纖溶酶的發(fā)掘及應(yīng)用研究進(jìn)展*

蔣維春 綜述，張羽平 審校

江西省景德鎮(zhèn)市第二人民醫(yī)院輸血科，江西景德鎮(zhèn) 333000

近年由血栓引起的疾病逐漸增多，其主要的危害是導(dǎo)致器官內(nèi)局部堵塞，從而導(dǎo)致機(jī)體缺血、缺氧，甚至死亡[1]。治療血栓性疾病首選的是抗凝血類藥物、抗血小板類藥物和溶栓類藥物等[2]?？鼓愃幬镏饕譃楦嗡丶捌湎嚓P(guān)制劑、抗凝血酶藥物和其他抗凝血藥[3]。抗凝血類藥物在臨床上運(yùn)用多年，但其導(dǎo)致機(jī)體血小板減少、出血、不能抑制凝血酶等不良反應(yīng)[4]。以血小板代謝酶類抑制劑、凝血酶抑制劑等為主的抗血小板類藥物適于血小板功能亢進(jìn)患者[5]，但用藥后的胃腸道不良反應(yīng)等也限制了其在臨床上的應(yīng)用[6]。溶栓類藥物主要通過溶解血栓中的纖維蛋白從而溶解血栓[7]。按其在臨床中的應(yīng)用發(fā)展可分為：第一代藥物，以來自人體的尿激酶和鏈激酶為代表；第二代藥物，即組織型纖溶酶原激活劑(tPA)、阿尼普酶、重組葡激酶等；第三代藥物，是基于前兩代藥物改造而來，如瑞替普酶和蘭替普酶等[8]。這些藥物經(jīng)過改進(jìn)仍存在一定的缺陷，如出血風(fēng)險高、價格昂貴、不良反應(yīng)明顯、來源緊缺等[9]。因此，尋找經(jīng)濟(jì)、安全和高效的天然溶栓藥物就顯得尤為重要。纖溶酶是一類能夠溶解血栓主要成分(纖維蛋白)的一類蛋白酶，是主要的溶栓類藥物[2]。近年來，人們不斷從自然界各種生物中尋找和改進(jìn)各種纖溶酶，并且有些已經(jīng)投入市場。目前，從動物、植物和微生物中已發(fā)現(xiàn)和純化出了諸多纖溶酶，并對其作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 纖溶酶的發(fā)掘

1.1源自動物的纖溶酶 動物是重要的溶栓藥物來源,除了早期人們從水蛭、蛇和蚯蚓中分離得到具有溶栓效果的纖溶酶外，人們還從蛤、美洲大蠊和中華圓田螺等其他動物中不斷發(fā)現(xiàn)新的具有溶栓效果的纖溶酶[10-15]。

JIANG等[10]從水蛭中分離到一種相對分子質(zhì)量約為27×103的纖溶酶WPI01，該蛋白N端的8個氨基酸為VVGGVEAR，活性蛋白耐受的最高溫度為40 ℃，pH值在6～10時對活性影響較小，在500 U/mL水平下其溶解血塊的效果好于1 000 U/mL的尿激酶。WU等[12]從威廉環(huán)毛蚓發(fā)現(xiàn)了纖溶酶DPf3，DPf3對纖維蛋白原和血凝塊具有明顯的直接水解能力，對纖溶酶原有微弱的活化活性，被認(rèn)為具有抗血栓形成能力。DPf3可明顯延長活化部分凝血活酶時間，降低纖維蛋白原水平，說明DPf3通過其固有和(或)共同途徑發(fā)揮抗血栓活性，并在凝血第3期發(fā)揮抗血栓活性[12]。DU等[13]在西施舌中分離純化出相對分子質(zhì)量約為30.99×103的纖溶酶，該蛋白具有較強(qiáng)的抗凝血和纖溶活性。PENG等[14]從美洲大蠊中分離純化到纖溶酶，測得其最適溫度為35 ℃，最適pH值為9.0，該酶對癌細(xì)胞的生長有一定的抑制作用。ZHAO等[15]從中華圓田螺中分離到一種纖溶酶，該活性蛋白最適溫度為58 ℃；當(dāng)pH值為7～10時，對該酶的影響較小。

1.2源自微生物的纖溶酶 許多微生物均含有纖溶酶，除早期發(fā)現(xiàn)的來自溶血鏈霉菌的鏈激酶和金黃色葡萄球菌的葡激酶外，近年來研究人員又相繼從細(xì)菌、真菌及微生物發(fā)酵后食品中篩選到具有纖溶活性的物質(zhì)[16-18]。

YANG等[16]發(fā)現(xiàn)來自芽孢桿菌中一種相對分子質(zhì)量約為34×103的胞內(nèi)堿性絲氨酸蛋白酶ISP-SW5，其最適pH值和溫度分別為8.0、40 ℃，能夠被苯甲基磺酰氟和乙二胺四乙酸抑制酶激活，但Ca2+和Zn2+能夠增強(qiáng)其活性。MESHRAM等[17]對來自內(nèi)生真菌的纖溶酶研究發(fā)現(xiàn)，在體外該酶相對分子質(zhì)量約為33×103，能切割纖維蛋白的α和β支鏈，不能切割γ支鏈。KIM等[18]在韓國傳統(tǒng)發(fā)酵食品腌魚中發(fā)現(xiàn)2種纖溶酶JP-Ⅰ和JP-Ⅱ，2種酶相對分子質(zhì)量均約為36×103，JP-Ⅰ最適溫度為50 ℃，最適pH值為8.1，而JP-Ⅱ的最適溫度和最適pH值分別為45 ℃和9.9，兩者均具有金屬蛋白酶的性質(zhì)。

1.3來自植物的纖溶酶 DEA等[19]發(fā)現(xiàn)通過口服來自甜瓜的纖溶酶能夠抑制膠原腎上腺素所導(dǎo)致的大鼠血管血栓形成。GOGOI等[20]從腺茉莉的葉子中分離到相對分子質(zhì)量為30×103的纖溶酶，該蛋白能降解纖維蛋白的α和β支鏈。ZHOU等[21]從傳統(tǒng)的中藥材南蛇藤的果實中發(fā)現(xiàn)了一種纖溶酶NST-50，具有抗凝血、抗血小板活化和抗纖溶等活性。

2 纖溶酶與疾病的關(guān)系

纖溶酶最初被認(rèn)為其主要功能是抗凝血，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，纖溶酶與多種病理有著密切關(guān)系。梁彥等[22]發(fā)現(xiàn)青少年肥胖患者血清尿激酶型纖溶酶原激活物受體水平明顯升高，暗示該受體與肥胖相關(guān)的疾病有一定關(guān)系。倪萍等[23]發(fā)現(xiàn)在冠心病患者中其體內(nèi)纖溶抑制劑抗原水平及活性水平高于健康者，而酶原水平則低于健康者。纖溶酶與癌癥進(jìn)展之間的關(guān)系也逐漸被關(guān)注，血漿激肽酶和高分子量激肽原參與了癌細(xì)胞或免疫細(xì)胞表面的纖維蛋白溶解過程[24]。纖溶酶的促癌功能主要包括以下幾個方面：(1)釋放與癌癥相關(guān)的生長因子[25]；(2)降解促凋亡因子[26]；(3)通過自身或激活促癌因子，從而促進(jìn)血管生成[27]。

另外，纖溶酶相關(guān)因子在炎癥進(jìn)展的多個方面也發(fā)揮重要作用[28]。尿激酶纖溶酶原激活劑及其受體在巨噬細(xì)胞、白細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞外滲過程中起關(guān)鍵作用[29]，如血管內(nèi)皮表面的尿激酶纖溶酶原激活劑及其受體調(diào)節(jié)白細(xì)胞對內(nèi)皮壁的黏附[30]。使用鏈激酶或重組tPA均可引起急性心肌梗死患者補(bǔ)體通路的激活[31]。除了在炎癥進(jìn)程中發(fā)揮作用外，纖溶酶也被報道在炎癥解決過程中調(diào)節(jié)一些關(guān)鍵步驟，如巨噬細(xì)胞的重編程[32]。

3 纖溶酶的臨床應(yīng)用

纖溶酶作為主要的溶栓藥物，既能直接溶解血栓中的纖維蛋白，又能對纖維蛋白原有一定的作用，因此在臨床血栓相關(guān)的多種疾病(急性腦梗死、腦內(nèi)血腫、進(jìn)展性腦卒中、創(chuàng)傷性下肢深靜脈血栓等)的治療中被廣泛使用[7]，且安全性和療效均較好。目前臨床上最常用的溶栓藥物是組織型纖溶酶原激活劑，與第一代纖溶酶相比，組織型纖溶酶原激活劑可特異性溶解血栓纖維蛋白[8]。纖維酶的特異性與蛋白質(zhì)分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域的組織直接相關(guān)。非特異性溶栓劑，如β-溶血性鏈球菌鏈激酶會導(dǎo)致血漿纖維蛋白原耗竭和出血[9]。但組織型纖溶酶原激活劑的缺點(diǎn)是前端溶解，大部分組織纖溶酶原激活物結(jié)合在血栓纖維凝塊前部。這種結(jié)合阻礙了組織型纖溶酶原激活劑進(jìn)入血栓內(nèi)部，使得溶解效果下降，并且這種不均勻的溶解模式會導(dǎo)致更小的血塊形成，并從血液中釋放出來可能再次引起血管的閉塞[8]。已有幾種類型的重組組織型纖溶酶原激活劑商業(yè)化，包括Alteplase、Reta-plase及Tenecteplase，在臨床上治療深靜脈血栓或肺部栓塞[9]。在急性心肌梗死中使用Alteplase可以降低病死率。與單用阿司匹林和肝素相比，早期病死率(最長4周)降低25%[33]。臨床上使用的重組組織型纖溶酶原激活劑需要的總劑量為每例患者≥90 mg，以達(dá)到足夠的溶栓效果。這種高劑量要求主要是由于內(nèi)源性血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1的抑制，在血栓形成時，血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1會進(jìn)一步上調(diào)，升高的血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1水平使血漿組織型纖溶酶原激活劑失活[34]。

重組組織型纖溶酶原激活劑是唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)并被廣泛使用的治療方法，但由于其局限性，只在極少數(shù)患者中使用。因此，關(guān)于開發(fā)效率更高、特異性更強(qiáng)的新型藥物研究呈強(qiáng)勁增長態(tài)勢?？寡獫{纖溶酶原激活物抑制劑-1單克隆抗體可降低血栓動物模型中的纖維蛋白沉積，表明抗血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1是一種有效的抗血栓藥物[35]。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)出大量的小分子或多肽型血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1抑制劑。Tiplasinin，亦稱PAI-039，是一種小分子血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1抑制劑，被認(rèn)為結(jié)合在血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1的vitronectin區(qū)，降低了血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1對組織型纖溶酶原激活劑的抑制，已進(jìn)行了多個血栓性模型和臨床前研究[35]。

4 小 結(jié)

理想的纖溶酶應(yīng)具有活力高、特異性強(qiáng)、藥效持久、價格低、安全等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，纖溶酶的發(fā)現(xiàn)和使用從以鏈激酶和尿激酶為代表的第一代，經(jīng)過纖溶酶原激活劑為代表的第二代和基因工程等生物技術(shù)改造的第三代，但依然具有較大的不良反應(yīng)且價格昂貴。目前，雖然從各種生物中發(fā)掘了各種纖溶酶，但對其研究多停留在體外實驗，少有深入研究其在體內(nèi)的作用機(jī)制。因此，借助現(xiàn)代結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)和酶工程等生物技術(shù)，闡明其機(jī)制是將來的研究方向。另外，從應(yīng)用開發(fā)的角度綜合現(xiàn)有纖溶酶優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用基因工程等技術(shù)設(shè)計開發(fā)出滿足臨床需求的纖溶酶也是纖溶酶開發(fā)應(yīng)用的重點(diǎn)。