循環(huán)腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究進展

李奇棟，許慶文，孫利君（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，廣東湛江 524000）

由于人口老齡化和工業(yè)化的進展，生活方式的改變等原因，惡性腫瘤已成為嚴(yán)重威脅全世界人群健康的主要公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)GLOBOCAN 2018顯示，全球惡性腫瘤新發(fā)病例約1808萬例，死亡病例約956萬例[1]，中國新發(fā)與死亡病例分別約占23.7%和30.0%，發(fā)病率均高于世界平均水平。面對這一嚴(yán)重問題，腫瘤的早期診斷與及時治療成為了關(guān)鍵。近些年來，生物技術(shù)獲得巨大進展，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的大力推進，腫瘤的“液體活檢”被提出并且備受關(guān)注，其中循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)作為“液體活檢”的一種，CTCs只需抽取患者少許靜脈血作為標(biāo)本即可，且具有特異性強的特點。隨著近些年來，關(guān)鍵技術(shù)問題的解決，CTCs在臨床的應(yīng)用逐漸興起。

1 CTCs

1869年，澳大利亞病理學(xué)家 Thomas Ashworth首次提出了循環(huán)腫瘤細胞，是指由實體腫瘤細胞受到細胞內(nèi)外多種細胞因子的作用和調(diào)控下從腫瘤組織脫落或進入血液循環(huán)，而這其中絕大多數(shù)的腫瘤細胞在免疫系統(tǒng)的識別殺傷及自身凋亡的作用下死亡，只有極為少數(shù)的腫瘤細胞存活下來，這些細胞具有極高的侵襲作用和轉(zhuǎn)移傾向，它們發(fā)生黏附、聚集并在特定的條件下形成腫瘤微栓，繼而實現(xiàn)了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[2]。相比傳統(tǒng)的輔助檢測外周血中的CTCs快捷無創(chuàng)，對于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤、動態(tài)檢測療效和評估預(yù)后等都具有極高的臨床應(yīng)用價值。

2 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)

細胞通過下調(diào)上皮特性并獲得間質(zhì)特性的想法是在 20世紀(jì) 80年代初由 Elizabeth Hay提出的，她描述了雞胚胎原始發(fā)育中上皮到間質(zhì)的表型變化，從而提出 EMT[3]。EMT是指上皮表型細胞在一定條件的下出現(xiàn)上皮表型的特征蛋白表達下調(diào)而間質(zhì)表型細胞的特征蛋白表達上調(diào)即細胞發(fā)生細胞極性丟失，使得運動能力增強的過程[4]。在這過程中，細胞不僅下調(diào)上皮表型蛋白的表達，同時改變其基因的表達程序，使得細胞骨架結(jié)構(gòu)及形態(tài)學(xué)發(fā)生轉(zhuǎn)變，并改變細胞與細胞外基質(zhì)的相互作用，從而促進細胞的遷移。EMT是胚胎發(fā)育(Ⅰ型)和傷口愈合(Ⅱ型)中不可或缺的一部分，并在病理上促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展(Ⅲ型)。EMT的過程中復(fù)雜的細胞表型和分子標(biāo)志物的變化是由多個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的信號通路參與并調(diào)節(jié)其發(fā)生與變化。

2.1 EMT的效應(yīng)蛋白

許多著名的 EMT效應(yīng)蛋白都是亞細胞結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白可以區(qū)分細胞的上皮或間質(zhì)表型。在EMT過程中，上皮表型的特征性蛋白的關(guān)鍵分子成分受到不同程度的調(diào)控。例如，E-鈣黏素(Ecadherin)、細胞角蛋白(Cytokeratin)、橋粒蛋白(Desmoplakin)和緊密連接蛋白(Occludin)等，都有不同程度的下調(diào)，其中 E-鈣黏素被認(rèn)為是上皮細胞表型的關(guān)鍵，它維持著上皮細胞之間的穩(wěn)定性和細胞極性[5]。當(dāng)上皮來源的腫瘤細胞發(fā)生 EMT時，E-鈣黏素的基因轉(zhuǎn)錄受到抑制[6]，啟動子甲基化以及蛋白質(zhì)磷酸化和降解都使其表達下調(diào)[7-8]，導(dǎo)致細胞的黏附連接的分解，編碼緊密連接蛋白和橋粒蛋白的基因亦受到抑制，這促進了緊密連接和橋粒連接的溶解。此外，E-鈣黏素的下調(diào)，證實可以讓從原位脫落的腫瘤細胞避免失巢凋亡的影響[9]。這些基因表達的變化抑制了上皮細胞的連接，并使其失去游離面-基底面極性[10]。

而一些非上皮性鈣黏素，如 N-鈣黏素(Ncadherin)，整合素β6(Integrin β6)在 EMT發(fā)生后表達增加[11]。具體來說，E-鈣黏素的下調(diào)被 N-鈣黏素的表達增加平衡[12]，經(jīng)過這種平衡，細胞失去了與上皮細胞的聯(lián)系，獲得了對間質(zhì)細胞的親和力[13]。與E-鈣黏素的作用相反，N-鈣黏素通過α-catenin和βcatenin與細胞骨架連接，N-鈣黏素還激活 Rho家族GTPase信號通路，增強成纖維細胞生長因子(FGF)信號通路，并調(diào)節(jié) Wnt信號通路。纖維連接蛋白(Fibronectin)是間質(zhì)表型細胞遷移所需的一種細胞外蛋白，經(jīng)常在 EMT激活時被誘導(dǎo)。此外，在 EMT的過程中的中間絲組成隨著細胞角蛋白的抑制和波形蛋白(Vimentin)表達的激活而改變。

綜上所述，EMT效應(yīng)分子的切換不僅有助于腫瘤細胞的運動，而且在某種程度上還促進它們在血流中的增殖和生存能力，從而增加了遠處轉(zhuǎn)移形成的可能性。

2.2 調(diào)控EMT的轉(zhuǎn)錄因子

EMT程序的執(zhí)行使得細胞發(fā)生骨架的改變及形態(tài)學(xué)的轉(zhuǎn)變，而調(diào)控 EMT的轉(zhuǎn)錄因子逐漸被發(fā)現(xiàn)。總體來說，下面三類轉(zhuǎn)錄因子被證明是在 EMT過程中的關(guān)鍵，因此被認(rèn)為是EMT的核心轉(zhuǎn)錄因子。

第一類是含有鋅指結(jié)構(gòu)的 DNA結(jié)合蛋白 Snail，包括 Snail1和Snail2，它們在胚胎發(fā)育、傷口愈合、腫瘤發(fā)生發(fā)展期間激活 EMT。Snail通過羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域與E-鈣黏素基因啟動子區(qū)的E-box區(qū)域結(jié)合來抑制上皮表型基因，使 E-鈣黏素表達下降，除了抑制上皮表型基因外，Snail還激活了促進間質(zhì)表型的基因，使得 N-鈣黏素表達上調(diào)[14-15]。多項研究表明，Snail的異常表達與乳腺癌[16]、肺癌[17]、結(jié)直腸癌[18]等多種腫瘤的 EMT、侵襲、轉(zhuǎn)移都密切相關(guān)。

第二類是堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子 Twist，包括 Twist1和Twist2，過往研究顯示，Twist的作用于Snail相似，Twist表達下調(diào)上皮表型基因，激活間質(zhì)基因表達，在癌細胞中，Twist抑制 E-鈣黏素并 N-鈣黏素的表達，并不依賴 Snail[19]。最近，有研究證明Twist可上調(diào)波形蛋白的表達，促使結(jié)直腸癌HCT116細胞及 SW480細胞形態(tài)學(xué)上轉(zhuǎn)變?yōu)榇黹g質(zhì)表型的梭形，上調(diào)其侵襲能力[20]。該研究表明，Twist調(diào)控結(jié)直腸癌細胞的 EMT程序，促使其侵襲及轉(zhuǎn)移[21]。另有研究證明，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia indu-cible factors1α，HIF1α)在缺氧條件下可誘導(dǎo)Twist表達[22]，從而促進 EMT。此外機械應(yīng)激誘導(dǎo)果蠅黑腹上皮細胞中Twist表達，該方式依賴于β-catenin[23]。

第三類是 ZEB家族的ZEB1，屬于鋅指蛋白類的轉(zhuǎn)錄因子。ZEB1作為EMT的轉(zhuǎn)錄因子，其最顯著的作用是直接抑制 E-鈣黏素的表達，也有報道稱，ZEB1可以控制涉及EMT其他方面的基因表達，例如可直接激活波形蛋白、抑制極性蛋白1(protein associated with Lin seven 1，PALS1)及激活基質(zhì)金屬蛋白酶如膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1(membrane type-1 matrix metalloprpteinase，MT1-MMP)[24]，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

除了上述核心轉(zhuǎn)錄因子，還發(fā)現(xiàn)其他轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)或調(diào)節(jié) EMT程序，其中有一部分屬于GATA家族，其特征是具有與DNA結(jié)合的雙鋅指結(jié)構(gòu)域，控制著不同細胞的分化，它們通過調(diào)節(jié)上皮細胞之間的連接所需基因的表達來促進 EMT，還有一些是屬于 SOX家族，它們與Snail1和Snail2協(xié)同驅(qū)動EMT。這些新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子對 EMT程序的調(diào)控作用，以及與Snail、Twist或 ZEB1的功能關(guān)系還沒有很好的確定。

總之，在 EMT過程中，不同的轉(zhuǎn)錄因子在不同類型的細胞或者組織下，通過不同的信號通路傳導(dǎo)有著不同的影響，它們互相調(diào)控彼此的表達，對目標(biāo)基因上進行效應(yīng)性整合，進而在轉(zhuǎn)錄水平上促進EMT過程。

2.3 EMT誘導(dǎo)物

一般認(rèn)為，腫瘤細胞發(fā)生的 EMT是對腫瘤微環(huán)境中的細胞外信號作出的反應(yīng)，這其中是多種信號通道共同合作的結(jié)果。轉(zhuǎn)化生長因子 -β(transforming growth factor-β)信號通路在腫瘤的 EMT過程中有著重要作用，通過是否存在 Smad介導(dǎo)的可以將TGF-β信號通路分為：Smad介導(dǎo)的 TGF-β信號通路，即TGF-β與細胞膜上 TGF-β受體Ⅱ結(jié)合，被活化的TGF-β受體Ⅱ募集并結(jié)合TGF-β受體Ⅰ，形成異源三聚體，使 Smad2/Smad3磷酸化，Smad4參與協(xié)助活化的 R-smad向核轉(zhuǎn)移并保持其轉(zhuǎn)錄活性，進入細胞核后使 Snail、Twist、ZEB1等轉(zhuǎn)錄因子表達增加，從而調(diào)控EMT[25]。其中Smad復(fù)合物不僅能激活特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達，而且還能提高轉(zhuǎn)錄因子的活性，TGF-β通過 Smad3的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo) Snail1的表達，而Smad3還可以間接誘導(dǎo) Snail2的表達。Smad3-Smad4協(xié)同 Snail1，從而進一步增加 TGF-β的激活對 E-鈣黏素和緊密連接蛋白編碼蛋白的抑制作用。

非 Smad介導(dǎo)的 TGF-β信號通路，它是通過激活PI3K-AKT-mTOR信號通路進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控[26-27]，進而激活 mTORC1和mTORC2，其中 mTORC1促進細胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變、蛋白質(zhì)合成、運動性和侵襲性的增加，而 mTORC2是細胞由上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型所必需。另一方面，TGF-β刺激PAR6(維持上皮細胞極性和緊密連接的調(diào)節(jié)器)在細胞緊密連接處被TGF-β受體 II磷酸化，磷酸化后的 PAR6與其互相作用，導(dǎo)致緊密連接的喪失[28]。TGF-β還可以誘導(dǎo)RhoA的活性[29]，通過激活透明蛋白(DIA1)和Rho相關(guān)激酶(ROCK)來促進肌動蛋白重組，磷酸化肌球蛋白輕鏈(MLC)，激活 LIM激酶(LIMK)，從而抑制絲切蛋白(cofilin)[30]。TGF-β還能通過影響其他誘導(dǎo) EMT過程的信號通路，如 Notch、Wnt以及整合素信號通路等。除了TGF-β信號通路，Wnt/β-catenin信號通路亦被證明與EMT的誘導(dǎo)有關(guān)[31]。在 Wnt/β-catenin信號通路中，Wnt蛋白與特異性受體節(jié)結(jié)合，觸發(fā)細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，抑制GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)的活性，使β-catenin(β-連環(huán)蛋白)無法被降解而在胞漿積聚，并移向核內(nèi)。游離的β-catenin在核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子 TCF/LEF結(jié)合，激活與EMT相關(guān)的靶基因，降低 E-鈣黏素的表達，參與EMT過程[32]。

通過受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)的生長因子也可以誘導(dǎo) EMT。成纖維細胞生長因子(FGF)誘導(dǎo)膀胱癌細胞的EMT伴隨著Snail2的表達、橋粒蛋白的缺失[33]，肝細胞生長因子(HGF)通過 MAPK/ERK信號通路誘導(dǎo) Snail1和Snail2的表達[34]，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)受體激活使乳腺上皮細胞下調(diào) E-鈣黏素、同時上調(diào) N-鈣黏素、波形蛋白及纖維連接蛋白[35]，表皮生長因子則是通過增加對 E-鈣黏素的內(nèi)噬作用，以及通過Snail1和Twist的表達來下調(diào) E-鈣黏素[36]。

腫瘤微環(huán)境也參與調(diào)節(jié) EMT，腫瘤組織過快的生長導(dǎo)致組織缺氧，在缺氧條件下可通過 HIF1α激活 Twist的表達從而啟動 EMT[37]。HIF1α還可通過誘導(dǎo)卵巢癌細胞表達Snail1，致使 E-鈣黏素缺失[38]。炎癥因子白細胞介素-6(IL-6)可通過 JAK-STAT通路誘導(dǎo)Snail1的表達促進EMT[39]。

3 結(jié)論與展望

綜上所述，EMT是由多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路共同形成的信號網(wǎng)絡(luò)，在這些信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控下，腫瘤細胞發(fā)生細胞表型和分子標(biāo)志物的變化，從而實現(xiàn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。充分了解 EMT的發(fā)生機制及其調(diào)節(jié)因素在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，以尋找出可以用于預(yù)測腫瘤轉(zhuǎn)移甚至治療腫瘤的某種關(guān)鍵因子。