高毒力肺炎克雷伯菌毒力和耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

蔣玉婷，張 珂，劉唐娟，黃瑩瑩，溫中薇，孔晉亮，陳一強(qiáng)

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣西 南寧 530021)

肺炎克雷伯菌是常見的革蘭陰性桿菌，尤其在免疫力低下患者中，是最常見的機(jī)會(huì)性致病菌之一。根據(jù)毒力特點(diǎn)可將肺炎克雷伯菌分為普通型肺炎克雷伯菌(classicKlebsiellapneumoniae，cKp)和高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulentKlebsiellapneumoniae，hvKp)。cKp通常在免疫力低下患者中致病，引起醫(yī)院獲得性感染。而hvKp通常在健康人群中引起社區(qū)獲得性感染，糖尿病和消化系統(tǒng)疾病患者更易感染[1]，且常伴隨多部位侵襲性感染，如化膿性肝膿腫、腦膜炎、眼內(nèi)炎、骨髓炎、脾膿腫和壞死性筋膜炎等，較cKp更具毒性，因此被稱為hvKp[2-3]。起初，人們以高黏液黏度表型定義hvKp，但越來越多研究發(fā)現(xiàn)，并不是所有hvKp菌株都具有高黏液黏度表型[4]。Zhang等[5]建議hvKp應(yīng)由關(guān)鍵毒力基因型而不是高黏液黏度表型進(jìn)行定義，并認(rèn)為僅通過檢測高黏液黏度表型的拉絲試驗(yàn)定義hvKp可能會(huì)使研究結(jié)果產(chǎn)生偏頗，特別是在小樣本量的研究中。Harada等[6]也指出拉絲試驗(yàn)性能較差，準(zhǔn)確率僅為90%，而rmpA、rmpA2、peg-344、iroB和iucA等毒力基因，以及鐵載體定量測定≥30 μg/mL，準(zhǔn)確率>95%，可作為準(zhǔn)確區(qū)分hvKp與cKp的生物標(biāo)志物。因此，人們逐漸結(jié)合關(guān)鍵毒力基因型定義hvKp，如采用rmpA和iucA基因陽性，rmpA、iucA和iroB基因陽性，高黏液黏度表型、rmpA基因陽性和K1/K2，高黏液黏度表型、rmpA/rmpA2和magA基因陽性(尤其適用于K1 ST23 hvKp)等組合定義hvKp[7-10]。但至今還未有hvKp定義的國際共識(shí)，仍需繼續(xù)探索hvKp的最佳定義標(biāo)準(zhǔn)，以期能盡早發(fā)現(xiàn)hvKp菌株，便于臨床預(yù)防和治療。另外，hvKp菌株可獲得單種或多種耐藥基因，如碳青霉烯酶基因、廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因、粘菌素抗性相關(guān)基因、磺酰胺抗性基因(sul1、sul2和sul3)及甲氧芐啶抗性基因(dfrA1和dfrA12)等，表明部分hvKp菌株已經(jīng)進(jìn)化成既有高毒力表型又有耐藥表型的“超級(jí)細(xì)菌”[11-12]。高毒力和耐藥共存的肺炎克雷伯菌近期已增加了約50%[13]，并在多地醫(yī)院引起感染暴發(fā)，導(dǎo)致極高病死率[12, 14]。hvKp耐藥株已經(jīng)出現(xiàn)并越來越多，可能導(dǎo)致嚴(yán)重甚至無法治療的感染，對(duì)公眾健康造成極大威脅，因此本文對(duì)hvKp菌株的毒力因子和耐藥機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 hvKp流行病學(xué)

1986年Liu等[15]首次提及hvKp，發(fā)現(xiàn)7例來自中國臺(tái)灣的肺炎克雷伯菌化膿性肝膿腫患者均合并眼內(nèi)炎，且同時(shí)合并心內(nèi)膜炎、腦膜炎、肺炎或腎炎之一，此是一種不同于cKp的侵襲性感染。隨后，在韓國、越南及中國出現(xiàn)許多相似報(bào)道[16]。中國臺(tái)灣研究[17]顯示，肺炎克雷伯菌分離株中，hvKp菌株占54.3%(150/276)。韓國37.4%(155/414)的肺炎克雷伯菌具有高黏液黏度表型[18]。中國大陸研究[19]顯示，230株肺炎克雷伯菌分離株中37.8%為hvKp，且hvKp的檢出率在不同城市之間存在差異，武漢高達(dá)73.9%，而浙江僅8.3%。肺炎克雷伯菌引起的社區(qū)獲得性肝膿腫占所有化膿性肝膿腫病例的80%，而引起化膿性肝膿腫的病原體中90.9%是hvKp菌株[20]。hvKp成為了亞洲化膿性肝膿腫最常見的原因，并開始在全球播散。21世紀(jì)以來，法國、日本、伊朗、美國、埃及、西班牙、英國、加拿大、澳大利亞、印度和新加坡等國家也逐漸出現(xiàn)hvKp相關(guān)報(bào)道，但檢出率并不高(3.2%～20.3%)[21-24]。然而近幾年，新的hvKp菌株—耐藥hvKp開始在臨床出現(xiàn)，其表現(xiàn)出高毒力和難治愈性再度引起人們關(guān)注。一份來自溫州某醫(yī)院的報(bào)告[14]顯示，2017年3月—2018年1月，該院重癥監(jiān)護(hù)病房耐碳青霉烯類hvKp暴發(fā)，導(dǎo)致病死率100%(8/8)。類似的報(bào)道也曾在中國杭州以及伊朗等地出現(xiàn)[12, 25]。hvKp和耐藥hvKp正在威脅著人類健康，必須加強(qiáng)對(duì)hvKp的認(rèn)知及管控。

2 hvKp相關(guān)毒力因子

較cKp菌株而言，hvKp菌株對(duì)中性粒細(xì)胞和補(bǔ)體介導(dǎo)的吞噬作用以及中性粒細(xì)胞胞外殺菌作用具有更強(qiáng)的抵抗力[26]。體外試驗(yàn)[24]也表明，hvKp菌株具有更強(qiáng)的生存能力，且在各種感染模式中表現(xiàn)出更強(qiáng)的毒力。在hvKp菌株中，存在多種與其高毒力相關(guān)的因子，主要包括莢膜多糖、序列類型、毒力質(zhì)粒、整合性接合元件(integrative conjugative elements，ICEs)、鐵載體等。

2.1 莢膜多糖 莢膜多糖由直鏈或支鏈低聚糖組成，其包裹在肺炎克雷伯菌周圍形成一個(gè)保護(hù)屏障，使肺炎克雷伯菌能在劣勢環(huán)境(如干燥環(huán)境、宿主免疫吞噬、抗菌藥物攻擊等)中生存。hvKp菌株的莢膜多糖受黏液表型調(diào)節(jié)基因rmpA/rmpA2、rmpC和magA(wzy-k1)的正調(diào)控[10, 27]。根據(jù)K抗原血清學(xué)檢測，莢膜多糖至少可分為78種類型[28]，K1、K2、K5、K20、K54和K57是hvKp菌株最普遍的血清型。其中K1血清型與ST23密切相關(guān)，常引起化膿性肝膿腫，在亞洲占主導(dǎo)地位。而K2血清型在遺傳上呈多樣化，在美國和歐洲更常見，K2血清型的ST65 hvKp菌株與各種侵襲性感染相關(guān)[3, 29]。值得注意的是，K1、K2、K5和K57型莢膜多糖缺乏巨噬細(xì)胞凝集素受體識(shí)別的甘露糖或鼠李糖，能逃避凝集素吞噬和巨噬細(xì)胞殺傷，為hvKp存活和繁殖創(chuàng)造了良好環(huán)境[26]。莢膜多糖的厚度決定了其對(duì)肺炎克雷伯菌的保護(hù)程度[30]，而hvKp菌株常伴隨較cKp更豐富的莢膜多糖，因此，hvKp菌株更能抵抗各種體液防御(如補(bǔ)體殺傷、人β-防御素)和抗微生物肽(如中性粒細(xì)胞蛋白1和乳鐵蛋白)，有助于其在宿主體內(nèi)播散并產(chǎn)生耐藥性[31]。

2.2 序列類型 多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing，MLST)是一種基于核酸序列測定的細(xì)菌分型方法，可將細(xì)菌分為不同的序列類型(sequence type，ST)，并確定不同序列類型間的關(guān)系以及與疾病的聯(lián)系。經(jīng)MLST分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)hvKp菌株都是經(jīng)克隆擴(kuò)增的，其核心基因組變異有限且毒力基因高度保守，克隆群CG23與hvKp菌株的高毒力表型密切相關(guān)[29]。在亞洲流行的hvKp菌株中，37%～64%的分離株為克隆群CG23，包括ST23、ST26、ST57和ST163。ST23是hvKp菌株中最普遍的序列類型，并與K1血清型和肝膿腫密切相關(guān)[3]；而ST65、ST66、ST86、ST373、ST374、ST375、ST380和ST434與K2相關(guān)，其中又以ST65(42%)和ST86(46%)更常見[32]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2015—2017年中國鑒定的47株耐碳青霉烯類的hvKp分離株，其序列類型分布為 ST11(26株)、ST65(7株)、ST23(5株)、ST1797(3株)、ST268(2株)以及ST25、ST595、ST692和ST1700(各1株)[29,33]，表明我國耐碳青霉烯類的hvKp菌株以ST11為主。中國耐碳青霉烯類cKp以ST11常見，hvKp多見于ST23[34]，提示ST23 hvKp菌株和ST11 cKp耐藥株間存在相互作用，即ST23 hvKp和ST11耐碳青霉烯類cKp間已出現(xiàn)毒力和耐藥相關(guān)遺傳物質(zhì)的交換。

2.3 毒力質(zhì)粒 與cKp相比，hvKp的一個(gè)明顯特征是存在毒力質(zhì)粒。該質(zhì)粒通常包含多個(gè)毒力編碼基因，并可在菌株間轉(zhuǎn)移，是hvKp菌株呈現(xiàn)高毒力的重要原因。最早被鑒定的兩個(gè)毒力質(zhì)粒是pK2044(224 152 bp)和pLVPK(219 385 bp)，兩個(gè)毒力質(zhì)粒高度相似，都是IncHI1/IncFIB質(zhì)粒，含黏液表型調(diào)節(jié)基因rmpA/rmpA2、氣桿菌素編碼基因iuc和沙門菌素編碼基因iro[10, 24]；但不含質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移基因，因此，不具有自主接合轉(zhuǎn)移功能，可能與過去很長一段時(shí)間內(nèi)，肺炎克雷伯菌中高毒力和耐藥表型不相重疊的現(xiàn)象有關(guān)[35]。隨著研究的深入，越來越多的毒力質(zhì)粒相繼被鑒定出來，甚至發(fā)現(xiàn)了與耐藥基因共存的毒力質(zhì)粒。如Gu等[12]指出，類pLVPK毒力質(zhì)粒pVir-CR-HvKp4(178 154 bp，含rmpA2、iucABCD、iutA，缺rmpA、iroBCDN)可轉(zhuǎn)移到耐碳青霉烯類cKp菌株中，實(shí)現(xiàn)與耐藥質(zhì)粒pKPC-CR-HvKP4共存，并形成耐碳青霉烯類hvKp菌株；該耐藥與毒力結(jié)合的hvKp菌株在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院引起感染暴發(fā)，并導(dǎo)致病死率100%。同樣地，將pLVPK毒力質(zhì)粒的100 kb片段整合到接合性IncFIB質(zhì)粒中，形成p15WZ-82-vir毒力質(zhì)粒，可與耐碳青霉烯類cKp接合，并表達(dá)出高毒力和呈現(xiàn)耐藥表型[36]。此外，人們還發(fā)現(xiàn)新的共存形式的毒力質(zhì)?！s交毒力質(zhì)粒，此類質(zhì)粒將耐藥基因重組到毒力質(zhì)粒中，形成既含有毒力相關(guān)基因又含有耐藥相關(guān)基因的新質(zhì)粒。Dong等[37]從臨床hvKp菌株中分離出的雜交質(zhì)粒pKP70-2(240 kb)，同時(shí)含毒力基因rmpA2以及碳青霉烯酶基因blaKPC-2和甲氧芐啶抗性基因dfrA。Huang等[38]通過WGS在TVGHCRE225菌株中也檢測出一個(gè)雜交毒力質(zhì)粒pVir，該質(zhì)粒第一區(qū)域與pK2044和pLVPK質(zhì)粒有99%的同源性，含毒力基因rmpA和rmpA2；第二區(qū)域則與pPMK1-NDM抗性質(zhì)粒高度相似。這些hvKp耐藥株，同時(shí)具有高毒力、耐藥性以及移動(dòng)性，可在醫(yī)院或社區(qū)引起嚴(yán)重感染[39]。而雜交毒力質(zhì)粒將耐藥和毒力基因融合在同一質(zhì)粒中，其在菌株間轉(zhuǎn)移所帶來的威脅更大。

2.4 ICEs ICEs是細(xì)菌中可自主移動(dòng)的元件，通常存在于細(xì)菌染色體上，自身即可完成轉(zhuǎn)移的相關(guān)編碼，并攜帶多種功能基因，是毒力和耐藥播散的重要介質(zhì)。肺炎克雷伯菌中的ICEs可依據(jù)其右端攜帶的不同cargo基因簇分為14種類型 (ICEKp1～I(xiàn)CEKp14)，各ICEs間有以下共性：(1)左端有一個(gè)整合酶基因int；(2)有編碼耶爾森菌素的29 kb位點(diǎn)；(3)有編碼xis激活酶、virB-IV型分泌系統(tǒng)、oriT轉(zhuǎn)移起點(diǎn)和mobBC蛋白的14 kb序列[40]。hvKp菌株中以ICEKp1和ICEKp10常見。ICEKp1在hvKp菌株NTUH-K2044中被首次發(fā)現(xiàn)，其5’區(qū)域有一個(gè)高致病性島(high pathogenicity island, HPI)，編碼耶爾森菌素、沙門菌素和黏液表型調(diào)節(jié)因子rmpA，3’區(qū)域含接合轉(zhuǎn)移基因[41]。ICEKp10編碼耶爾森菌素和基因毒素colibactin，但缺少rmpA和iro基因[42]。ICEs普遍存在于肺炎克雷伯菌中，尤其是hvKp菌株。近90%的CG23菌株和近75%的hvKp菌株均含ICEs[10]。Lam等[40]對(duì)肺炎克雷伯菌中ICEs的流行、進(jìn)化和遷移性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ICEs主要通過基因水平轉(zhuǎn)移在肺炎克雷伯菌種群(包括多重耐藥肺炎克雷伯菌)中動(dòng)態(tài)循環(huán)，極大地促進(jìn)肺炎克雷伯菌間的遺傳物質(zhì)交流。Farzand等[43]發(fā)現(xiàn)，ICEKp2雖與銅綠假單胞菌PAPI高度同源，廣泛分布于銅綠假單胞菌中，但在肺炎克雷伯菌中也有少量分布，當(dāng)ICEKp2和ICEKp1存在于同一肺炎克雷伯菌中，ICEKp2的4型偶聯(lián)蛋白促進(jìn)ICEKp1在肺炎克雷伯菌間轉(zhuǎn)移，此為ICEs促進(jìn)毒力和耐藥性播散提供了新的作用途徑。另外，最近一項(xiàng)研究[44]顯示，ICEKp的缺失可使肺炎克雷伯菌鐵載體分泌減少，抗菌藥物抗性降低，并指出此與ICEkp編碼的耶爾森菌素ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)。

2.5 鐵載體 鐵是細(xì)菌生長所必需的，而鐵載體可在低鐵環(huán)境中(如人類宿主)以極高的鐵親和力為細(xì)菌提供鐵，促進(jìn)細(xì)菌生長和繁殖[10]。hvKp比cKp產(chǎn)生更多的鐵載體，且鐵載體活性提高了6～10倍[1]。hvKp能產(chǎn)生4種鐵載體：腸桿菌素、耶爾森菌素、沙門菌素和氣桿菌素。腸桿菌素普遍存在于肺炎克雷伯菌中，但由于其能被宿主載脂蛋白2滅活，在感染中幾乎不發(fā)揮作用。耶爾森菌素也廣泛存在于肺炎克雷伯菌，但在hvKp中更常見，研究[24]表明，耶爾森菌素與侵襲性感染(菌血癥、肝膿腫等)風(fēng)險(xiǎn)增加顯著相關(guān)。編碼耶爾森菌素的ybt基因存在于FIBK質(zhì)粒上。FIBK質(zhì)粒在肺炎克雷伯菌中非常普遍且高度穩(wěn)定，并且許多FIBK質(zhì)粒已獲得AMR轉(zhuǎn)座子，使得AMR與毒力基因的聚合幾乎不存在障礙，可極大地促進(jìn)hvKp菌株的耐藥性[40]。編碼沙門菌素和氣桿菌素的基因存在于毒力質(zhì)粒上，因此沙門菌素和氣桿菌素是hvKp特有的。其中，氣桿菌素占鐵載體總量的80%～90%，對(duì)hvKp生長和存活至關(guān)重要，可協(xié)助hvKp從腸道轉(zhuǎn)移到各種組織并在這些組織中繁殖，從而引起嚴(yán)重感染[1, 24]。氣桿菌素由iucABCD操縱子編碼，其同源受體由iutA基因編碼。沙門菌素在hvKp感染中的具體作用還未明確，有研究[45]指出沙門菌素似乎與微球菌素E492一起促進(jìn)hvKp菌株在宿主中定植。

2.6 其他 hvKp菌株的高毒力表型受多種毒力因子的共同作用，除了上述毒力因子外，還有其他可能發(fā)揮作用的毒力因子。一是peg-344，其位于hvKp菌株hvKp1的毒力質(zhì)粒上，可增加hvKp1的毒力，并在hvKp菌株中廣泛流行[46]，用peg-344環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可快速分辨hvKp和cKp[47]。二是尿囊素，其在肺炎克雷伯菌中既是氮源又是碳源。研究[48]表明，尿囊素在K1 hvKp菌株中更常見，肺炎克雷伯菌對(duì)尿囊素的利用能力可能有助于其對(duì)氮源的競爭。尿囊素代謝受基因allB(尿囊素酶)、allR(負(fù)調(diào)節(jié)劑)、allS(轉(zhuǎn)錄激活因子)和ybbW(丙氨酸通透酶)調(diào)控。三是Colibactin ，是一種多肽類基因毒素，由位于ICEkp 54 kb位點(diǎn)上的clb基因(也稱pks基因)編碼的非核糖體肽合成酶-聚酮合成酶的合成，并通過ICEkp實(shí)現(xiàn)菌株間的基因水平轉(zhuǎn)移[3]。Colibactin可誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，擾亂宿主細(xì)胞周期，還有助于hvKp菌株在宿主體內(nèi)定植，導(dǎo)致小鼠感染K1 ST23肺炎克雷伯菌[49]。四是cAMP受體蛋白，是一種具有多效性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可負(fù)調(diào)控莢膜多糖生物合成，其突變體能產(chǎn)生更高的CPS水平，但會(huì)降低肺炎克雷伯菌NTUH-2044生物膜形成能力、生長速率和毒力[50]。因此，cAMP受體蛋白是否具有同時(shí)調(diào)控其他毒力因子的功能，以及對(duì)hvKp毒力的具體調(diào)控作用仍待明確。最后是hvKp菌株形成生物膜的能力，Wu等[51]研究發(fā)現(xiàn)，hvKP比cKp產(chǎn)生更多的生物膜。但也有研究[52]提出，hvKp與cKp生物膜形成能力無差異，且生物膜形成能力對(duì)hvKp毒力無明顯影響。因此，生物膜形成與hvKp引起的侵襲性感染是否相關(guān)，仍值得進(jìn)一步研究。

3 HvKp相關(guān)耐藥機(jī)制

相比于cKp對(duì)抗菌藥物的高耐藥率，hvKp對(duì)抗菌藥物的耐藥率普遍較低。但近年來隨著可移動(dòng)遺傳元件在全球的快速傳播，已觀察到兩種融合方式形成耐藥hvKp菌株：獲得毒力基因的cKp菌株和獲得耐藥基因的hvKp菌株。以下就hvKp相關(guān)耐藥機(jī)制進(jìn)行闡述。

3.1 基因水平轉(zhuǎn)移 基因水平轉(zhuǎn)移是指在非親子關(guān)系的有機(jī)體之間共享遺傳物質(zhì)，通常與細(xì)菌的抗菌藥物耐藥性和致病性相關(guān)，通過質(zhì)粒、ICEs、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)遺傳元件，以接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等方式播散或獲得耐藥性或毒力。接合是指供體細(xì)胞和受體細(xì)胞之間通過接合菌毛進(jìn)行物理接觸而實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)化是指從環(huán)境中攝取外源遺傳物質(zhì)；轉(zhuǎn)導(dǎo)是指外源遺傳物質(zhì)整合到噬菌體基因組中并通過噬菌體傳遞[53]。其中，接合是細(xì)菌中最常見的基因水平轉(zhuǎn)移[54]。接合轉(zhuǎn)移由參與DNA轉(zhuǎn)移和復(fù)制(Dtr)、交配對(duì)形成(Mpf)的相關(guān)轉(zhuǎn)移基因調(diào)控。Dtr基因是松弛酶處理DNA所必需的，松弛酶在轉(zhuǎn)移起點(diǎn)的nic位點(diǎn)切割DNA分子，并保持附著在DNA單鏈上；Mpf編碼負(fù)責(zé)合成T4SS的蛋白；松弛酶與DNA鏈相連，通過T4SS形成的孔道轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，最后借助ssDNA結(jié)合蛋白、反限制蛋白和SOS抑制蛋白產(chǎn)生穩(wěn)定的接合子[55]。一般情況下，轉(zhuǎn)移基因處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)感知到特定信號(hào)(如特定受體的存在、高細(xì)胞密度以及氧氣、溫度變化等)時(shí)可開啟并誘導(dǎo)基因的接合轉(zhuǎn)移[55]。質(zhì)粒和ICEs通常能自行完成接合轉(zhuǎn)移，或者在其他基因組元件的幫助下進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移。如前述cKp耐藥株可獲得ICEs或接合性毒力質(zhì)粒而進(jìn)化為hvKp耐藥株。反之，hvKp菌株亦可獲得耐藥質(zhì)粒而形成hvKp耐藥株。Yang等[56]研究發(fā)現(xiàn)，hvKp菌株(pKpn1693，K1 ST23)可獲得含碳青霉烯酶基因blaCTX-M-24的IncFII型質(zhì)粒；在該菌株的染色體上還發(fā)現(xiàn)了多個(gè)外排泵基因和耐藥基因，因此，還對(duì)磷霉素、多粘菌素、廣譜β-內(nèi)酰胺類和氟喹諾酮類等耐藥。Huang 等[38]對(duì)hvKp的喹諾酮類耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)hvKp的耐藥質(zhì)粒上含喹諾酮類耐藥的關(guān)鍵基因qnrA1，此外，gyrA和parC基因的突變也參與了喹諾酮類藥物耐藥。

3.2 AcrB外排泵 在許多革蘭陰性桿菌中，抗性結(jié)瘤細(xì)胞分裂超家族(resistance-nodulation-cell division，RND)是主要的藥物外排泵，可通過三個(gè)連續(xù)構(gòu)象(進(jìn)入、結(jié)合和擠出)的循環(huán)將藥物排出。其通常以不對(duì)稱的三聚體形式存在，含有12/13/14個(gè)跨膜螺旋，位于螺旋1和2以及7和8之間的兩個(gè)大的外環(huán)，跨膜域主要作為能量源質(zhì)子的管道，外部環(huán)包含與輸出配體結(jié)合的位點(diǎn)[57]。而三聚體內(nèi)膜成分吖啶黃素抗性蛋白B(acriflavine resistance protein B，AcrB)是藥物/質(zhì)子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的藥物特異性識(shí)別和能量轉(zhuǎn)導(dǎo)中心，與周質(zhì)蛋白AcrA和外膜蛋白TolC作為一個(gè)三方系統(tǒng)協(xié)同工作。其在結(jié)構(gòu)上可以分為對(duì)AcrB三聚重要的漏斗結(jié)構(gòu)域或?qū)咏Y(jié)構(gòu)域(FD)，負(fù)責(zé)能量轉(zhuǎn)導(dǎo)以促進(jìn)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的TMD，以及包含結(jié)合位點(diǎn)并介導(dǎo)底物識(shí)別、攝取和轉(zhuǎn)位的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域(PD)[58]。AcrB由acrB基因編碼，可被ramA、soxS、marA、rob和acrA等基因激活而過表達(dá)，進(jìn)而降低肺炎克雷伯菌對(duì)藥物，如喹諾酮類藥物(萘啶酸、環(huán)丙沙星)和頭孢西丁、氯霉素、紅霉素、替加環(huán)素等的敏感性[59-60]。但ramR、soxR、acrR等可通過抑制acrB，恢復(fù)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的敏感性[61]。AcrB外排泵介導(dǎo)的耐藥在hvKp菌株中也得到了證實(shí)。Srinivasan等[62]在hvKp菌株(NTUH-K2044)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控蛋白—LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子oxyR，其與acrB表達(dá)正相關(guān)；△oxyR突變株的acrB相對(duì)表達(dá)量約降低為原來的1/5，同時(shí)阿莫西林、氯霉素、紅霉素、萘啶酸、利福平和甲氧芐啶的最低抑菌濃度也隨之降低。Huang等[38]研究也表明，相對(duì)于對(duì)照株KP478，hvKp菌株(VGHCRE225)的外排泵基因acrB及其調(diào)控基因ramA過表達(dá)，同時(shí)AcrB的負(fù)調(diào)控基因acrR和ramR分別被插入序列ISKpn26，發(fā)生錯(cuò)義突變，此與替加環(huán)素耐藥性有關(guān)。

3.3 脂多糖修飾 脂多糖是肺炎克雷伯菌細(xì)胞膜的主要成分之一，在結(jié)構(gòu)上主要包含三種成分：將整個(gè)結(jié)構(gòu)錨定在細(xì)胞膜中的脂質(zhì)A成分、核心寡糖和稱為O抗原的末端側(cè)鏈[28]。其中脂質(zhì)A是位于細(xì)胞膜外單層的疏水部分，由lpx基因簇編碼的一系列酶合成。脂質(zhì)A由于游離磷酸基團(tuán)的存在而帶有負(fù)電荷，而多粘菌素對(duì)脂質(zhì)A負(fù)電荷具有高親和力，兩者結(jié)合后可破壞脂多糖的穩(wěn)定性，使細(xì)胞外膜不完整，最終導(dǎo)致多粘菌素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)而發(fā)揮殺菌作用[63]。但當(dāng)脂多糖中帶正電的殘基如4-氨基-L-阿拉伯糖、磷酸乙醇胺或氨基半乳糖增加，則可改變脂質(zhì)A的負(fù)電荷狀態(tài)，從而減少多粘菌素與脂質(zhì)A間的相互作用并增強(qiáng)多粘菌素抗性。4-氨基-L-阿拉伯糖的生物合成由pmrEHFIJKLM基因編碼的蛋白質(zhì)調(diào)控，而pmrEHFIJKLM基因受雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)PmrAB的直接調(diào)節(jié)和 PhoPQ的間接調(diào)節(jié)[64]。PmrAB 還通過磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶PmrC控制合成磷酸乙醇胺所需基因的表達(dá)[65]。Huang等[38]研究也證實(shí)，hvKp菌株中pmrHFIJKLM的高表達(dá)增加了脂多糖的修飾，通常與多粘菌素抗性有關(guān)。Choi等[66]研究表明，hvKp中多粘菌素抗性的獲得與編碼phoPQ或pmrAB基因的上調(diào)，以及pmrD和pbgP基因表達(dá)的增加有關(guān)，并且指出這種抗性可能導(dǎo)致與毒力相關(guān)的表型缺陷，如莢膜多糖、HMV表型和血清抵抗力等。另外，Lee等[67]指出，攜帶mcr-1基因的質(zhì)粒是革蘭陰性菌產(chǎn)生多粘菌素抗性的重要原因，并可通過水平基因轉(zhuǎn)移；mcr-1基因編碼一種磷酸乙醇胺轉(zhuǎn)移酶，催化磷酸乙醇胺與脂質(zhì)A反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)多粘菌素抗性。此與研究[11-12]結(jié)果一致。Sellick等[68]在小鼠體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，mgrB突變誘導(dǎo)PhoPQ調(diào)控的脂質(zhì)A重塑，進(jìn)而賦予肺炎克雷伯菌對(duì)多粘菌素的抗性。隨后，研究[69]表明，此機(jī)制亦出現(xiàn)在hvKp中，發(fā)現(xiàn)IS Kpn18對(duì)mgrB基因的截?cái)?，?dǎo)致對(duì)多粘菌素和碳青霉烯類耐藥hvKp的出現(xiàn)。

4 總結(jié)與展望

自1980年中國臺(tái)灣首次報(bào)道以來，hvKp已在包括中國、印度、歐洲和美國等多個(gè)國家甚至全球范圍內(nèi)被報(bào)道[48, 69]。hvKp能引起健康人群感染，且一旦感染極易導(dǎo)致多部位感染，造成極高的病死率。多重耐藥hvKp的出現(xiàn)更是增加了感染患者的治療難度。目前已有研究[24]證實(shí)，hvKp的高毒力受毒力質(zhì)粒、ICEs、鐵載體、莢膜多糖等多種相關(guān)因素調(diào)控，但有關(guān)hvKp耐藥機(jī)制的研究仍較少，同時(shí)有關(guān)hvKp毒力因子及其耐藥機(jī)制相關(guān)性的研究更少。雖然，目前hvKp耐藥率仍遠(yuǎn)低于cKp，但耐藥hvKp感染一旦出現(xiàn)，往往造成難以預(yù)估的嚴(yán)重后果。因此，對(duì)于hvKp毒力因子、耐藥機(jī)制以及其相關(guān)性的研究是非常有必要的。本綜述詳細(xì)介紹了hvKp菌株相關(guān)毒力因素以及可能存在的各種耐藥機(jī)制，旨在探討hvKp的耐藥性是否與其高毒力相關(guān)，為臨床診療提供一定的參考意見。此外，針對(duì)目前越來越多的多重耐藥hvKp菌株的出現(xiàn)，更加有效的藥物開發(fā)非常必要，而根據(jù)hvKp菌株毒力因子以及耐藥機(jī)制尋找新的阻斷方式是未來可以考慮的一個(gè)方向。