血漿母系表達(dá)基因3和H19水平與妊娠期糖尿病胰島素抵抗的關(guān)系

宋曉東，朱學(xué)濤，朱立梅，李 偉

0 引 言

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期間首次發(fā)生或發(fā)現(xiàn)的糖代謝異常，可能引起孕婦發(fā)生流產(chǎn)、圍生期酮癥酸中毒、產(chǎn)后出血等多種合并癥，對(duì)胎兒也構(gòu)成極大威脅，可能造成胎兒窘迫、早產(chǎn)、畸形等，孕期行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)篩查并及時(shí)進(jìn)行干預(yù)，可改善妊娠結(jié)局。GDM機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)有關(guān)，盡早發(fā)現(xiàn)IR，并采取相關(guān)措施進(jìn)行控制，對(duì)于降低GDM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有重要意義[1-2]。哺乳動(dòng)物基因組中98%轉(zhuǎn)錄序列不具備蛋白質(zhì)編碼功能，屬于非編碼RNA，其中長(zhǎng)度在200個(gè)核苷酸以上的為長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)，母系表達(dá)基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)、H19均屬于LncRNA。MEG3基因定位于人染色體14q32.3，具高度保守性，已有研究表明其在人胰島β細(xì)胞中為高表達(dá)，可促進(jìn)胰島素分泌[3-4]。H19定位于人染色體11p15.5，包含5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，具父系印記特性，選擇性表達(dá)母源性等位基因，是最早被鑒定的印跡基因之一，已被報(bào)道與IR密切相關(guān)[5]。本研究通過(guò)探討血漿MEG3、H19水平與GDM患者IR的關(guān)系，以期為GDM的發(fā)病機(jī)制及臨床防治工作提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2019年1月孕24～28周在我院行OGTT并確診為GDM的孕婦65例為GDM組，年齡22～37歲。參照文獻(xiàn)[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)：將75 g葡萄糖溶于250～300 mL水中，受試者在5 min內(nèi)口服完畢，分別采集服用后1 h、2 h靜脈血，檢測(cè)血糖水平，滿足以下任何一項(xiàng)即可診斷為GDM：空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)≥5.1 mmol/L，服糖1 h血糖≥10.0 mmol/L，服糖2 h血糖≥8.5 mmol/L。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)OGTT確診為GDM；②首次、單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾被診斷為糖尿病者；②多胎妊娠者；③有糖尿病家族史者；④肝、腎等重要器官功能障礙者；⑤臨床資料不完整者。另外選取同期80例孕周為24～28周正常妊娠孕婦為對(duì)照組，年齡23～38歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：201511003)，所有受試者均自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法受試者均于清晨抽取5 mL空腹靜脈血。FPG水平采用日立7600型生化分析儀測(cè)定，糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)采用Arkray HA-8180型全自動(dòng)分析儀(日本)檢測(cè)；采用放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；采用穩(wěn)態(tài)評(píng)估模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，HOMA-IR≥2.69即判為IR[7]。計(jì)算公式：

HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5

采用qRT-PCR檢測(cè)血漿中MEG3、H19水平，儀器為Roche LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀。采用Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參基因，MEG3正向引物：5′-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3′，反向引物：5′-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3′，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。H19正向引物：5′-ACAGGAGAGAGACTTCCA-3′，反向引物：5′-ATGTCCTGCTTGTCACGTCC-3′，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，引物及試劑盒均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用2-ΔΔCt法計(jì)算MEG3、H19水平。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較2組年齡、BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。GDM組FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 入組孕婦一般資料比較

2.2 血漿MEG3、H19水平比較GDM組血漿MEG3水平顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，H19水平顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 入組孕婦血漿MEG3、H19水平比較

2.3 GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相關(guān)性分析Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，GDM組血漿MEG3水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，血漿H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈正相關(guān)(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相關(guān)性分析

2.4 影響IR發(fā)生的多因素Logistic回歸分析以是否發(fā)生IR為因變量，以MEG3、H19水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果表明，MEG3是IR發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.01)，H19是危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表4 影響胰島素抵抗(IR)發(fā)生的多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

GDM是妊娠期常見(jiàn)糖代謝異常疾病，是日后患2型糖尿病的高危人群，隨著飲食結(jié)構(gòu)變化、肥胖及高齡產(chǎn)婦的增加，近年發(fā)生率呈逐漸升高趨勢(shì)，我國(guó)發(fā)生率約為1%～5%[8]。GDM發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)病原因可能是妊娠期雌激素、生乳素等由胎盤分泌的激素釋放進(jìn)入母體循環(huán)使全身水平升高，增強(qiáng)了對(duì)胰島素的拮抗作用，隨孕周增加胰島素敏感性下降，胰島素分泌受限的孕婦則發(fā)展為GDM[9-11]。胰島β細(xì)胞合成分泌的胰島素是機(jī)體內(nèi)唯一具有降低血糖功能的蛋白質(zhì)類激素，在維持血糖水平上起決定性作用[4]。IR是指胰島素促進(jìn)機(jī)體攝取及利用葡萄糖能力下降，正常妊娠女性隨著體內(nèi)激素水平變化可表現(xiàn)出生理性、暫時(shí)性IR狀態(tài)，通常在孕周24～28周表現(xiàn)顯著，于34～36周達(dá)到峰值，在分娩后逐漸消失，GDM患者生理性、病理性IR并存[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，GDM組FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均較高，提示GDM患者存在不同程度IR，與上述研究結(jié)果一致。

LncRNA可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖分化、免疫應(yīng)答等多種生理活動(dòng)過(guò)程，與腫瘤、代謝性疾病等關(guān)系密切，正常生理狀態(tài)下，MEG3在機(jī)體組織中為高表達(dá)，在腫瘤組織中表達(dá)降低或缺失，發(fā)揮抑癌基因作用[13]。近年來(lái)LncRNA與IR的關(guān)系引起諸多研究者的興趣，LncRNA的作用發(fā)揮具組織特異性，同一種LncRNA在不同組織中對(duì)血糖可能發(fā)揮相反調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胰腺組織中MEG3與心、肝、脾等組織相比為高表達(dá)，具有組織特異性，抑制MEG3表達(dá)后，胰島素分泌量減少，胰島β細(xì)胞凋亡增加，與此同時(shí)，葡萄糖耐受能力受損，MEG3可能通過(guò)參與胰島素的合成及分泌，在維持成年小鼠胰島功能中發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDM組血漿MEG3水平顯著低于對(duì)照組，提示MEG3可能參與GDM患者IR的發(fā)生。分析原因是低水平的MEG3可能通過(guò)對(duì)胰十二指腸同源盒因子-1肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而使胰島素合成、分泌減少[14]。另有研究表明，MEG3與肝糖異生關(guān)系密切，MEG3可通過(guò)激活叉頭框蛋白1，增加葡萄糖6磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶表達(dá)，從而促進(jìn)糖異生，減少糖原合成[5]。

H19在胚胎發(fā)育中呈現(xiàn)高表達(dá)并在出生后顯著下降，僅在成年人骨骼肌及心肌中觀察到持續(xù)表達(dá)，在腫瘤等細(xì)胞大量分化疾病中呈現(xiàn)高表達(dá)[15]。H19在不同的腫瘤中表達(dá)情況各異，在胃癌、宮頸癌、胰腺癌等腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，發(fā)揮促癌基因作用，在前列腺癌、肝癌等腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因特性，H19在不同腫瘤中可能發(fā)揮不同作用，甚至在同一腫瘤中發(fā)揮促癌及抑癌基因的雙重作用[16]。H19與IR的研究越來(lái)越受到關(guān)注，研究表明，H19在高脂飲食小鼠肝臟中高表達(dá)，高水平的H19可促進(jìn)肝臟產(chǎn)生葡萄糖，進(jìn)而增加高血糖、IR發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，全身敲除H19可使胰島素抑制肝臟糖異生的作用增強(qiáng)，但也有研究表明，下調(diào)肝臟中H19表達(dá)，可使小鼠血糖水平升高，糖耐量受損，糖異生基因表達(dá)上調(diào)，上述結(jié)論提示H19在肝糖異生中發(fā)揮的作用目前尚不明確[5,17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDM組血漿H19水平顯著高于對(duì)照組，提示H19與IR關(guān)系密切。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均具相關(guān)性，提示MEG3、H19可能用于評(píng)估GDM患者IR嚴(yán)重程度。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，MEG3是IR發(fā)生的保護(hù)因素，H19是危險(xiǎn)因素，可能從危險(xiǎn)因素方面防治IR，降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。

綜上所述，GDM患者血漿MEG3呈低表達(dá)，H19為高表達(dá)，且與HOMA-IR具相關(guān)性，或可為GDM的靶向治療提供新思路，本研究也存在不足之處，樣本量較少，可能造成結(jié)果偏差，尚需大樣本研究對(duì)結(jié)果進(jìn)行佐證，這將成為今后的工作重點(diǎn)。