新型抗結(jié)核化合物體內(nèi)外活性評價方法的研究進展

楊瑞芳，蒙建州，李傳友

·綜述·

新型抗結(jié)核化合物體內(nèi)外活性評價方法的研究進展

楊瑞芳，蒙建州，李傳友

101149 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所細菌免疫室（楊瑞芳、李傳友）；100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室（蒙建州）

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性呼吸道傳染病，是全球十大死因之一，也是由單一傳染源導致死亡的主要原因，排名高于艾滋病。2019 年因 TB 死亡的人數(shù)是 120 萬人[1]。MTB 具有特殊的生理特征，包括生長緩慢、自然狀態(tài)下基因突變率較高以及用藥后易形成持留菌株等，導致 TB 治療用藥周期較長、患者的依從性較差，因此耐藥 MTB 的檢出率不斷攀升。2020 年最新 WHO報告顯示，全球 2019 年估計有 1000 萬TB 新發(fā)病例，有近 50 萬人罹患利福平耐藥結(jié)核病（rifampicin resistant tuberculosis，RR-TB），其中 78% 患有耐多藥結(jié)核?。∕DR-TB）[1]。目前，由敏感菌引起 TB 的治療方案是異煙肼（INH）、利福平（RIF）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（EMB）共同給藥 2 個月，然后 INH 和 RIF 再給藥4 個月，而耐藥 TB 療程可達 24 個月。漫長的治療周期也增加了耐藥菌的出現(xiàn)概率[2-3]。我國是 TB 高發(fā)國家，隨著經(jīng)濟高速發(fā)展、人口流動性增大，TB 嚴重威脅著公共健康。科研者們致力于新型抗結(jié)核藥物的篩選和研究，但進展卻極為緩慢。近半個世紀以來只有貝達喹啉和德拉馬尼兩種對各類耐藥 MTB 有效的新藥上市[4-5]，然而，這兩種藥物都具有較強的心臟毒性，而且臨床也很快發(fā)現(xiàn)了對這兩種藥物具有耐藥性的 MTB 突變菌株[6-7]。此外，普托馬尼（PA-824）是美國 FDA 于 2019 年批準的治療 TB 的藥物，并同貝達喹啉（B）和利奈唑胺（L）組成 BPaL 方案治療成人 XDR-TB 和 MDR-TB。但是，由于目前 PA-824 治療 TB 的臨床試驗和安全性存在一定的局限性，仍需進一步的研究提供更多的數(shù)據(jù)支持[8-9]。因此，開發(fā)新型抗結(jié)核藥物，有效控制 TB 已成為亟待研究的重要課題[10]。

目前獲得新型抗結(jié)核藥物研究策略主要采用高通量篩選模型獲得一些對 MTB 具有抑制活性的化合物，但是在基于靶標的分子水平篩選模型研究中，化合物通常缺乏針對整個細胞的活性，因此成功率較低[11-12]。而細胞水平的抑制劑篩選模型通常是以菌株的存活或生長為指標，直接獲得具有抑菌活性的化合物樣品。幾乎全部的抗結(jié)核藥物都是通過這種篩選方式獲得[13-14]。這也表明全細胞表型高通量篩選技術(shù)主導了抗結(jié)核化合物的發(fā)現(xiàn)，采用這一研究策略更有可能獲得具有開發(fā)前景的、具有全新作用機制的候選藥物[15]。對通過全細胞表型高通量篩選獲得苗頭化合物進行體內(nèi)外抗結(jié)核活性評價是評估化合物開發(fā)價值的重要環(huán)節(jié)。因此，本文就化合物體外和體內(nèi)抗結(jié)核活性評價兩方面進行闡述。

1 抗結(jié)核體外活性評價

1.1 最小抑菌濃度

化合物通過抑制 MTB 的生長或殺滅菌株而發(fā)揮抗結(jié)核作用。因此，化合物對 MTB 菌株最小抑菌濃度（MIC）成為評價化合物體外活性的一項非常重要的指標，可以快速評價樣品的活性。目前，測定化合物 MIC 的常用方法可以分為兩大類，一是傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基表型檢測方法；二是液體培養(yǎng)基中 MTB 的生長或能量代謝反應檢測方法。

固體培養(yǎng)基檢測方法以瓊脂稀釋法為代表，基本原理是將不同劑量的化合物加入Middlebrook 7H10 固體培養(yǎng)基中，制成含不同遞減濃度梯度的平板，采用比例法進行實驗。以不含有化合物處理組為陰性對照，培養(yǎng)三周后計算兩組菌落生長數(shù)比值，能夠抑制 99% 或更高 MTB 生長的藥物濃度被認為是其最低抑菌濃度。但是，該方法培養(yǎng)周期較長，化合物容易降解，使結(jié)果偏高[16]。液體培養(yǎng)基常見檢測方法是運用液體培養(yǎng)基對抗結(jié)核化合物進行倍比稀釋，得到不同濃度的化合物，接種新鮮 MTB（濃度約 106CFU/ml），培養(yǎng) 2 ～ 3 周后，肉眼觀察菌的生長情況，以恰好無菌生長所對應的藥物濃度為 MIC。96 孔板法的使用，可控性好，結(jié)果準確[17]。但是，這種方法也存在一定的缺點，包括肉眼觀察可能產(chǎn)生的誤差，以及不能準確判斷實驗中的污染情況[18]。

近年來，在 96 孔板法的基礎上，培養(yǎng)基中加入氧化或還原試劑后繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，在MTB 的代謝作用下發(fā)生還原反應，使顏色發(fā)生變化。其顯色程度與培養(yǎng)基中的活菌數(shù)成正比，可以間接測定 MIC[18]。最初用的顯色劑是噻唑藍（MTT），在活細胞的代謝作用下還原為難溶性的紫色結(jié)晶物沉積在細胞內(nèi)，經(jīng) DMSO 溶解后通過分光光度計測定（波長為590 nm）。近年來，Alarm Blue 顯色劑的發(fā)現(xiàn)，使越來越多的研究者們趨向于應用這種方法來檢測 MTB 的MIC，文獻報道均顯示具有較好的準確性和重復性，因此被廣泛使用[19-20]。

此外，耐藥菌的出現(xiàn)日漸成為未來抗結(jié)核研究中，特別是抗結(jié)核藥物的研發(fā)重點。因此，在抗結(jié)核化合物前期藥效學評價中，有必要測定化合物對臨床耐藥菌株以及 MTB 對其產(chǎn)生耐藥性頻率。

1.2 最小殺菌濃度

目前，臨床上抗結(jié)核菌的藥物分為抑菌和殺菌兩類，抑菌劑通過抑制細菌繁殖發(fā)揮作用，而殺菌劑則是破壞細菌細胞結(jié)構(gòu)導致細菌死亡。通過體外試驗確定藥物致殺率在 99.9% 左右，可以將藥物歸類為殺菌藥物[21-23]。最小殺菌濃度（MBC）的檢測方法通常是在 MIC 的檢測結(jié)果基礎上進一步實驗。因此，在測定 MIC 后，再配置 7H10 培養(yǎng)基平板，在 MIC 實驗中無肉眼可見菌生長的孔內(nèi)取部分菌涂 7H10 平板，在 37 ℃溫箱里再培養(yǎng) 3 ～ 4 周，進行 CFU 計數(shù)，CFU 減少 99.9% 孔內(nèi)對應的化合物濃度即為 MBC。國外一項研究將 MTB 有氧培養(yǎng)至對數(shù)相，接種于含 4 種不同濃度化合物的含有 20% 吐溫 80 和 OADC的 7H9 培養(yǎng)基中，化合物在固定濃度下進行測試，在沒有可用的 MIC 數(shù)據(jù)基礎上，將培養(yǎng)物暴露于化合物中 21 d，并在第0、7、14 和 21 天通過計數(shù)瓊脂平板上的菌落形成單位來測定細胞活力。MBC 被定義為 21 天內(nèi)達到 2log 致死所需的最低濃度[24-25]。

1.3 對 MTB 生長曲線的影響

通過對 MTB 標準株 H37Rv MIC 和 MBC 的測定，可以明確化合物對 MTB 的抑菌和殺菌活性。在 MIC 結(jié)果的基礎上，滕麗艷[26]通過用 1/4 MIC 化合物 E 處理 H37Ra 菌株并繪制生長曲線，同時以正常培養(yǎng)的 H37Ra 菌生長曲線做對照，發(fā)現(xiàn)化合物 E 在亞抑制濃度下，H37Ra 菌株仍在繼續(xù)生長，只是速度減慢，進一步表明化合物 E 對 MTB 的生長有抑制作用。因此，化合物對 MTB 生長曲線的影響也可以作為新型抗結(jié)核化合物體外抗結(jié)核活性的一項重要的評價指標。

1.4 對持留態(tài) MTB 活性的抑制

人們常將 MTB 在宿主體內(nèi)以非增殖方式存在而造成延緩性病程或?qū)е聫桶l(fā)的潛伏菌群稱為持留菌。而持留菌的存在使感染患者體內(nèi)細菌潛伏造成 TB 病程遷延和復發(fā)，使 TB 的治療面臨挑戰(zhàn)。目前所使用的抗生素中，除了吡嗪酰胺對持留菌有抑制活性外，其他大部分的藥物只對復制期的 MTB 起作用[23]。因此，尋找對持留菌有效的藥物是對抗結(jié)核病耐藥問題、縮短用藥周期的有效手段。Loebel等[27]早在 1933 年就發(fā)現(xiàn)在沒有營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中長期培養(yǎng)，或是在培養(yǎng)基和鹽水中暴露于厭氧條件下一段時間后，MTB 生長會受到抑制而處于休眠期。此外，研究者們也發(fā)現(xiàn)其他許多因素，包括 pH 值的變化，NO、CO、金屬離子的過量和不足以及磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏等也可能導致 MTB 在宿主中的休眠狀態(tài)。但是，目前為止，缺氧誘導和營養(yǎng)缺乏模型因較為簡單，且容易操作而更為常用[28-29]。

在缺氧或不含甘油和 OADC 的 7H9 培養(yǎng)基中培養(yǎng) MTB 模擬持留狀態(tài)，分別取培養(yǎng) 3 周和 2 個月的H37Rv菌 5 ml 左右，振蕩 2 ～ 3 min 打散后靜止 30 min 使菌沉淀，加入不同的 EP 管并調(diào)節(jié)菌的濃度至600= 0.1，取適量菌液加入兩個含培養(yǎng)基的瓶中，至菌濃度為 l ×106CFU/ml，各自加入濃度為 2.5 mg/ml 的化合物和 INH（陽性對照），不加化合物為陰性對照。37 ℃恒溫溫箱內(nèi)孵育 3 d 后洗滌菌液并稀釋成不同濃度涂 7H10 平板，37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 3 ～ 4 周后 CFU 計數(shù)，評價化合物對處于持留狀態(tài)的結(jié)核桿菌是否具有殺菌作用[23]。

2 體內(nèi)抗結(jié)核活性

2.1 傳統(tǒng)動物模型對新型抗結(jié)核化合物的體內(nèi)活性評價

藥物進入機體發(fā)揮抗菌作用涉及藥物對機體的作用以及機體對藥物的代謝，評價化合物具有體內(nèi)抑菌活性是新藥研發(fā)過程的關(guān)鍵步驟，動物模型被證實對篩選新藥以及更好地理解宿主-病原體關(guān)系是非常重要的，不同的動物模型在 TB 研究中具有不同的優(yōu)缺點。

小鼠由于價格低廉、遺傳及免疫背景清楚、操作簡單、T 細胞在 MTB 感染免疫應答中的作用和人類一致等優(yōu)點，成為制備 TB 模型最常用的動物。但是，小鼠在初次感染后盡管疾病被控制，但 MTB 量仍保持較高水平，導致疾病呈慢性進行性。此外，MTB 感染后缺乏人類的病理特征，如干酪樣肉芽腫很少發(fā)展為壞死、液化及空洞，而且肺組織出現(xiàn)壞死性改變的時間較長、肺部荷菌量改變幅度較小，不利于對治療和保護作用進行評價，限制了小鼠在 TB 研究中的應用[30-31]。而豚鼠感染 MTB 后，可以形成壞死的原發(fā)性肉芽腫，因此，常用于 TB 發(fā)病機制、病理和免疫的研究中[31]。鄭梅琴等[32]通過構(gòu)建豚鼠 TB 模型，探討異煙肼、莫西沙星、氯法齊明、JYS-1 和 JYS-2 的抗結(jié)核活性。國外一項研究應用 SPF 雌性 SD 大鼠 MTB 感染模型，通過檢測血清中的菌濃度評價苯并噻嗪酮的體內(nèi)抗結(jié)核活性，發(fā)現(xiàn)苯并噻嗪酮是一種有效的臨床耐藥 TB 的治療前候選藥物[33]。Horváti 等[34]通過建立豚鼠結(jié)核感染模型，對抗結(jié)核新藥乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA-pT8 進行了體內(nèi)藥物毒性和抗結(jié)核活性的檢測。但是，豚鼠因感染 MTB 后缺乏潛伏期，且價格較昂貴而存在一定局限性。

兔子感染 MTB 后可形成干酪樣肉芽腫，而且具有潛伏期，因此，也常用于 TB 的研究。缺點是需要高劑量 MTB 才能建立感染模型[35]。Rifat 等[36]利用兔結(jié)核感染模型，評估利福噴丁對不同類型 TB 病灶的滲透性，發(fā)現(xiàn)它對肺空洞病變的滲透性差，且部分解釋了在II 期臨床試驗中，改善治療效果所需的劑量在肺結(jié)核大空洞患者中是無空洞肺結(jié)核患者的4 倍。

斑馬魚發(fā)育周期短、繁殖產(chǎn)量高，與人類基因組具有相似性、具有良好的先天免疫系統(tǒng)以及適應性免疫應答系統(tǒng)的特點[37]，常被用作 TB 模型和藥物篩選工具。劉紅旭等[38]通過建立斑馬魚-海分枝桿菌感染模型科學、有效地研究TB 的免疫病理機制，并在此基礎上研發(fā)新型抗結(jié)核藥物。國外多項研究也證實了斑馬魚在抗結(jié)核機制研究具有重要的意義[39-41]。但是，斑馬魚缺乏 TB 的主要感染器官，且自身并不能很好地清除感染菌，因此在實驗研究中存在局限[37-38]。

果蠅繁殖快、成本低、操作簡單，且有類似脊椎動物的吞噬細胞和固有免疫信號途徑[42]，但缺乏 T、B 細胞，因此，可以作為研究人對 TB 的固有免疫反應的模型，且需要在哺乳動物中進一步驗證[43]。Pushkaran 等[44]通過建立 MTB 感染果蠅模型顯示了阿莫西林-克拉維酸和地奧司明作為一種協(xié)同的聯(lián)合治療 TB 的潛力。

2.2 小動物活體成像技術(shù)在新型抗結(jié)核化合物體內(nèi)活性評價的應用

小動物活體成像技術(shù)是近幾年發(fā)展起來，可應用于 MTB 在活體內(nèi)對新型抗結(jié)核化合物的反應進行觀察。與傳統(tǒng)動物實驗相比，該技術(shù)可以對同一實驗對象持續(xù)觀察，避免因多個時間點造成的個體差異，減少動物的使用量，而且具有更高的靈敏性，可以在感染早期便進行活體觀察，從而篩選出藥物的最佳劑量以及給藥濃度和時間，還可觀察記錄不同劑量藥物對活體的毒副作用，更便捷地評估藥物效力[45]。目前，生物發(fā)光實驗因其特異性強而用于小動物活體成像技術(shù)，它是在 ATP、鎂離子和氧氣的參與下，通過底物熒光素與表達的熒光素酶反應產(chǎn)生生物發(fā)光的光子而發(fā)揮作用[35]，Arranz 和Ripoll[46]描述了生物發(fā)光實驗可用于藥物靶向分布的觀察，從而進行藥效學的評估。

3 小結(jié)

近幾年來，MDR 和 XDR 的不斷出現(xiàn)和增加，全球范圍內(nèi) TB 形勢愈加嚴峻。因此，開發(fā)新型高效的抗結(jié)核藥物是有效控制 TB 的主要策略，特別是篩選出具有抗耐藥 MTB 及持留狀態(tài) MTB 的藥物研究已經(jīng)越來越引起人們的重視。然而，新型抗結(jié)核藥物的研究是一個極其復雜且重要的過程，而體內(nèi)外抗結(jié)核活性的評價是研究抗菌藥物的第一步，也是必要的一步。本文綜述了體外檢測化合物對 MTB 標準株 H37Rv 和臨床耐藥菌株的 MIC、MBC 和體外制備持留菌檢測化合物對潛伏狀態(tài) MTB 的抗結(jié)核活性，以及多種臨床前動物模型的建立來評價體內(nèi)抗菌活性等方法。然而，很多研究如化合物與 INH、RIF 等一線抗菌藥物的聯(lián)合和交叉抗結(jié)核活性，以及細胞毒性評價方法等需要進一步的探究，從而減少耐藥菌以及毒副作用的出現(xiàn)。此外，目前新型抗結(jié)核化合物多采用胞外檢測抗菌活性，而 MTB 侵入機體后，巨噬細胞的吞噬作用是極為重要的抗菌免疫應答機制，因此，檢測化合物對胞內(nèi) MTB 的影響也是非常必要的。綜上所述，盡管新型抗結(jié)核化合物的體外活性體系仍需要完善，但是通過經(jīng)典的 MIC、MBC 檢測方法評價新型抗結(jié)核化合物的體外抗菌活性及處于休眠期 MTB 的抑制活性，使其可作為未來抗結(jié)核藥物候選物的先導化合物，從而保證后續(xù)新型抗結(jié)核藥物的順利研發(fā)，仍然具有十分重要的意義。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2020. https:// www.who.int/teams/global-tuberculosis-programme/tb-reports/global-tuberculosis-report-2020.

[2] Sacksteder KA, Protopopova M, Barry CE 3rd, et al. Discovery and development of SQ109: a new antitubercular drug with a novel mechanism of action. Future Microbiol, 2012, 7(7):823-837.

[3] Rakesh, Bruhn DF, Scherman MS, et al. Pentacyclic nitrofurans with in vivo efficacy and activity against nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. PLoS One, 2014, 9(2):e87909.

[4] Tadolini M, Lingtsang RD, Tiberi S, et al. First case of extensively drug-resistant tuberculosis treated with both delamanid and bedaquiline. Eur Respir J, 2016, 48(3):935-938.

[5] Deng Q, Xiao CL. The progress of new anti-tuberculosis drugs. Chin J New Drugs, 2019, 28(13):1567-1573. (in Chinese)

鄧琪, 肖春玲. 新型抗結(jié)核藥物研究進展. 中國新藥雜志, 2019, 28(13):1567-1573.

[6] Tadolini M, Lingtsang RD, Tiberi S, et al. Cardiac safety of extensively drug-resistant tuberculosis regimens including bedaquiline, delamanid and clofazimine. Eur Respir J, 2016, 48(5):1527-1529.

[7] Hoffmann H, Kohl TA, Hofmann-Thiel S, et al. Delamanid and bedaquiline resistance in Mycobacterium tuberculosis ancestral Beijing genotype causing extensively drug-resistant tuberculosis in a tibetan refugee. Am J Respir Crit Care Med, 2016, 193(3):337-340.

[8] Aher RB, Sarkar D. Pharmacophore modeling of pretomanid (PA-824) derivatives for antitubercular potency against replicating and non-replicating Mycobacterium tuberculosis. J Biomol Struct Dyn, 2021, 39(3):889-900.

[9] Liu SS, Tang SJ. Research progress of ptomanil, a new antituberculous drug. Natl Med J China, 2020, 100(26):2071-2074. (in Chinese)

劉盛盛, 唐神結(jié). 抗結(jié)核新藥普托馬尼的研究進展. 中華醫(yī)學雜志, 2020, 100(26):2071-2074.

[10] Lin Y, Zhu NY, Jiang JD, et al. The establishment and application of a high-throughput screening (HTS) assay for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ. Chin J Antibiot, 2015, 40(3):166-170, 212. (in Chinese)

林媛, 朱寧嶼, 蔣建東, 等. 以FtsZ為靶點的抗結(jié)核藥物篩選模型的建立及應用. 中國抗生素雜志, 2015, 40(3):166-170, 212.

[11] Guzman JD, Evangelopoulos D, Gupta A, et al. Antitubercular specific activity of ibuprofen and the other 2-arylpropanoic acids using the HT-SPOTi whole-cell phenotypic assay. BMJ Open, 2013, 3(6):e002672.

[12] Stanley SA, Grant SS, Kawate T, et al. Identification of novel inhibitors of M. tuberculosis growth using whole cell based high-throughput screening. ACS Chem Biol, 2012, 7(8):1377-1384.

[13] Islam MM, Hameed HMA, Mugweru J, et al. Drug resistance mechanisms and novel drug targets for tuberculosis therapy. J Genet Genomics, 2017, 44(1):21-37.

[14] Burke C, Abrahams KA, Richardson EJ, et al. Development of a whole-cell high-throughput phenotypic screen to identify inhibitors of mycobacterial amino acid biosynthesis. FASEB Bioadv, 2019, 1(4): 246-254.

[15] Meng JZ, Wang X, Guan Y, et al. Study on the feasibility of searching anti-tuberculosis agents using Mycobacterium aureus. Chin Med Biotechnol, 2020, 15(4):386-391. (in Chinese)

蒙建州, 王瀟, 關(guān)艷, 等. 以金色分枝桿菌為模式菌株篩選抗結(jié)核活性化合物可行性研究. 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2020, 15(4):386-391.

[16] Siddiqi S, Takhar P, Baldeviano C, et al. Isoniazid induces its own resistance in nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 2007, 51(6):2100-2104.

[17] Liu Y, Zhou S, Deng Q, et al. Identification of a novel inhibitor of isocitrate lyase as a potent antitubercular agent against both active and non-replicating Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb), 2016, 97:38-46.

[18] Zhang CB, Wang HH, Zhang SL. Research progress of minimum inhibitory concentration detection technology and breakpoint setting for Mycobacterium tuberculosis. J Shanghai Jiaotong Univ (Med Sci), 2012, 32(5):661-666. (in Chinese)

張朝寶, 王洪海, 張舒林. 結(jié)核分枝桿菌最低抑菌濃度測定方法及臨界值設置研究進展. 上海交通大學學報(醫(yī)學版), 2012, 32(5): 661-666.

[19] Rampersad T, Makume M, Sobia P, et al. A high throughput methodology for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis isolates. J Microbiol Methods, 2018, 146:64-67.

[20] Imperiale BR, Cataldi áA, Morcillo NS. In vitro anti-tuberculosis activity of azole drugs against Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. Rev Argent Microbiol, 2017, 49(4):332-338.

[21] Sukheja P, Kumar P, Mittal N, et al. A novel small-molecule inhibitor of the Mycobacterium tuberculosis demethylmenaquinone methyltransferase MenG is bactericidal to both growing and nutritionally deprived persister cells. mBio, 2017, 8(1):e02022-16.

[22] Thanna S, Knudson SE, Grzegorzewicz A, et al. Synthesis and evaluation of new 2-aminothiophenes against Mycobacterium tuberculosis. Org Biomol Chem, 2016, 14(25):6119-6133.

[23] Santos NCS, Scodro RBL, Leal DC, et al. Determination of minimum bactericidal concentration, in single or combination drugs, against Mycobacterium tuberculosis. Future Microbiol, 2020, 15:107-114.

[24] Santos NCS, Scodro RBL, Sampiron EG, et al. Minimum bactericidal concentration techniques in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review. Microb Drug Resist, 2020, 26(7):752-765.

[25] Thanna S, Knudson SE, Grzegorzewicz A, et al. Synthesis and evaluation of new 2-aminothiophenes against Mycobacterium tuberculosis. Org Biomol Chem, 2016, 14(25):6119-6133.

[26] Teng LY. Activity evaluation and mechanism of novel lead compounds against tuberculosis. Shanghai: Fudan university, 2012. (in Chinese)

滕麗艷. 新型抗結(jié)核先導化合物活性評價及其機制初探. 上海: 復旦大學, 2012.

[27] Loebel RO, Shorr E, Richardson HB. The influence of adverse conditions upon the respiratory metabolism and growth of human tubercle bacilli. J Bacteriol, 1933, 26(2):167-200.

[28] Batyrshina YR, Schwartz YS. Modeling of Mycobacterium tuberculosis dormancy in bacterial cultures. Tuberculosis (Edinb), 2019, 117:7-17.

[29] Gibson SER, Harrison J, Cox J. Modelling a silent epidemic: a review of the in vitro models of latent tuberculosis. Pathogens, 2018, 7(4):88.

[30] Zhang HL, Zhang ZY. Advances in research on animal models of Mycobacterium tuberculosis infection. J Microbes Infect, 2012, 7(3): 184-189. (in Chinese)

張昊凌, 張志勇. 結(jié)核分枝桿菌感染動物模型的研究進展. 微生物與感染, 2012, 7(3):184-189.

[31] Singh AK, Gupta UD. Animal models of tuberculosis: lesson learnt. Indian J Med Res, 2018, 147(5):456-463.

[32] Zheng MQ, Fu L, Wang B, et al. Guinea pig aerosol infection model in evaluation of new antitubercular drugs. J Clin Pulm Med, 2011, 16(8):1205-1207. (in Chinese)

鄭梅琴, 付雷, 王彬, 等. 豚鼠結(jié)核病模型在抗結(jié)核新藥評價中的應用. 臨床肺科雜志, 2011, 16(8):1205-1207.

[33] Gao C, Peng C, Shi Y, et al. Benzothiazinethione is a potent preclinical candidate for the treatment of drug-resistant tuberculosis. Sci Rep, 2016, 6:29717.

[34] Horváti K, Bacsa B, Szabó N, et al. Antimycobacterial activity of peptide conjugate of pyridopyrimidine derivative against Mycobacterium tuberculosis in a series of in vitro and in vivo models. Tuberculosis (Edinb), 2015, 95 Suppl 1:S207-S211.

[35] Li YY, Lu Y. The applications of animal models in the new anti-tuberculosis drugs evaluation. Chin J Antituberculosis, 2017, 39(9):1014-1017. (in Chinese)

李媛媛, 陸宇. 動物模型在抗結(jié)核新藥藥效學評價中的應用. 中國防癆雜志, 2017, 39(9):1014-1017.

[36] Rifat D, Prideaux B, Savic RM, et al. Pharmacokinetics of rifapentine and rifampin in a rabbit model of tuberculosis and correlation with clinical trial data. Sci Transl Med, 2018, 10(435):eaai7786.

[37] Bouz G, Al Hasawi N. The zebrafish model of tuberculosis - no lungs needed. Crit Rev Microbiol, 2018, 44(6):779-792.

[38] Liu HX, He SM, Zhang SL. Progress in the anti-tuberculosis research of the zebrafish model of Mycobacterium marinum-tuberculosis. Acta Laboratorium Anim Scientia Sinica, 2019, 27(2):261-265. (in Chinese)

劉紅旭, 何樹梅, 張舒林. 海分枝桿菌-斑馬魚模型的抗結(jié)核研究進展. 中國實驗動物學報, 2019, 27(2):261-265.

[39] Myllym?ki H, Niskanen M, Luukinen H, et al. Identification of protective postexposure mycobacterial vaccine antigens using an immunosuppression-based reactivation model in the zebrafish. Dis Model Mech, 2018, 11(3):dmm033175.

[40] Luukinen H, Hammarén MM, Vanha-Aho LM, et al. Modeling tuberculosis in Mycobacterium marinum infected adult zebrafish.J Vis Exp, 2018, (140):58299.

[41] Luukinen H, Hammarén MM, Vanha-Aho LM, et al. Priming of innate antimycobacterial immunity by heat-killed Listeria monocytogenes induces sterilizing response in the adult zebrafish tuberculosis model. Dis Model Mech, 2018, 11(1):dmm031658.

[42] Romeo Y, Lemaitre B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol Biol, 2008, 415:379-394.

[43] Philips JA, Porto MC, Wang H, et al. ESCRT factors restrict mycobacterial growth. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008, 105(8):3070- 3075.

[44] Pushkaran AC, Vinod V, Vanuopadath M, et al. Combination of repurposed drug diosmin with amoxicillin-clavulanic acid causes synergistic inhibition of mycobacterial growth. Sci Rep, 2019, 9(1):6800.

[45] Li K, Zhao G. Advances in the application of in vivo imaging of small animals. Pract J Med Pharm, 2012, 29(1):81-82. (in Chinese)

李珂, 趙光. 小動物活體成像技術(shù)的應用進展. 實用醫(yī)藥雜志, 2012, 29(1):81-82.

[46] Arranz A, Ripoll J. Advances in optical imaging for pharmacological studies. Front Pharmacol, 2015, 6:189.

國家自然科學基金（81803412）；中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-1-013）；北京市臨床重點專科項目

李傳友，Email：lichuanyou6688@hotmail.com

2020-11-06

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.010