BMSCs 增殖，以及分化為成骨細(xì)胞的能力。賴滿香等[6]另一組關(guān)于巴戟天多糖含藥血清的研究發(fā)現(xiàn)，其含藥血清在這一過程中通過上調(diào)核心結(jié)合因子ɑ-1（Cbfɑ-1mRNA）的表達(dá)，可能是促進(jìn)BMSCs 向成骨分化的有效機(jī)制之一。

1.4 杜仲 杜仲具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋骨之功效。杜仲槲皮素、山奈酚、醇提取物為其主要有效成分。陳林攀等[7]研究杜仲葉提取物槲皮素對(duì)SD 大鼠BMSCs增殖的影響及其分子機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素對(duì)BMSCs 增殖促進(jìn)作用，認(rèn)為其機(jī)制可能是槲皮素通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinas，ERK）磷酸化。林奇生等[8]研究杜仲醇提取物可提升BMSCs 內(nèi)RhoA/ROCK 信號(hào)路徑ROCK1、RhoA mRNA 表達(dá)量，從而促進(jìn)BMSCs 成骨分化和增殖。趙晶等[9]研究發(fā)現(xiàn)杜仲提取物山奈酚可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)BMSCs 分化為成骨細(xì)胞。

1.5 補(bǔ)骨脂 補(bǔ)骨脂是常用的補(bǔ)腎壯陽藥，香豆素類物質(zhì)為其主要有效成分。韓宇等[10]研究不同劑量補(bǔ)骨脂甲素通過調(diào)控cAMP/PKA/CREB 信號(hào)通路，上調(diào)PKA、CREB mRNA 及蛋白表達(dá)，促進(jìn)大鼠BMSCs 成骨分化及增值，其中以補(bǔ)骨脂甲素高劑量組作用效果最優(yōu)，這說明補(bǔ)骨脂甲素能夠促進(jìn)BMSCs向成骨分化，其主要機(jī)制可能是cAMP/PKA/CREB 信號(hào)通路的活化所誘導(dǎo)。韓宇等[11]另一研究為補(bǔ)骨脂素可能通過調(diào)控Hedgehog 信號(hào)通路，促使音猬因子（Ssonic hedgehog，Shh）、Gli 家族鋅指蛋白-1（Gli family zinc finger-1，Gli-1mRNA）表達(dá)上調(diào)，Ptch1mRNA 及蛋白表達(dá)下調(diào)，而促進(jìn)大鼠BMSCs 成骨分化及增殖。

1.6 女貞子 女貞子為常用滋陰藥，具有滋補(bǔ)腎陰，強(qiáng)腰膝的功效。女貞子主要活性成分是齊墩果酸、熊果酸、紅景天苷、苷元酪醇等。研究表明，女貞子通過對(duì)信號(hào)通路的基因轉(zhuǎn)錄激活或抑制，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增殖，且能抑制破骨細(xì)胞的活性，提高骨組織膠原數(shù)量[12]。戰(zhàn)美等[13]研究的女貞子提取物、20 μg/mL 特女貞苷、女貞苷G13 和油女貞苷，均能提高BMSCs 的ALP 活性，且20 μg/mL 3 種成分使鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增加，提高了骨鈣素（bone gla protein,BGP）、Runx2 和LRP6mRNA 表達(dá)。女貞子提取物及其3 種成分可能通過誘導(dǎo)Wnt/LRP6/β-catenin 通路的激活促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化，是發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松活性的主要機(jī)制。

1.7 黃芪 黃芪作為補(bǔ)藥之長(zhǎng)，具有補(bǔ)氣、生肌、利尿等功效。香豆素、黃酮類、黃芪多糖是其主要有效成分。研究表明，通過維生素D 軸（ⅤD/ⅤDR）對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（FGF23）-Klotho 軸的調(diào)控作用，能有效改善衰老的BMSCs 活力和骨形成[14]。王磊等[15]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs 受到X 線輻射后，其向成骨細(xì)胞分化的潛能明顯受到抑制。提前給予黃芪多糖（50 μg/mL，干預(yù)3 d）被X 線輻射進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示BMSCs 向成骨方向分化的潛能得到保護(hù)。胡繼宏等[16]研究采用適宜濃度的黃芪多糖、黃芪注射液、黃芪甲苷，3 種物質(zhì)均可促進(jìn)大鼠BMSCs 增殖。

1.8 其他單味中藥 曾建春等[17]發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉對(duì)大鼠BMSCs 增殖和誘導(dǎo)其向成骨分化均具有促進(jìn)作用。時(shí)舒曼等[18]研究使用銀杏葉提取物對(duì)大鼠BMSCs 成骨分化進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)大鼠BMSCs 成骨分化的作用。謝興文等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在不同劑量麝香干預(yù)下，在細(xì)胞胞漿內(nèi)I 型膠原表達(dá)不同，低劑量對(duì)BMSCs 成骨誘導(dǎo)分化后表達(dá)影響最顯著，說明麝香具有促成骨細(xì)胞的生成。除此之外，尚有研究表明，葛根素能通過抑制絲（蘇）氨酸蛋白酶（serine/threoninekinase,Akt）活化，能對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成和骨丟失有效預(yù)防[20]。張海玲等[21]研究發(fā)現(xiàn)龜板成分中的S6、S8、S9，通過表達(dá)Id1 能促進(jìn)BMCSs的增殖，而S2、S3 則抑制其增殖，說明在一定條件下，龜板既可促進(jìn)BMCSs 的增殖，又可抑制BMCSs 使其不過度增殖。

2 中藥復(fù)方對(duì)BMSCs 成骨分化的作用與機(jī)制分析

辨證論治自古即是中醫(yī)辨病、治病的基本原則，中藥復(fù)方正是以此為基礎(chǔ)，辨證審因、遣方用藥，對(duì)藥物有機(jī)配伍組合。中藥復(fù)方在目前臨床所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究中，主要是采用其含藥血清對(duì)體外細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.1 右歸丸 高舉會(huì)等[22]研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組細(xì)胞中的Shh、12 次跨膜蛋白（Ptched，Ptc）、Gli-1mRNA，證實(shí)了右歸丸可以通過激活Hedgehog 信號(hào)通路Shh、Ptc、Gli-1mRNA 的表達(dá)，從而促進(jìn)BMSCs 向成骨分化。由此可知，右歸丸促進(jìn)BMSCs 向成骨分化，可能是由激活Hedgehog 信號(hào)通路中各表達(dá)這一重要機(jī)制所誘導(dǎo)的。徐強(qiáng)等[23]研究發(fā)現(xiàn)采用不同劑量的右歸丸含藥血清，對(duì)BMSCs 中p-Akt、p-mTOR磷酸化水平水平均有不同程度的提高，從而發(fā)揮其促進(jìn)BMSCs 骨向分化的作用。楊鋒等[24]研究發(fā)現(xiàn)右歸丸含藥血清對(duì)BMSCs 成骨分化具有促進(jìn)作用，并在一定程度上能抑制BMSCs 成脂分化。

2.2 左歸丸 李宇等[25]研究發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清能夠上調(diào)轉(zhuǎn)錄激活因子（activating transcription factor-4，ATF4）、BGP 和BMP 的蛋白濃度，并且能夠誘導(dǎo)BMSCs 向骨細(xì)胞分化，從而能夠起到防治骨質(zhì)疏松癥的作用。楊鋒等[26]研究左歸丸含藥血清可通過去甲基化的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化。此過程中發(fā)現(xiàn)通過左歸丸含藥血清可以上調(diào)成Runx2、Osterix、BGP 和β-catenin 的表達(dá)，而其DNA 甲基化水平則明顯下調(diào)。由此可知，左歸丸可以通過下調(diào)成骨基因甲基化率，促進(jìn)基因的高表達(dá)，使BMSCs 向成骨方向分化。陳東陽等[27]研究說明左歸丸可以通過G 蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路，發(fā)揮對(duì)骨形成蛋白 6（BMP6）及活化因子4（ATF4）的調(diào)節(jié)作用，從而促進(jìn)BMSCs 向骨細(xì)胞分化。

2.3 補(bǔ)腎活血湯 李新建等[28]所研究的補(bǔ)腎活血湯（藥物組成：熟地黃9 g，杜仲3 g，枸杞子3 g，補(bǔ)骨脂9 g，菟絲子10 g，歸尾3 g，沒藥3 g，山茱萸3 g，紅花1.5 g，獨(dú)活3 g，酒制肉蓯蓉3 g）防治激素性股骨頭缺血壞死的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)其含藥血清能抑制兔BMSCs 成脂分化，同時(shí)具有促進(jìn)BMSCs 成骨分化，或誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞。劉亞梅等[29]的研究運(yùn)用補(bǔ)腎活血湯（組方同上）含藥血清干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)處于增值分裂期（S+G2+M 期）的BMSCs 百分率明顯增高，說明補(bǔ)腎活血湯含藥血清具有促進(jìn)BMSCs 增殖活性的作用。張倍源[30]的研究通過將補(bǔ)腎活血方水提液稀釋到所需濃度，發(fā)現(xiàn)能通過下調(diào)miR-210 表達(dá)，使鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量增加，從而促進(jìn)BMSCs 向成骨分化，表明補(bǔ)腎活血中藥能有效改變局部骨組織，以及細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，改善局部微循環(huán)、缺血缺氧。

2.4 黃芪散 王芳等[31]研究發(fā)現(xiàn)梯度劑量黃芪散（黃芪散是治療消渴病的古方，源自北宋《圣濟(jì)總錄》由葛根、黃芪、桑白皮3 味藥按質(zhì)量比2:1:1 的比例組成）含藥血清能調(diào)節(jié)OPN、BGP、ALP、成骨分化相關(guān)基因核心結(jié)合蛋白R(shí)unx2 和成脂分化相關(guān)基因PPARγ表達(dá)，從而促進(jìn)BMSCs 增殖及成骨分化，研究提示黃芪散含藥血清隨著劑量的增大，促進(jìn)BMSCs 更多向成骨方向分化，且減弱成脂分化趨勢(shì)。

2.5 二仙湯 劉波等[32]研究發(fā)現(xiàn)二仙湯（仙茅、淫羊藿、巴戟天、當(dāng)歸、知母、黃柏）通過改善氧化刺激對(duì)成骨細(xì)胞骨形成的影響，促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成，其機(jī)制可能與二仙湯調(diào)節(jié)鈣離子通道有關(guān)。吳琪等[33]研究通過MTT 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)不同劑量二仙湯能明顯提高去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠BMSCs 增殖，中等劑量二仙湯的改善作用最為顯著，并采用堿性磷酸酶試劑盒測(cè)定發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活力、礦化鈣結(jié)節(jié)形成能力均得以提升高。表明二仙湯可能是通過促進(jìn)BMSCs 的生長(zhǎng)，改善其骨向分化能力，促進(jìn)骨形成，達(dá)到對(duì)骨質(zhì)疏松癥的防治作用。

2.6 其他中藥復(fù)方 劉伯齡等[34]研究說明透骨消痛顆粒含藥血清通過上調(diào)Sox9 的表達(dá)，能加速BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。單獨(dú)使用較跟軟骨誘導(dǎo)劑合用效果稍弱，后者更能增強(qiáng)BMSCs 向軟骨細(xì)胞的分化，且促進(jìn)Sox9 的表達(dá)也更明顯，同時(shí)還能增加細(xì)胞的collagen Ⅱ、collagen X 表達(dá)，這可能是其主要機(jī)制之一。賈峰等[35]研究亦發(fā)現(xiàn)透骨消痛顆粒含藥血清可有效促進(jìn)BMSCs 中Sox9、Collagen Ⅱ和Runx2 轉(zhuǎn)錄水平的升高，有效誘導(dǎo)BMSCs 向軟骨細(xì)胞分化。提示透骨消痛顆粒含藥血清可通過升高Sox9 和Runx2 表達(dá)水平，參與誘導(dǎo)分化軟骨細(xì)胞的信號(hào)通路過程，且在一定程度上抑制BMSCs 向肥大的軟骨細(xì)胞分化，而表現(xiàn)為終末細(xì)胞表型。鄔波等[36]通過體外分離大鼠BMSCs，采用不同劑量復(fù)方接骨片和壯骨片含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，以RT-PCR 法檢測(cè)得知BMP-2、Runx2、ⅤEGF 及Akt mRNA 的表達(dá)明顯上調(diào)，Western blot 法檢測(cè)得知BMP-2、Runx2、ⅤEGF 及Akt 蛋白的表達(dá)也呈增高，說明其含藥血清可在BMSCs 體外分化通路中起到協(xié)同促進(jìn)BMSCs 向成骨細(xì)胞分化的作用。宋永周等[37]體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，通過MTT 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)含抗骨增生膠囊含藥血清可促進(jìn)大鼠BMSCs 增殖，以高劑量組效果最為顯著。堿性磷酸酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，對(duì)分泌堿性磷酸酶的促進(jìn)作用也更好。茜素紅染色結(jié)果顯示高劑量組形成的鈣鹽結(jié)節(jié)更大、更致密。由此可知，高劑量組含抗骨增生膠囊血清可顯著促進(jìn)大鼠BMSCs 的增殖和向骨向分化。

3 小結(jié)

從以上研究積極探索中藥對(duì)BMSCs 成骨分化的調(diào)控作用的結(jié)果得知，單味中藥、中藥復(fù)方及其有效成分對(duì)BMSCs 的增殖和向成骨分化均具有一定的促進(jìn)作用，其中尤以補(bǔ)腎類方藥的運(yùn)用居多。通過觀察發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎類中藥對(duì)BMSCs 向不同細(xì)胞分化的促進(jìn)作用，在一定程度上與中醫(yī)辨證論治理念相吻合，其中中藥復(fù)方更能體現(xiàn)這一中醫(yī)特點(diǎn)。目前，通過一系列對(duì)中藥促進(jìn)BMSCs 向成骨分化的研究，使中藥中許多藥理成分及藥理作用被發(fā)現(xiàn)，且進(jìn)一步得到證實(shí)，雖然取得的成果頗多，但仍存有一些問題亟待解決：1）年齡的增長(zhǎng)，導(dǎo)致BMSCs 增殖分化能力下降，加上其他方面的限制，如倫理因素，BMSCs 本身取材困難、分化不定向等，造成了種子細(xì)胞不能在短時(shí)間內(nèi)大量獲取，給研究增加了困難；2）中藥及中藥復(fù)方提取物所含成分復(fù)雜，為了能更好對(duì)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，仍需對(duì)具有誘導(dǎo)分化作用的成分再研究、再確定，含藥血清成分更為復(fù)雜，目前關(guān)于中藥及中藥復(fù)方對(duì)含藥血清的研究頗多，其制備的標(biāo)準(zhǔn)、操作規(guī)程、質(zhì)控體系都需要進(jìn)一步完善；3）在臨床應(yīng)用研究過程中，由于首過效應(yīng)，以及受藥物本身生物利用度的影響，通過口服方式在體內(nèi)的血藥濃度，其劑量選擇無法達(dá)到體外研究標(biāo)準(zhǔn)，尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)骨科疾病防治的相關(guān)文獻(xiàn)；4）中藥作用于BMSCs 成骨分化各個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路的分子機(jī)制，各信號(hào)通路與通路、因子與因子之間是否存在協(xié)同與拮抗作用，雖然一些研究結(jié)合了藥代動(dòng)力學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)等，但得到的結(jié)論尚不能確定，因此，深入研究中藥誘導(dǎo)BMSCs 向成骨分化作用勢(shì)在必行。比如此過程中是何種有效成分發(fā)揮作用，其主要機(jī)制通路和作用的靶點(diǎn)等，仍需進(jìn)一步研究探討，以便為今后臨床應(yīng)用中藥誘導(dǎo)BMSCs 成骨分化治療骨科疾病提供更多、更可靠的依據(jù)。