黃柏膠囊聯(lián)合鹽酸奧洛他定對急性濕疹模型大鼠的干預作用及抗過敏機制探討

戴雅琴，杜崇民，謝惠平

(1. 江漢大學附屬湖北省第三人民醫(yī)院，湖北 武漢 430033；2. 青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200)

急性濕疹又稱為特應(yīng)性皮炎，是臨床多發(fā)、常見遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)炎性皮膚疾病，表現(xiàn)為皮膚瘙癢、紅斑、丘疹、水皰等，發(fā)病機制尚未明確，內(nèi)、外致病因素共同致病[1-2]。目前西醫(yī)主要應(yīng)用類固醇激素或免疫調(diào)節(jié)劑治療，短期效果較好，但停藥易復發(fā)，長期反復應(yīng)用易引起皮膚萎縮、色素沉著等不良反應(yīng)，甚至出現(xiàn)內(nèi)分泌代謝紊亂、誘發(fā)及加重感染等[3]。濕疹屬中醫(yī)“濕瘡”范疇，多因機體較弱、衛(wèi)外不固、營衛(wèi)失和、陰陽失調(diào)、七情內(nèi)傷，導致耗傷氣血，陰血虛少，血虛而生風，風邪趁機侵襲而發(fā)病[4]。黃柏膠囊主要成分為中藥黃柏，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡功效，治療濕疹療效較好，且無明顯不良反應(yīng)，但其作用機制尚不明確[5]。鹽酸奧洛他定是肥大細胞穩(wěn)定劑及相對選擇性組胺H1受體拮抗劑，主要用于濕疹、多形性滲出性紅斑的治療。本研究探討了黃柏膠囊聯(lián)合鹽酸奧洛他定對急性濕疹模型大鼠的干預作用及抗過敏機制，旨在為臨床應(yīng)用提供更多實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 8周齡清潔級SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，湖北省實驗動物中心提供[SCXK-(鄂)2017-0011]，室溫飼養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2藥品與試劑 黃柏膠囊(淄博華洋制藥有限公司，國藥準字Z20063055，生產(chǎn)批號：20190314，規(guī)格：每粒0.39 g)；鹽酸奧洛他定(北京四環(huán)科寶制藥有限公司，國藥準字H20143415，生產(chǎn)批號：20190409，規(guī)格：5 mg/片)；2,4-二硝基氯苯(DNCB,化學純，成都科龍化工試劑廠，生產(chǎn)批號：20190117)；蘇木精-伊紅染色液(武漢華美生物工程有限公司)；兔抗鼠干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)多克隆抗體一抗試劑盒(碧云天生物科技有限公司)和二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；細胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1(VCAM-1)抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號分別為bs-4617R和bs-0920R)；BCA試劑盒和DAB顯色液(碧云天生物科技有限公司，批號分別為201903171和201903115)；PVDF 膜(Millipore公司，批號：K5EA5859N)，山羊抗兔IgG(Abcam公司，批號：150077)，Trizol提取試劑盒(Takara公司，批號：AKA5101)，qPCR反應(yīng)試劑盒(BIO-RAD公司，批號：L001751 A)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，批號：AK4102)，ICAM-1和VCAM-1引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.1.3實驗儀器 手術(shù)器械(蘇州六六視覺醫(yī)療設(shè)備公司)；LDZ-2 型低速離心機(北京京立離心機有限公司)；BX60顯微鏡(日本Olympus Optical公司)；ELx800酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；B-013003勻漿器(上海壘固儀器有限公司)；電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司)]；SIM凝膠成像儀[美國西盟(國際)生命技術(shù)有限公司]；RT-PCR擴增分析系統(tǒng)(美國羅氏公司)。

1.2分組、造模及給藥 將50雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組，每組10只。除對照組外，其余組均參照文獻[6]方法進行急性濕疹造模：采用5%水合氯醛麻醉大鼠，電剃須刀或電推剪去除大鼠右側(cè)背部被毛，面積約為2 cm×3 cm，將1滴5% DNCB涂于右側(cè)背部以致敏，然后本別于第3天、第6天和第9天將1滴2% DNCB涂于右側(cè)背部，以右側(cè)背部出現(xiàn)明顯的滲出、糜爛、丘疹、水腫、紅斑等為造模成功。 于造模后第10天，對照組和模型組給予生理鹽水灌胃，黃柏膠囊組給予0.2 g/mL黃柏膠囊溶液灌胃，鹽酸奧洛他定組給予0.65 mg/mL鹽酸奧洛他定溶液灌胃，聯(lián)合組給予0.2 g/mL黃柏膠囊溶液和0.65 mg/mL鹽酸奧洛他定溶液灌胃，劑量均為5 mL/kg，每天1次，連續(xù)10 d。

1.3檢測指標

1.3.1濕疹度評分和皮膚腫脹度 于造模第20天，觀察各組大鼠的抓痕、滲出、糜爛、丘疹、紅斑、水腫等情況，根據(jù)癥狀輕重進行濕疹度評分[6]：癥狀無、輕、中、重分別計分0，1，2，3分，最高18分，評分越高，濕疹越嚴重。采用直徑6 mm的圓形打孔器取健康區(qū)域和濕疹區(qū)域皮膚，計算皮膚腫脹度，皮膚腫脹度=濕疹皮膚質(zhì)量-健康皮膚質(zhì)量。

1.3.2組織HE染色病理觀察 于造模第20天，處死各組大鼠，分離實驗所需皮膚組織，4%多聚甲醛固定24 h，自來水沖洗，不同濃度的乙醇脫水，二甲苯透明固定，石蠟包埋，切片，厚度為5 μm，烤片，二甲苯脫蠟，乙醇水化，蘇木精染色，1%鹽酸乙醇溶液分化，自來水沖洗返藍，浸入伊紅染液，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠進行封片，顯微鏡下觀察。

1.3.3炎癥因子水平 處死各組大鼠前，心臟取血，離心，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平，按照說明書操作。

1.3.4ICAM-1和VCAM-1蛋白表達量 采用Western blot法檢測：取100 mg皮膚組織標本，PBS緩沖液沖3次，加入含1 mmol/L PMSF的RIPA低溫研磨，離心取上清，BCA法檢測蛋白濃度，562 nm測定OD值，計算蛋白濃度，將膠板安裝于電泳槽中，倒入電泳液，按40 μg蛋白上樣，電泳條件為電壓80 V、30 min，樣品進入分離膠后調(diào)節(jié)電壓至120 V，電泳結(jié)束后，取出玻璃板，切去濃縮膠及分離膠，進行轉(zhuǎn)膜，PVDF膜使用前浸于適量甲醇中活化，設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件(80 V、120 min)，冰浴，取出PVDF膜，37 ℃恒溫搖床封閉2 h，將PVDF膜裁成長條，置于ICAM-1和VCAM-1一抗(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)，4 ℃恒溫搖床孵育過夜，1×TBST 洗PVDF膜3次，夾取PVDF膜置入二抗(辣根酶標記山羊抗兔IgG，1∶5 000)1 h，1×TBST 洗PVDF膜3次，DAB顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白表達條帶灰度，計算ICAM-1和VCAM-1蛋白表達量。

1.3.5ICAM-1和VCAM-1 mRNA表達量 取皮膚組織標本100 mg，Trizol法提取總RNA，取1 μL提取的RNA，采用微量分光光度計于A260和A280檢測提取的RNA純度，去除DNA后以GAPDH為內(nèi)參進行c DNA合成，采用RT-PCR和相關(guān)軟件檢測ICAM-1和VCAM-1 mRNA相對表達量，40個循環(huán)，預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 5 min。引物序列：ICAM-1上游為5’-TCCAATGGCTTCAACCCGTG-3’,下游為5’-CTTCTGTGGGATGGATGGAT-3’，長度為110 bp；VCAM-1上游為5’-GAGACAAAACAGAAGTGGAAT-3’,下游為5’-AGCAACGTTGACATAAAGAGT-3’，長度為635 bp；GAPDH上游為5’-TTCTAGAGACAGCCGCATCT-3’,下游為5’-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3’，長度為278 bp。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠濕疹度評分和皮膚腫脹度比較 模型組大鼠濕疹度評分和皮膚腫脹度均顯著高于對照組(P均<0.05)。黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組大鼠濕疹度評分和皮膚腫脹度均顯著低于模型組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組(P均<0.05)，黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠皮膚組織HE染色表現(xiàn) 對照組大鼠皮膚組織正常；模型組大鼠表皮突延長、棘層肥厚，角化過度，細胞間水腫及炎性細胞浸潤；黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組可見部分棘細胞腫脹，表皮突稍長，角質(zhì)層變薄，少量細胞間水腫及炎性細胞浸潤。見圖1。

2.3各組大鼠血清炎癥因子水平比較 模型組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平均顯著高于對照組(P均<0.05)。黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平均顯著低于模型組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組(P均<0.05)，黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表1 各組大鼠濕疹度評分和皮膚腫脹度比較

2.4各組大鼠皮膚組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達量比較 模型組大鼠皮膚組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達量均顯著高于對照組(P均<0.05)。黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組大鼠皮膚組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且聯(lián)合組均顯著低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組(P均<0.05)，黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2和表3。

圖1 各組大鼠皮膚組織病理學HE染色表現(xiàn)(×400)

表2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4和TNF-α水平比較

圖2 各組大鼠ICAM-1和VCAM-1蛋白表達條帶情況

3 討 論

急性濕疹發(fā)生機制復雜，目前尚無特效治療藥物。西藥鹽酸奧洛他定屬于二苯驕氧草類衍生物，能夠抑制變應(yīng)原誘發(fā)的血管通透性增高，減少滲出，可抑制肥大細胞游走，穩(wěn)定肥大細胞膜，抑制嗜酸性粒細胞浸潤，降低炎癥細胞活性[7-8]，用于治療濕疹近期效果明顯，且不良反應(yīng)相對較少。中成藥黃柏膠囊主要成分為黃柏，黃柏中黃柏堿和木蘭堿成分對細胞免疫應(yīng)答的誘導期皆有抑制作用，可抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)，提高機體免疫力，減輕炎癥反應(yīng)，促進病情恢復[9]；小檗堿成分具有抗菌、收斂和消炎作用，可降低血清炎癥因子水平[10]。故本研究選擇此兩種藥物進行了實驗探討。

濕疹是由內(nèi)外致敏因子引起的疾病，致敏T細胞激活Th2免疫反應(yīng)，釋放IFN-γ、IL-4等炎性因子，造成組織損傷，單核細胞、淋巴細胞等浸潤，故炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)異常與急性濕疹發(fā)病過程和發(fā)展預后密切相關(guān)[11-12]。IFN-γ可促進Th1細胞成熟，抑制Th2 細胞增殖，同時可刺激TNF-α等細胞因子的上調(diào)[13]。IL-4能調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞，促進免疫應(yīng)答反應(yīng)過程，可通過抑制體內(nèi)單核巨噬細胞釋放TNF-α而發(fā)揮抗炎效應(yīng)，但其過量表達有促炎作用[14]。TNF-α適量水平可增強機體免疫應(yīng)答，抑制炎癥反應(yīng)，但過量表達可引起炎癥區(qū)域組織損傷，加重炎癥反應(yīng)，促進IFN-γ、IL-4水平升高，加重急性濕疹造成的皮膚損害[15]。促炎因子和抗炎因子在炎癥反應(yīng)過程中具有相互拮抗和相輔相成的作用。本實驗結(jié)果顯示，黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組的濕疹度評分、皮膚腫脹度及血清IFN-γ、IL-4、TNF-α水平均顯著低于模型組，且聯(lián)合組各指標及病理形態(tài)改善更顯著，提示黃柏膠囊與鹽酸奧洛他定聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗炎作用。

表3 各組大鼠ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA相對表達量比較

細胞黏附分子介導免疫細胞間的互動與活化，參與免疫應(yīng)答、炎癥損傷等。皮膚炎癥反應(yīng)過程中肥大細胞、巨噬細胞等分泌的炎癥因子激活細胞內(nèi)信號，誘導內(nèi)皮細胞大量表達ICAM-1和VCAM-1，引起同種細胞間聚集并加重炎癥[16]。ICAM-1表達于活化T細胞、角質(zhì)形成細胞等，可穩(wěn)定細胞和促進白細胞游走，正常組織中弱表達，炎癥組織中高表達，影響T細胞的分化，介導炎癥反應(yīng)[17]。VCAM-1表達于內(nèi)皮細胞、皮膚樹突狀細胞等，與眾多蛋白結(jié)合形成信號復合體，為炎癥細胞的激活提供關(guān)鍵的共刺激信號，可介導黏附淋巴細胞、嗜酸性粒細胞，VCAM-1與其受體結(jié)合是淋巴細胞活化的重要步驟，在皮膚炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。本實驗結(jié)果顯示，黃柏膠囊組、鹽酸奧洛他定組和聯(lián)合組ICAM-1和VCAM-1蛋白及mRNA表達水平均顯著低于模型組，且聯(lián)合組明顯低于黃柏膠囊組和鹽酸奧洛他定組，提示黃柏膠囊與鹽酸奧洛他定聯(lián)合應(yīng)用可能通過下調(diào)細胞黏附分子表達而減輕急性濕疹的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，黃柏膠囊聯(lián)合鹽酸奧洛他定治療急性濕疹可更明顯減輕病情和改善組織病理形態(tài)，可能與下調(diào)炎癥因子和ICAM-1、VCAM-1蛋白及mRNA表達，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。