電針治療對完全性骶上脊髓損傷后神經(jīng)源性膀胱大鼠尿流動力學和脊髓組織中CyclinD1、Ngn1的影響*

鄧悅寧，周達岸，王卓，馬賢德

（1.錦州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，遼寧 錦州121000；2.遼寧中醫(yī)藥大學教學實驗中心，遼寧 沈陽110847）

隨著交通事故與高空墜落事件的逐年增多，以兩者為主要發(fā)病原因的疾病——脊髓損傷（spinal cord injury, SCI）在全球的發(fā)病率由1995年的10.4～83.0/100 萬[1]增 長 到2018年 的87.2～136.9/100 萬[2]，其損傷嚴重程度以美國脊髓損傷協(xié)會（ASIA）標準分級為A 級居多，即完全性SCI。完全性SCI 中約80%以上的患者為完全性骶上脊髓損傷（sacral spinal cord injury, SSCI），是臨床中最常見的脊髓損傷節(jié)段[3]。并發(fā)各種程度的括約肌和反射功能障礙，損傷平面以下運動感覺功能完全喪失。完全性SSCI 后骶髓排尿中樞失去腦橋排尿中樞的抑制，逼尿肌無抑制反復收縮，形成神經(jīng)源性膀胱（neurogenic bladder, NB）逼尿肌反射亢進，晚期形成腎衰竭危及生命。

電針治療完全性SSCI 后NB 的臨床療效及安全性已得到高度的認可[4-5]，其治療的作用機制已成為研究熱點。耿鑫[6]研究發(fā)現(xiàn)電針通過調控Notch 信號通路能夠促進內源性神經(jīng)干細胞增殖，并抑制內源性神經(jīng)干細胞向星形膠質細胞和少突膠質細胞分化。脊髓室管膜區(qū)和白質普遍存在內源性神經(jīng)干細胞[7]，其激活后可增殖、分化為神經(jīng)細胞，修復神經(jīng)功能[8-9]。

Wnt/β-catenin 信號通路在神經(jīng)修復中發(fā)揮重要作用[10]。本課題的前期研究發(fā)現(xiàn)電針通過促進Wnt/β-catenin 信號通路中Wnt-1 和β-catenin 關鍵蛋白在脊髓組織中的表達來改善模型大鼠排尿功能[11]?；谇捌诘难芯拷Y果，本文繼續(xù)探討電針治療完全性SSCI 后NB 大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SD雌性大鼠60只，6～8周齡，體重（210±10）g，購自遼寧長生生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2016-0001，實驗動物使用許可證號：SYXK（遼）2019-0004。大鼠隨機分為假手術組12 只，模型組48 只。在室溫23℃、濕度50%、通風良好的環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，鼠籠墊料更換1 次/2 d，食水自由。實驗過程對大鼠的處置方式符合中華人民共和國科技部2006年發(fā)布《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 主要儀器和試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特公司），Sanyo 超低溫冰箱（日本Sanyo 公司），全自動脫水機、輪轉式切片機、展片機、包埋機、烤片機（德國Leica 公司），VE-180 雙垂直電泳槽、4200 SF 凝膠成像分析系統(tǒng)、ESP 300 電泳儀（上海天能科技有限公司），DM 2000 數(shù)碼顯微鏡（德國徠卡公司），SHA-B 恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司），WD-9405B 脫色搖床（北京市六一儀器廠），Bio-Rad 型PCR 儀（美國伯樂公司），BL-420 S 16 通道生物機能實驗系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），SDZ-Ⅲ電針治療儀、華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。水合氯醛（國藥集團化學試劑沈陽有限公司），CyclinD1 抗體（Ab 16663）、Neurogenin 1 抗體（Ab 66498）、β-actin抗體（Ab 8227）（英國Abcam 公司），二抗、SP 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），蛋白提取試劑盒（P0013）、蛋白定量試劑盒（P0010S）、SDSPAGE 凝膠試劑盒（P0012A）、蛋白marker（P0068）（上海碧云天生物技術有限公司），SP 試劑盒、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物科技有限公司）。

1.3 模型復制方法

采取手術方式復制完全性SSCI 大鼠模型。1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠俯臥位固定于手術臺，脊柱背側胸椎下段備皮，碘伏消毒，解剖定位T10椎體，以T10棘突為中心沿背側正中線切開皮膚，切口長約2 cm，然后向下逐層分離皮下組織，沿椎板鈍性分離豎脊肌，暴露T9～T11棘突和椎板。手術刀切開T9、T10的棘間韌帶，咬骨鉗自T9、T10椎板間隙緊貼椎板平行脊髓進鉗，輕輕咬除椎板，直至咬除整個T10椎板及兩側的關節(jié)突。咬骨過程中，注意保護脊髓硬脊膜、血管和神經(jīng)根。用彎頭眼科鑷挑起脊髓，于脊髓上緣橫向切斷脊髓，反復切割脊髓3～5 次。此時可見大鼠雙下肢抽搐，尾巴甩動并松弛，提示脊髓完全橫斷。用明膠海綿充分止血并填充內縮形成的空洞，逐層縫合。假手術組暴露T9～T11，并用咬骨鉗去除T10棘突，然后逐層縫合。

1.4 模型評價

術后待大鼠完全清醒，采用BBB 評分評價各組大鼠脊髓橫斷情況[12]。評分由0～21 分組成，0 分為無可見雙后肢運動，分數(shù)越高則大鼠后肢運動功能越好，21 分為持續(xù)狀態(tài)的掌面移動、協(xié)調步態(tài)、足趾抓地、軀干穩(wěn)定、尾巴翹起，活動過程中身體與主動爪位置始終處于平行狀態(tài)。3人采用單盲法記錄評價結果并整理分析。大鼠完全性SSCI 后雙后肢呈拖動前行狀態(tài)，無任何運動為0分，表明大鼠脊髓橫斷模型復制成功。術后大鼠正常飼養(yǎng)，模型組大鼠每日手法排尿，記錄尿量。連續(xù)2 周后，大鼠排尿量穩(wěn)定，測定假手術組和模型組大鼠的尿流動力學指標，評估完全性SSCI后NB 大鼠模型情況。

1.5 干預

模型復制后大鼠正常飼養(yǎng)至第2 周結束，將模型復制成功的大鼠再次隨機分為模型對照組、電針組、電針對照組，每組12 只。

4 組大鼠干預因素如下：假手術組不作處理，正常飼養(yǎng)7 d。模型對照組，再次分組后不作處理，正常飼養(yǎng)7 d。電針組以0.3 mm×25.0 mm 毫針直刺，連接電針儀，正極連接大椎穴，負極連接次髎穴，電針儀參數(shù)設定為疏密波，10/50 Hz（疏波10 Hz/9 s，密波50 Hz/5 s），留針20 min，強度以針刺處出現(xiàn)規(guī)律性收縮抽動為宜，1 次/d，連續(xù)7 d；參照文獻準確定位[13-14]，大椎穴：背部正中第7 頸椎和第1 胸椎間，直刺5 mm。次髎穴：第2、3 骶骨的棘突間隙正中偏上旁開5～10 mm（左右隔日交替進行），直刺5～12 mm。電針對照組的針刺點分別選取以大椎穴、次髎穴為中心旁開10 mm 處（遠脊柱側）[15]，針刺，電針儀參數(shù)同上，留針20 min，1 次/d，連續(xù)1 周。

1.6 尿流動力學檢測

末次電針干預完成后1 h，各組大鼠以1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后手法按壓大鼠下腹部進行輔助排尿，排空膀胱后將大鼠仰臥位固定在手術臺上，導管經(jīng)三通管連接測壓通道及微量灌注泵，排空管腔氣體，導管潤滑后經(jīng)尿道插入大鼠膀胱并固定，此時壓力值為膀胱基礎壓力，隨后以7.5 ml/h 的速度進行溫生理鹽水灌注，觀察隨膀胱灌注量的增加大鼠膀胱壓力的變化。尿道口有液體流出時，即為膀胱漏尿點壓力和膀胱最大容量。漏尿后繼續(xù)灌注至逼尿肌壓力穩(wěn)定，取壓力峰值為膀胱最大壓力，計算得出膀胱順應性。

1.7 CyclinD1、Ngn1 mRNA和蛋白檢測

尿流動力學檢測完成后，頸椎脫位處死大鼠，于脊髓橫斷處，向下截取脊髓殘端5～10 mm，分置2 份于1.5 ml 凍存管中，置入-80℃冰箱冷凍保存，一份用于RT-PCR 檢測CyclinD1 和Ngn1 mRNA 表達，另一份用于Western blotting 法檢測CyclinD1 和Ngn1蛋白表達。向上截取脊髓殘端5～10 mm，浸泡于4%多聚甲醛溶液中，常溫固定24 h 以上，用于免疫組織化學法檢測CyclinD1、Ngn1的表達。

1.7.1 RT-PCR 檢測各組大鼠脊髓組織中CyclinD1、Ngn1 mRNA 表達Trizol 裂解法提取脊髓組織中總RNA，采用逆轉錄試劑盒，將RNA 逆轉錄為cDNA，然后再以CyclinD1、Ngn1 擴增引物（見表1）為模板，進行PCR 擴增，擴增產物在瓊脂糖凝膠中進行水平電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)中采集電泳圖像，并測定目的基因和內參基因擴增產物條帶的積分光密度值，以大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 條帶與βactin 條帶灰度值的比值表示mRNA 相對表達量。

表1 引物序列

1.7.2 Western blotting 檢測脊髓組織中CyclinD1、Ngn1蛋白表達常規(guī)提取脊髓組織中總蛋白，進行蛋白定量，加入5×上樣緩沖液，沸水浴中變性5 min，按照50 μg/孔的蛋白總量進行垂直電泳，電泳完成后，采用濕轉法將凝膠中蛋白轉印至PVDF 膜，取出PVDF 膜，TBST 緩沖液沖洗，5%BSA 封閉液中封閉1 h，浸泡于一抗（1∶500）中，4℃孵育過夜，次日洗膜，浸泡于二抗（1∶2 000）中，室溫搖床上震蕩孵育2 h，洗膜，將PVDF膜放入凝膠成像分析系統(tǒng)中，滴加ECL 發(fā)光液，采集條帶照片，以β-actin 為內參，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為該目的蛋白的相對表達量。

1.7.3 免疫組織化學法檢測脊髓組織中CyclinD1、Ngn1 蛋白表達常規(guī)制備石蠟切片，切片厚度為5 μm，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至水，浸入檸檬酸鹽緩沖液中，沸水浴中加熱20 min 進行抗原修復。滴加3%H2O2去除內源性過氧化物酶。滴加5%BSA 封閉液，封閉15 min，分別滴加CyclinD1 抗體和Ngn1抗體工作液，稀釋度為1∶300，4℃孵育過夜。次日洗片后滴加二抗工作液，37℃恒溫水浴鍋中孵育1 h，洗片后滴加DAB 顯色液，顯色3～10 min，需實時觀察切片染色情況，自來水下沖洗，終止染色。蘇木精復染后1%鹽酸乙醇分化，中性樹膠封片，數(shù)碼顯微鏡下觀察切片。選取染色良好區(qū)域，每張切片拍攝5 張照片，測定每個視野的平均光密度值，5 張照片的平均值作為該目的蛋白的相對量。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察

術前所有實驗大鼠食水、活動正常，自主排尿。術后假手術組大鼠常規(guī)護理，較術前差異不大。模型組大鼠1～2 h 麻醉蘇醒，雙后肢無任何運動，食水量下降，出現(xiàn)自嚙、血尿、腹脹、腸梗阻等情況，均予以對癥處理。至模型復制成功前共剔除12 只大鼠（術后BBB 評分> 0 分4 只，自嚙1 只，血尿1 只，腹脹1 只，腸梗阻2 只，第15 天仍存在尿潴留3 只）。

2.2 模型評價

2.2.1 BBB 評分假手術組大鼠的BBB 評分為（21.000±0.000）分，無行動功能障礙，模型復制后模型組大鼠的BBB 評分為（0.080±0.279）分，行動功能下降。假手術組和模型組大鼠BBB 評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=257.755，P=0.000）。

2.2.2 尿流動力學的變化術后第15 天，假手術組和模型組大鼠的膀胱基礎壓力、膀胱最大壓力、膀胱漏尿點壓力、膀胱最大容量及膀胱順應性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），模型組大鼠膀胱基礎壓力、膀胱最大壓力及膀胱漏尿點壓力升高，膀胱最大容量和膀胱順應性降低。見表2。

表2 兩組大鼠尿流動力學結果比較 （±s）

表2 兩組大鼠尿流動力學結果比較 （±s）

組別n 膀胱基礎壓力/cmH2O 膀胱最大壓力/cmH2O 膀胱漏尿點壓力/cmH2O 膀胱最大容量/ml 膀胱順應性/（ml/cmH2O）假手術組模型組t 值P 值12 48 19.800±1.914 36.902±2.144-24.535 0.000 38.050±2.681 60.345±2.865-23.701 0.000 37.325±2.897 53.818±2.636-18.320 0.000 5.100±1.421 0.702±0.165 18.597 0.000 0.292±0.119 0.030±0.007 13.435 0.000

2.3 電針干預后尿流動力學的變化

電針干預后4 組大鼠膀胱基礎壓力、膀胱最大壓力、膀胱漏尿點壓力、膀胱最大容量、膀胱順應性比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與假手術組比較，其余3 組大鼠膀胱基礎壓力和膀胱最大壓力升高（P<0.05），膀胱最大容量和膀胱順應性降低（P<0.05），模型對照組和電針對照組膀胱漏尿點壓力升高（P<0.05），電針組膀胱漏尿點壓力差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與模型對照組比較，電針組大鼠膀胱基礎壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點壓力降低（P<0.05），膀胱最大容量和膀胱順應性升高（P<0.05）；模型對照組與電針對照組比較，尿流動力學檢測結果無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與電針組比較，電針對照組大鼠膀胱基礎壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點壓力升高（P<0.05），膀胱最大容量和膀胱順應性降低（P<0.05）。見表3。

表3 4組大鼠電針干預后尿流動力學結果比較 （n=12,-x± s）

2.4 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1 mRNA表達比較

4 組大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 mRNA 表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與假手術組比較，其余3組CyclinD1 mRNA表達升高（P<0.05），Ngn1 mRNA表達降低（P<0.05）；與模型對照組比較，電針組CyclinD1 和Ngn1 mRNA表達升高（P<0.05）；模型對照組與電針對照組CyclinD1 和Ngn1 mRNA 表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與電針組比較，電針對照組CyclinD1和Ngn1 mRNA表達降低（P<0.05）。見表4和圖1。

表4 4組大鼠脊髓組織中Cyclin D1和Ngn1 mRNA表達比較 （n=12,-x± s）

圖1 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1 mRNA表達

2.5 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1蛋白表達比較

4 組大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與假手術組比較，其余3組CyclinD1蛋白表達升高（P<0.05），模型對照組和電針對照組Ngn1蛋白表達降低（P<0.05），電針組Ngn1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與模型對照組比較，電針組CyclinD1和Ngn1蛋白表達升高（P<0.05），電針對照組CyclinD1和Ngn1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與電針組比較，電針對照組CyclinD1 和Ngn1蛋白表達降低（P<0.05）。見表5和圖2。

表5 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1蛋白表達比較（n=12,-x± s）

圖2 4組大鼠脊髓組織中CyclinD1和Ngn1蛋白表達

2.6 4 組大鼠脊髓組織切片的CyclinD1 和Ngn1蛋白表達

4 組大鼠脊髓組織切片CyclinD1 和Ngn1 蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較，與假手術組比較，其余3組CyclinD1蛋白表達升高（P<0.05），模型對照組和電針對照組Ngn1 蛋白表達降低（P<0.05），電針組Ngn1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與模型對照組比較，電針組CyclinD1 和Ngn1蛋白表達升高（P<0.05），電針對照組CyclinD1 和Ngn1 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與電針組比較，電針對照組CyclinD1 和Ngn1蛋白表達降低（P<0.05）。見表6和圖3、4。

表6 4組大鼠脊髓組織切片的CyclinD1和Ngn1蛋白表達比較 （n=12,-x± s）

圖3 4組大鼠脊髓組織切片中CyclinD1蛋白表達 （IHC×400）

圖4 4組大鼠脊髓組織切片中Ngn1蛋白表達 （IHC×400）

3 討論

中國傳統(tǒng)醫(yī)學歸納完全性SSCI 后NB 的病機為：督脈不通、淤血凝滯[16]。督脈上始于腦，下止于骶，經(jīng)脊里與五臟六腑氣血經(jīng)脈相表里。與西醫(yī)脊髓生理解剖定位相一致。電針大椎穴和次髎穴為干預手段，在取穴上嚴格做到單一變量控制，在體內形成一條正負電流，達到通督補腎、恢復膀胱氣化功能，改善臨床癥狀。有研究證實[17]，電針在促進內源性神經(jīng)干細胞增殖分化中發(fā)揮著重要作用。

本研究復制完全性SSCI后NB大鼠模型，以BBB評分作為模型大鼠雙下肢行為學評價的“金標準”，判斷模型大鼠脊髓是否為完全損傷。與假手術組大鼠比較，模型組大鼠BBB 評分下降，證明模型組大鼠雙后肢完全喪失運動功能，脊髓橫斷。術后大鼠正常飼養(yǎng)至第15 天，采用尿流動力學檢測，形成“高壓低順應性”膀胱。在電針干預1周后再次采用尿流動力學檢測，與模型對照組比較，電針組大鼠膀胱基礎壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點壓力下降，膀胱最大容量和膀胱順應性升高；與電針組比較，電針對照組大鼠膀胱基礎壓力、膀胱最大壓力和膀胱漏尿點壓力升高，膀胱最大容量和膀胱順應性下降。說明電針大椎穴和次髎穴可以有效調節(jié)完全性SSCI后NB大鼠的排尿功能。

SCI 后內源性神經(jīng)干細胞出現(xiàn)短暫性增殖反應增強，Wnt/β-catenin 信號通路可調控內源性神經(jīng)干細胞增殖和分化為功能性神經(jīng)元[18]。電針大椎穴和次髎穴能夠進一步激活Wnt/β-catenin 信號通路，上調Wnt-1、β-catenin mRNA及蛋白的表達[11]。Cyclin D1和Ngn1 是Wnt/β-catenin 信號通路下游靶基因[19]。CyclinD1 是細胞周期增殖信號的關鍵蛋白。羅時鵬等[20]研究表明，CyclinD1 與β-catenin 的表達呈正相關。本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)[11]，完全性SSCI 能夠激活Wnt/β-catenin 信號通路，與假手術組比較，模型對照組β-catenin 的表達升高，與模型對照組比較，電針組β-catenin 的表達升高。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，其他3組大鼠CyclinD1 mRNA 及蛋白表達升高；與模型對照組比較，電針組大鼠CyclinD1 mRNA及蛋白表達升高；與電針組比較，電針對照組大鼠Cyclin D1 mRNA 及蛋白表達水平降低。Ngn1 在神經(jīng)分化中起重要作用[21]。有研究表明[22]，完全性SCI后假手術組與模型組均未檢出Ngn1 mRNA 的表達。在SCI 后Ngn1 的表達與假手術組比較呈下降趨勢[23]。張巧梅[24]的研究發(fā)現(xiàn)，Ngn1 能夠短暫表達于神經(jīng)增殖細胞，當神經(jīng)增殖細胞分化為成熟的神經(jīng)細胞類型后其表達消失。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組比較，模型對照組大鼠Ngn1 mRNA 及蛋白表達降低；與模型對照組比較，電針組大鼠Ngn1 mRNA 及蛋白表達升高；與電針組比較，電針對照組大鼠Ngn1 mRNA及蛋白表達水平降低。說明電針干預能夠增加Ngn1在模型大鼠脊髓組織中的表達，促進內源性神經(jīng)干細胞進一步分化，恢復受損組織神經(jīng)功能。大鼠脊髓組織中CyclinD1 和Ngn1 mRNA 及蛋白在電針組和電針對照組的表達比較差異有統(tǒng)計學意義，證明取穴準確，具有相對特異性。

綜上所述，電針大椎穴、次髎穴對完全性SSCI后NB 大鼠尿流動力學具有明顯改善作用，其作用機制之一是通過調控Wnt/β-catenin信號通路中CyclinD1和Ngn1 mRNA 及蛋白表達，促進脊髓內源性神經(jīng)干細胞的增殖和活化而實現(xiàn)。在今后的研究中，應增加時間點的選擇，以便研究觀察指標的變化趨勢，尋求最佳治療周期。在確定最佳治療周期的基礎上，繼續(xù)探討治療后有效性的持續(xù)時間，細化研究內容，精確指導臨床應用；進一步完善Wnt信號通路中其他相關蛋白的檢測，增加Wnt信號通路中關鍵蛋白抑制劑應用后的變化研究，繼續(xù)探討Wnt信號通路中相關因子變化與神經(jīng)干細胞標志物Nestin表達的相關性。