軍團(tuán)菌檢測方法研究進(jìn)展*

夏蘭蘭，宿振國 綜述，王 濤△ 審校

1.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濱州 256600；2.濱州醫(yī)學(xué)院煙臺附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東煙臺 264000

軍團(tuán)菌是一類革蘭陰性菌，1976年在美國費(fèi)城召開退伍軍人大會期間，暴發(fā)了一種不明原因的肺炎，稱軍團(tuán)病，次年分離出該病的病原菌，故而得名軍團(tuán)菌，由該菌引起的疾病稱軍團(tuán)菌病。軍團(tuán)菌專性需氧，廣泛存在于自然界，特別是水中，適宜生長溫度為25～37 ℃，但也可在高于或低于該溫度范圍的環(huán)境中生存，甚至可在限制生長的溫度如<20 ℃或>55 ℃條件下存活[1]。該菌為一種機(jī)會致病菌，可以氣溶膠形式存在于空氣中，當(dāng)人體免疫功能低下時(shí)，由呼吸道侵入機(jī)體，到達(dá)肺泡或終末細(xì)支氣管部位生長及繁殖，從而導(dǎo)致軍團(tuán)菌病。目前，已確認(rèn)的軍團(tuán)菌屬有58種，共70個(gè)血清型，能引起約28種人類疾病，其中對人致病的主要是嗜肺軍團(tuán)菌[2]。軍團(tuán)菌病在臨床上可分為肺炎型、肺外感染型及流感樣型。肺炎型又稱軍團(tuán)菌肺炎，是軍團(tuán)菌病的主要類型，該病起病急，發(fā)展快，病情重，救治不及時(shí)可導(dǎo)致死亡；肺外感染型是指感染從肺部播散，導(dǎo)致腦、腎、肝等多器官感染；流感樣型又稱龐蒂亞克熱，是一種自限性疾病[3]。因臨床上大多數(shù)軍團(tuán)菌肺炎患者早期臨床癥狀為乏力、肌肉疼痛、頭痛，發(fā)熱伴寒戰(zhàn)、咳嗽，有少量黏痰，與其他病原體引起的非典型性肺炎相似，所以很難與其他病原體引起的肺炎相區(qū)別，從而造成病死率較高，甚至引起暴發(fā)流行[4]。因此，早期、快速、準(zhǔn)確地檢測出軍團(tuán)菌，對疾病的診斷、治療及降低病死率有重要意義。軍團(tuán)菌用吉姆薩染色時(shí)菌體呈紅色，活體組織標(biāo)本用鍍銀染色法染色后菌體呈黑褐色，但標(biāo)本直接涂片鏡檢的意義不大，本文不做贅述。軍團(tuán)菌檢測的方法較多，包括病原菌的分離鑒定、免疫學(xué)檢測方法、核酸檢測方法等，本文就這些方法進(jìn)行簡要敘述。

1 病原菌的分離鑒定

1.1細(xì)菌培養(yǎng)法 細(xì)菌培養(yǎng)法是診斷軍團(tuán)菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，其特異度為100%，靈敏度為50%～80%[5]。軍團(tuán)菌檢測標(biāo)本可通過采集痰液、下呼吸道分泌物、支氣管灌洗液、胸腔積液、血液等來獲取，采集時(shí)注意避免氣溶膠形成。但軍團(tuán)菌生長對營養(yǎng)要求苛刻，在普通培養(yǎng)基、血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板上均不生長，常用活性炭-酵母浸出液瓊脂(BCYE)培養(yǎng)基培養(yǎng)，且生長速度緩慢，一般需3～5 d，長則需7～14 d，菌落呈圓形、凸起、灰白色，有光澤，某些菌型在紫外線照射下可發(fā)出熒光，在富含L-絡(luò)氨酸-苯丙氨酸瓊脂平板上產(chǎn)生棕色水溶性色素，活的不可培養(yǎng)軍團(tuán)菌的存在及在培養(yǎng)基上過度生長的其他菌會影響培養(yǎng)法的檢測結(jié)果。細(xì)菌培養(yǎng)法對技術(shù)人員要求較高，且操作繁瑣，培養(yǎng)時(shí)間長，故不能快速得到結(jié)果，不利于軍團(tuán)菌病的診治。隨著現(xiàn)代技術(shù)的創(chuàng)新，研究者已陸續(xù)研制出改良的細(xì)菌培養(yǎng)法，可提高培養(yǎng)成功率，如2011年朱兵清等[6]在 BCYE培養(yǎng)基中添加了可抑制環(huán)境水樣中雜菌的抗菌藥物，提高了嗜肺軍團(tuán)菌的分離率。同時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)法也有不可替代的優(yōu)點(diǎn)，如發(fā)現(xiàn)新菌種等[7]?？傊?dāng)臨床懷疑患者為軍團(tuán)菌病時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)法是不可或缺的一種檢測手段。

1.2質(zhì)譜分析技術(shù) 細(xì)菌的傳統(tǒng)手工鑒定步驟為分離純化獲得待鑒定菌株，涂片及革蘭染色鏡檢，根據(jù)革蘭染色性質(zhì)和菌株形態(tài)，輔以氧化酶、觸酶、動力、鞭毛染色、氧化發(fā)酵等試驗(yàn)，對鑒定細(xì)菌進(jìn)行初步分群或分科(屬)，再繼續(xù)應(yīng)用最小數(shù)量的其他試驗(yàn)，逐步縮小鑒定范圍，直至最終獲得鑒定結(jié)果。傳統(tǒng)手工鑒定法步驟繁瑣，周期長，且對操作人員技術(shù)要求高。近年來，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測技術(shù)在臨床微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用越來越廣泛，使用質(zhì)譜儀可以大大縮短細(xì)菌鑒定時(shí)間，并提高準(zhǔn)確性，更有利于臨床抗菌藥物的使用，做到早診斷、早治療，提高患者的生存率。李曲文等[8]應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對10株軍團(tuán)菌進(jìn)行菌株蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析比對，鑒定出8株為嗜肺軍團(tuán)菌，1株為米克戴德軍團(tuán)菌，1株為茴香軍團(tuán)菌，此方法簡便、快速、成本低，不足之處是需要進(jìn)一步規(guī)范標(biāo)本處理、質(zhì)譜圖采集和分析等過程，同時(shí)需要不斷完善數(shù)據(jù)庫和分析軟件。

2 免疫學(xué)檢測方法

2.1尿抗原檢測 有研究通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)在感染軍團(tuán)菌24 h后尿中可出現(xiàn)抗原[9]。軍團(tuán)菌的外膜蛋白、脂多糖和多種蛋白酶可造成肺組織損傷，尿抗原檢測針對的靶標(biāo)即為細(xì)菌脂多糖。自20世紀(jì)90年代中期引入尿抗原檢測后，其逐漸成為軍團(tuán)菌病的主要診斷方法，占軍團(tuán)菌診斷試驗(yàn)的70%～80%，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、放射免疫分析，以及最近發(fā)展的酶免疫分析(EIA)等，但這些方法主要對嗜肺軍團(tuán)菌血清(Lp)1型敏感[10]。由于軍團(tuán)菌病患者的標(biāo)本可用性較低，因此對不同類型菌株的尿抗原檢測評價(jià)仍然比較困難。2017年有研究通過比較Binax?EIA(軍團(tuán)菌尿EIA)、BinaxNOW?(軍團(tuán)菌抗原檢測)、Sofia?FIA(軍團(tuán)菌熒光免疫分析)3種試劑盒的靈敏度，發(fā)現(xiàn)對于Lp1型，Sofia?FIA和Binax?EIA檢測限相似，BinaxNOW?低于其他兩種試劑盒，且與Lp1型相比，這3種試劑盒對Lp2～Lp15型的檢測水平均較低。由此可見，這3種試劑盒對不同嗜肺軍團(tuán)菌血清型的檢測性能不同[11]。

作為現(xiàn)在軍團(tuán)菌檢測主要方法之一，尿抗原檢測具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如抗原出現(xiàn)時(shí)間早，約88%的軍團(tuán)菌病患者在發(fā)病1～3 d即可在尿中檢測到抗原，可以為早期診療提供依據(jù)；此方法操作簡單、快速，特異度高，易取得標(biāo)本，且對患者沒有創(chuàng)傷。缺點(diǎn)是只對Lp1型敏感，對其他血清型的嗜肺軍團(tuán)菌檢測價(jià)值不大[12]，且檢測試劑盒昂貴，不利于在臨床上推廣應(yīng)用。

2.2血清學(xué)診斷 血清學(xué)檢測對可疑患者診斷有重要意義，因?yàn)槟承┛梢苫颊邿o肺部感染癥狀，或下呼吸道未產(chǎn)生足量分泌物，標(biāo)本不易獲取。血清學(xué)診斷包括微量凝集試驗(yàn)和ELISA。早在1996年，米亞英等[13]就結(jié)合此兩種方法診斷出國內(nèi)首例佐丹軍團(tuán)菌病。但是，微量凝集試驗(yàn)主要以整個(gè)菌體作為診斷抗原，這就導(dǎo)致嚴(yán)重的非特異性凝集，導(dǎo)致該試驗(yàn)的特異度較低。ELISA檢測患者血清中嗜肺軍團(tuán)菌IgG總抗體，其結(jié)果判定更加客觀、準(zhǔn)確。但是，目前市場上用于診斷嗜肺軍團(tuán)菌的試劑盒是用嗜肺軍團(tuán)菌全細(xì)胞蛋白為包衣抗原，往往在不同血清型或種屬間存在交叉反應(yīng)。因此，目前，臨床上對于軍團(tuán)菌肺炎的血清學(xué)診斷仍缺少一種快速、準(zhǔn)確的方法。2015年有研究曾分離并純化出嗜肺軍團(tuán)菌蛋白FLA、MOMP、MIP、IP和PILE，并將這5種純化蛋白作為包衣抗原檢測嗜肺軍團(tuán)菌血清抗體，其IgG抗體的靈敏度為90.4%,特異度為97.4%；IgM抗體的靈敏度為91.8%，特異度為95.1%[14]。王濤等[15]也成功誘導(dǎo)表達(dá)及純化出重組MOMP蛋白，將其作為診斷抗原建立了間接ELISA，結(jié)果顯示IgG抗體靈敏度為90.9%，特異度為91.7%，IgM抗體靈敏度為91.4%，特異度為90.6%，IgA抗體靈敏度為92.1%，特異度為88.9%，這為軍團(tuán)菌病血清學(xué)診斷試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。但是，不同軍團(tuán)菌屬細(xì)菌之間、軍團(tuán)菌與其他細(xì)菌之間有交叉抗原，軍團(tuán)菌多克隆抗體與某些細(xì)菌可產(chǎn)生交叉反應(yīng)，故血清學(xué)檢測只能作為輔助性、回顧性診斷手段。

3 核酸檢測方法

3.1聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及其衍生技術(shù) PCR是一種由 DNA 聚合酶催化的特定序列體外擴(kuò)增技術(shù)，突破了核酸的原料限制，可將極微量的生物標(biāo)本中靶核酸在短時(shí)間內(nèi)大量復(fù)制擴(kuò)增至可檢測范圍，具有高效、操作簡單的特點(diǎn)，已成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究,乃至臨床疾病診斷不可或缺的工具。嗜肺軍團(tuán)菌常用的檢測模板為16S rRNA、5S rRNA、23S-5S rRNA、mip或dotA[16]，PCR擴(kuò)增后，不僅可鑒定軍團(tuán)菌，還可以分辨軍團(tuán)菌屬。雖然PCR特異度高，但靈敏度較差，特別是對于痰液標(biāo)本，由于含菌量較少，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。另外，常規(guī)PCR在產(chǎn)物分析時(shí)需要開蓋操作，容易引起交叉感染，導(dǎo)致假陽性。為更快、更好地檢測軍團(tuán)菌，學(xué)者們已研究出一系列以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)。

3.1.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[17]。 GINEVRA等[18]利用全基因組測序數(shù)據(jù)，開發(fā)并驗(yàn)證了一種靈敏度、特異度較高的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，即通過擴(kuò)增lpp1868基因檢測ST1克隆復(fù)合物中的Lp1，結(jié)果顯示靈敏度為95%，特異度為100%。這種新的PCR檢測方法是一種可靠的工具，將有助于改進(jìn)軍團(tuán)菌的檢測和鑒別，為軍團(tuán)菌病的預(yù)防和控制進(jìn)一步奠定了基礎(chǔ)。

3.1.2巢式PCR 巢式PCR需對靶DNA進(jìn)行兩次擴(kuò)增，第二次擴(kuò)增所用的模板為第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物。巢式PCR通常設(shè)計(jì)兩對引物，第二對引物(第二次擴(kuò)增所用引物)在靶序列上的位置應(yīng)設(shè)計(jì)在第一對引物的內(nèi)側(cè)。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性(因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的引物很少)，增加了檢測的靈敏度；有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。

嗜肺軍團(tuán)菌可生活在水域系統(tǒng)中，WEN-CHIEN等[19]利用巢式PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳來檢測河水標(biāo)本中的軍團(tuán)菌群落，發(fā)現(xiàn)每種軍團(tuán)菌都有自己的條帶模式，從而發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)菌群落的多樣性。同時(shí)，這種方法還可能發(fā)現(xiàn)環(huán)境中存在的未知軍團(tuán)菌，甚至其他病原體。

3.1.3多重PCR 常用的PCR僅應(yīng)用一對引物，通過擴(kuò)增后產(chǎn)生一個(gè)核酸片段，主要用于單一致病因子檢測。多重PCR又稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，它是在同一PCR反應(yīng)體系里加入多對引物，同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣品中同一靶DNA或不同靶DNA的多個(gè)不同序列片段。臨床上常用于病原體分型或鑒定。2014年吳冬雪等[20]建立了一種多重PCR技術(shù)結(jié)合基因芯片的檢測方法，成功研制了嗜肺軍團(tuán)菌O血清型分型基因芯片，實(shí)現(xiàn)了嗜肺軍團(tuán)菌15種血清型的快速、準(zhǔn)確檢測，使軍團(tuán)菌的診斷又邁出了一大步，并提供了新的思路與方向。

3.2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) LAMP是NOTOMI等[21]于2000年開發(fā)的一種在等溫條件下對DNA進(jìn)行高特異度、高效率、快速擴(kuò)增的檢測方法，即利用1種DNA聚合酶和4種特殊設(shè)計(jì)的引物在等溫條件(63 ℃左右)下保溫30～60 min，完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP作為一種全新的核酸擴(kuò)增方法，與常規(guī)PCR相比，具有簡單、快速、特異度高的特點(diǎn)。目前，許多病原體都可通過LAMP進(jìn)行快速檢測，如沙眼衣原體[22]。

LAMP的創(chuàng)新又為檢測軍團(tuán)菌提供了新思路，如MOOSAVIAN等[23]就曾采用培養(yǎng)法、PCR和LAMP對2016年6月至2017年3月在伊朗阿瓦茲教學(xué)醫(yī)院住院的肺炎患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行軍團(tuán)菌檢測，結(jié)果表明，培養(yǎng)法陽性率為1%，PCR和LAMP檢測軍團(tuán)菌陽性率分別為3%和7%，由此可以得出，LAMP檢測軍團(tuán)菌優(yōu)于培養(yǎng)法和PCR。

4 其 他

軍團(tuán)菌主要污染供水系統(tǒng)、空調(diào)冷卻水、呼吸機(jī)等，也可形成帶菌氣溶膠，通過空氣傳播，一旦暴發(fā)流行將嚴(yán)重危害人們的健康。2016年范曉姍等[24]將軍團(tuán)菌的16S rRNA基因作為基因芯片，創(chuàng)立基因芯片檢測技術(shù)，對空調(diào)冷卻系統(tǒng)等公共衛(wèi)生環(huán)境中的軍團(tuán)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，取得一定成果。但是，此方法成本過高，不利于推廣。因?yàn)榕R床上軍團(tuán)菌肺炎與其他肺炎癥狀相似，不易區(qū)分，MIYASHITA等[25]根據(jù)“男性、無咳嗽、呼吸困難、C反應(yīng)蛋白和乳酸脫氫酶升高及低鈉”等條件，制訂出了一種新的軍團(tuán)菌評分標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分軍團(tuán)菌肺炎和非軍團(tuán)菌肺炎，如果得分≥3分，則診斷為軍團(tuán)菌肺炎，此方法的靈敏度為93%，特異度為75%，也可作為軍團(tuán)菌的一種評估方法。

目前，軍團(tuán)菌病在國內(nèi)外時(shí)有暴發(fā)流行，在美國和歐洲國家的發(fā)病率也一直在增加[26]，且感染存在地區(qū)及季節(jié)差異，是影響公眾健康的一大隱患。因此，準(zhǔn)確高效地檢測軍團(tuán)菌，對軍團(tuán)菌病的防控具有重要意義。隨著科技和知識的發(fā)展，用于檢測軍團(tuán)菌的方法越來越多，筆者相信會有更簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測方法出現(xiàn)，為軍團(tuán)菌的檢測提供更有力的保障，為人們的健康增添一重防護(hù)。