一測多評法同時(shí)測定山苦荬中3 種成分

黃健軍，梁 爽*，甘洋縈，陳潔銀，劉真亦

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.玉林市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，廣西 玉林 537000）

山苦荬Ixeridium chinense(Thunb.) Tzvel.為菊科小苦荬屬多年生草本植物,又名中華苦荬菜、山苦菜、小苦菜等,主要分布在北部、南部及東部省區(qū),全草入藥,既可藥用又可食用,具有清熱解毒、消炎涼血、止痛消腫、抗腫瘤等功效,用于治療無名腫痛、腹腔膿腫、痢疾、闌尾炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎等癥［1-2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明古羊藤有多種潛在的抗腫瘤、抗氧化、抗煙堿、抗病毒、降血脂、降血糖等活性［3-4］。山苦荬成分主要包含倍半萜類、三萜類、甾醇類、黃酮類等［4-7］。山苦荬作為廣西民間傳統(tǒng)瑤藥,其野生資源非常豐富,有報(bào)道對山苦荬中木犀草苷、綠原酸的含量進(jìn)行測定［8-9］。經(jīng)查閱文獻(xiàn),當(dāng)前國內(nèi)外尚未見報(bào)道一測多評法同時(shí)測定山苦荬中綠原酸、咖啡酸和木犀草苷的含量。一測多評法基于多指標(biāo)質(zhì)量控制的研究思路,近年來獲得了業(yè)內(nèi)專家學(xué)者的共識,只使用一個(gè)對照品實(shí)現(xiàn)對多種成分的同步測定,既降低了檢測成本,同時(shí)更簡便、全面地對中藥進(jìn)行質(zhì)量控制,提高了同步測定多種成分的工作效率［10-12］?；谏鲜鲆蛩?本研究擬對山苦荬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步完善,通過一測多評建立專屬性強(qiáng)的含量測定方法,建立與目前檢測技術(shù)相匹配的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以期為有效評價(jià)和控制山苦荬藥材質(zhì)量及該藥材資源的開發(fā)提供參考。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；U3000 高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher公司)；XS-205Du 型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；KQ-500GDV 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；501 超級恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；Synergy 超純水(美國Millipore 公司。山苦荬藥材采自廣西各地區(qū),藥材來源主要是采購和野外采集,具體見表1,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為菊科小苦荬屬植物中華小苦荬Ixeridium chinense(Thunb.) Tzvel.的全草。綠原酸(110753-201415,純度96.2%)、咖啡酸(110885-200102,純度100%)、木樨草苷(111720-201307,純度94.0%) 均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、甲醇(色譜純,美國Fisher 公司)；磷酸(優(yōu)級純,批號20150327,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；高效液相色譜議用水為超純水,其他所用試劑均為分析純。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 TYPE MGⅡSIZE-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相甲醇-0.2%磷酸,梯度洗脫,程序見表2；體積流量1.0 mL/min),梯度洗脫；柱溫25 ℃；檢測波長330 nm。

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取對照品綠原酸11.59 mg、咖啡酸6.72 mg、木樨草苷13.60 mg,分別置于不同的25 mL 量瓶中,加適量甲醇超聲(500 W,40 kHz) 溶解并稀釋至刻度,搖勻,再分別精密量取上述相應(yīng)對照品溶液1.5、1.5、6.0 mL,置同一10 mL 量瓶中并用甲醇定容,搖勻,即得。

2.2.2 供試品溶液 取山苦荬樣品約2 g,精密稱定,置于100 mL 錐形瓶中,精密加入70% 甲醇30 mL,稱定質(zhì)量,超聲(500 W,40 kHz) 提取60 min,放冷,用70% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過,取續(xù)濾液過0.45 μm 微孔濾膜,即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性與專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對照品、供試品溶液各5 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,供試品溶液中綠原酸、咖啡酸和木犀草苷色譜峰與對照品色譜峰保留時(shí)間一致,并與其他共存成分的分離度大于1.5,理論塔板數(shù)不低于5 000。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 mL,分別置2.0 mL 量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,搖勻,制成系列混合對照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,以目標(biāo)峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行回歸,得綠原酸、咖啡酸、木樨草苷回歸方程分別為Y=0.288X+0.057 (r=0.996 8)、Y=0.467X+0.034(r=0.997 1)、Y=0.174X+1.571 (r=0.991 2),各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取山苦荬樣品(S4 號) 約2 g,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次,測得綠原酸峰面積平均值為15.62,RSD 為2.0%；咖啡酸峰面積平均值為5.47,RSD 為2.1%；木樨草苷峰面積平均值為31.04,RSD 為2.1%,表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取S4 號山苦荬樣品6 份,每份約2 g,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,測得綠原酸含量平均值為1.17 mg/g,RSD 為1.7%；咖啡酸含量平均值為0.21 mg/g,RSD 為2.3%；木樨草苷含量平均值為2.51 mg/g,RSD 為2.3%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4” 項(xiàng)下制備的供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下,分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣,測得綠原酸含量平均值為1.15 mg/g,RSD 為5.1%；咖啡酸含量平均值為0.21 mg/g,RSD 為4.8%；木樨草苷含量平均值為2.41 mg/g,RSD 為5.1%,表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測定含量的山苦荬樣品6 份,每份約1 g,精密稱定,另精密稱取對照品綠原酸6.86 mg、咖啡酸1.34 mg、木樨草苷16.24 mg,置200 mL 量瓶中,加適量70%甲醇超聲使溶解,并稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品貯備液。分別精密加入混合對照品貯備液30 mL,按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測定,記錄山苦荬加樣回收樣品溶液中綠原酸、咖啡酸、木樨草苷的峰面積并計(jì)算回收率,結(jié)果見表3。

2.4 相對校正因子計(jì)算 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下混合對照品溶液,依法測定咖啡酸、木樨草苷的峰面積,以綠原酸為內(nèi)參物,按照相對校正因子計(jì)算公式［fsi=fs/fi=(As/Cs)/ (Ai/Ci)］ (式中As為內(nèi)參物綠原酸對照品峰面積,Cs為內(nèi)參物綠原酸對照品濃度,Ai為待測成分咖啡酸或木樨草苷對照品峰面積；Ci為待測成分咖啡酸或木樨草苷對照品濃度。) 計(jì)算?？Х人帷⒛鹃夭蒈盏南鄬πＵ蜃?結(jié)果見表4。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents （n=6）

表4 各成分相對校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

2.5 系統(tǒng)耐用性考察

2.5.1 進(jìn)樣量 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下混合對照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,考察4、5、6 μL 不同進(jìn)樣量對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示,不同體積流量對相對校正因子影響程度不明顯,咖啡酸和木犀草苷相對校正因子值的RSD 分別為0、0.2%,相對保留時(shí)間RSD 均為0。表明該方法耐用性良好,結(jié)果見表5。

2.5.2 儀器、色譜柱 選擇ThermoU3000 高效液相色譜儀、Agilent 1260 高效液相色譜儀,以及YPE MGⅡSIZE -C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse plus-C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm)、WatersAtlantis T3色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)考察不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示,不同儀器、色譜柱對相對校正因子影響程度在可接受范圍內(nèi),咖啡酸和木犀草苷相對校正因子RSD 分別為2.4%、1.1%,結(jié)果見表6。

表5 不同進(jìn)樣量的相對校正因子Tab.5 Relative correction factors or different injection volumes

表6 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different instruments and chromatographic columns on relative correction factors

2.5.3 體積流量 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下混合對照品溶液5 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定,考察0.9、1.0、1.1 mL/min 體積流量對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示,不同體積流量對相對校正因子影響程度不明顯,咖啡酸和木犀草苷相對校正因子RSD 分別為0.3%、0.12%,相對保留時(shí)間RSD 分別為1.2%、5.1%,結(jié)果見表7。

表7 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.7 Effects of different volume flow rate on relative correction factors

2.5.4 柱溫 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對照品溶液5 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,考察20、25、30 ℃不同柱溫對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示,不同柱溫對相對校正因子影響程度不明顯,咖啡酸和木犀草苷相對校正因子RSD 分別為0.3%、0.5%,相對保留時(shí)間RSD 分別為1.0%、4.2%,結(jié)果見表8。

表8 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.8 Effects of different column temperature on relative correction factors

2.5.5 檢測波長 精密吸取“2.2.1” 項(xiàng)下對照品溶液5 μL,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣,考察220、254、330 nm 檢測波長對相對校正因子的影響。結(jié)果顯示,不同檢測波長對相對校正因子影響程度不明顯,咖啡酸和木犀草苷相對校正因子RSD 分別為1.3%、5.7%,相對保留時(shí)間RSD 均為0,結(jié)果見表9。

表9 不同檢測波長對相對校正因子的影響Tab.9 Effects of different detection wavelength on relative correction factors

2.6 待測色譜峰定位 分別考察相對保留值和保留時(shí)間差在不同儀器、色譜柱中的重復(fù)性,結(jié)果見表10。由表可知,咖啡酸和木犀草苷相對校正因子值波動較小,RSD 分別為1.4%、6.8%,故選擇綠原酸作為色譜峰定位指標(biāo)。

表10 不同儀器、色譜柱相對保留值的影響Tab.10 Effects of different instruments and chromatographic columns on relative retention values

2.7 一測多評法與外標(biāo)法比較 經(jīng)方法學(xué)優(yōu)化和考察后,對10 批樣品提取物中的咖啡酸、木犀草苷的含量進(jìn)行測定,為了考察一測多評方法的準(zhǔn)確性,把一測多評法的測定結(jié)果與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見表11。由此顯示,綠原酸含量較高的產(chǎn)地為S10、S6、S4,咖啡酸含量較高的產(chǎn)地為S10、S5、S6、S4、S2,木樨草苷含量較高的產(chǎn)地為S10、S5、S4、S6,表明S10、S6、S4 的山苦荬綠原酸、咖啡酸和木犀草苷的含量較高。

3 討論

參考文獻(xiàn)［13-18］,本實(shí)驗(yàn)分別選用0.1%磷酸-乙 腈、0.1% 磷 酸-甲 醇、0.2% 磷 酸-乙 腈、0.2%磷酸-甲醇、水-甲醇等；用0.1%磷酸時(shí)由于出峰時(shí)間遲,分離效果差,故排除0.1%磷酸；在選用乙腈和甲醇時(shí),由于乙腈在分離時(shí)鋒形較窄且分離效果較差,出來的峰也較少；由于水的極性較大,所以考慮加酸,選擇0.2%磷酸-甲醇采用梯度洗脫時(shí)分離效果較好。分別考察了不同濃度甲醇、不同料液比、不同提取方法、不同提取時(shí)間,發(fā)現(xiàn)用70%甲醇超聲提取后所得到的峰基線平穩(wěn),色譜圖中檢測成分較多且峰形較好。用70% 甲醇不同體積進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)30 mL 所提取出來的含量較高。進(jìn)一步用70%甲醇30 mL 分別用回流和超聲提取,發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果誤差不大,為了節(jié)省時(shí)間,故選擇回流。以70% 甲醇為提取溶劑提取30～120 min,結(jié)果發(fā)現(xiàn)60 min 時(shí)提取含量最高。本實(shí)驗(yàn)對確定的對照品和藥材粉末以確定的色譜條件進(jìn)行全波長掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)在330 nm 均有最大吸收峰,保留時(shí)間一致,基線較平穩(wěn),色譜峰形較好,故選擇其作為檢測波長。

表11 一測多評法和外標(biāo)法所得結(jié)果比較（mg/g）Tab.11 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method （mg/g）

山苦荬中由于成分較多,在現(xiàn)有對照品的條件下所測得3 個(gè)含量中綠原酸對照品較易購買,且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以綠原酸為內(nèi)標(biāo)物,在不同儀器和色譜柱上的保留時(shí)間差波動較小,均在5%以內(nèi),由于咖啡酸含量較低,不宜進(jìn)行系統(tǒng)性分析,而木樨草苷的保留時(shí)間大于5%,不宜進(jìn)行待測組分色譜峰的定位。故選擇綠原酸作為內(nèi)標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)考察了不同儀器、色譜柱、體積流量、柱溫、檢測波長對各成分相對校正因子的重復(fù)性,用于驗(yàn)證一測多評法在山苦荬質(zhì)量控制中的可行性和技術(shù)適應(yīng)性。結(jié)果表明,不同條件下相對校正因子的重復(fù)性均較理想。

針對在只使用單一對照品如何正確定位山苦荬中所測得其他2 種成分色譜峰的問題,選擇各成分之間的保留時(shí)間差、相對保留值、分離度作為定位標(biāo)準(zhǔn),并在不同儀器、色譜柱下對二者進(jìn)行考察。結(jié)果表明,相對保留值能更精準(zhǔn)地定位色譜峰。本實(shí)驗(yàn)建立一測多評法同時(shí)測定山苦荬綠原酸、咖啡酸和木樨草苷的含量。該方法簡單、快速、準(zhǔn)確,相對校正因子具有良好的可信度和準(zhǔn)確度。能在對照品短缺的情況下用于含量測定,同時(shí)可減少溶劑消耗和分析時(shí)間,更有利于環(huán)境保護(hù)。