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    骨髓間充質(zhì)干細胞在體分子影像示蹤技術的研究進展

    2021-03-25 11:01:59李天然綜述盧光明審校
    感染、炎癥、修復 2021年2期
    關鍵詞:報告基因干細胞分化

    李天然(綜述) 盧光明(審校)

    (1.解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心放射診斷科,北京 100048;2.解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射診斷科,江蘇 南京 21000)

    基于自體骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)的生物治療是多種疾病最有潛力的治療方法[1-2]。BMSCs移植后,在體BMSCs轉(zhuǎn)歸的監(jiān)測,即移植后BMSCs的分布、活性、分化、凋亡情況的監(jiān)測,一直是干細胞研究的重要方向[3-4]。采用組織病理學觀察的方法進行移植BMSCs監(jiān)測需要離體進行,屬于有創(chuàng)檢測技術[5]。利用現(xiàn)代多模態(tài)分子影像學技術可實現(xiàn)對BMSCs在體、實時命運轉(zhuǎn)歸的示蹤監(jiān)測,能夠無創(chuàng)顯示BMSCs可能的演進方向[6-7]。移植BMSCs的在體影像監(jiān)測包括兩個方面:一是BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤;二是在體BMSCs分化的示蹤?,F(xiàn)將有關BMSCs分子影像學示蹤技術的研究進展綜述如下。

    1 移植 BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤技術

    對于移植BMSCs在體遷移、分布、定位的監(jiān)測,從實現(xiàn)技術上分為光學成像、核磁共振成像(MRI)、正電子成像(PET)和單光子成像(SPECT);從實現(xiàn)方式上主要分為對BMSCs進行直接標記和間接標記兩種方法。

    1.1 直接標記法 一種方法是利用超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide,SPIO)對BMSCs進行標記,通過MRI移植觀察干細胞在腫瘤組織中的定位、遷移及分布。SPIO標記BMSCs主要有兩種方法:一是將SPIO吸附于BMSCs表面,但網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)會清除SPIO標記的細胞;二是細胞將SPIO通過直接吞飲作用、受體介導胞吞作用、轉(zhuǎn)染介導實現(xiàn)示蹤劑內(nèi)在化[8-9]。商品名為菲立磁的SPIO是被美國FDA批準上市的用于臨床MRI成像的示蹤劑。SPIO標記屬于外源性鐵直接標記MRI成像。有學者利用SPIO標記干細胞在體治療軟骨缺損病,在不同時間點行3.0 T MRI掃描,計算T2值作為定量指標,同時利用影像評分法觀察軟骨組織修復情況,結(jié)果顯示,SPIO標記技術有助于利用MRI早期判斷干細胞治療大型動物模型軟骨缺損是否成功[10]。SPIO具有粒徑小、穿透力強、磁標時間長的特點,移植后至少在18周內(nèi)可檢測到磁標細胞,且弛豫率約為同樣條件下釓離子(Gd3+)的7~10倍, 在很低濃度(nmol級)即可在MRI上形成對比,最主要的是,經(jīng)SPIO標記后的BMSCs不改變特性,SPIO對BMSCs無毒性作用、可降解,并且改變粒徑可以改變磁性[11]。甚至有研究表明,SPIO標記對干細胞的生長及其組織修復功能都有增強作用,低強度靜磁場可以增強SPIO協(xié)助促進的成骨分化效應[12]。SPIO主要縮短T2時間,T2信號減低,與周圍組織形成良好對比,即使低濃度也能成像[13]。SPIO磁標細胞的缺點有:①顆粒會導致信號丟失而產(chǎn)生“黑洞”;②鐵因干細胞的增生分裂而被稀釋,使得磁標記的強度下降,因而MRI測定的敏感性降低;③標記細胞死亡后可釋放含鐵標記物,可能會將周圍未標記的細胞標記從而產(chǎn)生假陽性[14-15]。

    直接標記移植BMSCs的另一個方法是熒光成像技術。熒光成像技術中碳量子點(carbon quantum dots,CQDs)技術在生物成像領域的應用已得到拓展。CQDs表面有豐富的羧基基團,通過偶聯(lián)作用可以實現(xiàn)與SPIO結(jié)合,通過吞飲作用進入BMSCs內(nèi),實現(xiàn)穩(wěn)定標記,且不改變BMSCs的理化性質(zhì),并具有通過不同波長的熒光激發(fā)實現(xiàn)多顏色熒光成像的優(yōu)勢[16-17]。

    1.2 間接標記法 間接標記法主要利用BMSCs是基因良好載體這一特性,有學者指出,BMSCs是基因治療中理想的載體細胞,在BMSCs移植前,將多種外源性目的基因整合至BMSCs基因組中,BMSCs不僅能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達外源性基因,而且能夠定向分化,修補受損的組織[18]。對BMSCs進行基因修飾,使之攜帶分子影像探針基因,可以實現(xiàn)對其示蹤。有學者對BMSCs進行跨膜蛋白-鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)染,使之高表達鐵轉(zhuǎn)運蛋白,該蛋白具有聚集鐵離子的能力,從而產(chǎn)生內(nèi)源性鐵-MRI信號成像,實現(xiàn)對BMSCs的示蹤,其優(yōu)點在于使用內(nèi)源性鐵離子成像,無需外源性探針標記,且內(nèi)源性鐵離子表達穩(wěn)定;缺點是伴隨鐵離子集聚會增加活性氧含量,破壞細胞結(jié)構(gòu),這成為阻礙在臨床上開展成像示蹤的原因,并且,隨著細胞的分裂,信號會丟失[19-20]。雖然如此,間接標記法仍優(yōu)于直接標記,因其更能體現(xiàn)BMSCs的活力狀態(tài)以及提供更多的細胞功能信息。另有作者將鐵蛋白重鏈(FTH)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)兩個報告基因同時轉(zhuǎn)染BMSCs對BMSCs進行示蹤,進行體外小動物MRI成像,結(jié)果顯示報告基因能夠為MRI成像提供足夠的信號強度,能夠在體內(nèi)對BMSCs的遷移和分布進行MRI示蹤,并且研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)報告基因轉(zhuǎn)染的BMSCs不影響B(tài)MSCs的生物學特性[21],這為開展基于內(nèi)源性鐵MRI成像示蹤開辟了新途徑。還有研究者將跨膜蛋白碘化鈉轉(zhuǎn)運體(NIS)的基因?qū)隑MSCs內(nèi)并行正電子核素124I標記,將BMSCs細胞移植至肝癌組織中,可以通過124I-PET 監(jiān)測BMSCs在肝癌組織中的活動情況,且NIS不改變BMSCs的理化性質(zhì),其另一優(yōu)點是124I半衰期(半衰期4.2 d)較長,適合較長時間反復觀察[22-23]。

    直接標記和間接標記示蹤移植干細胞都有缺點,因此,基于BMSCs是基因良好載體這一特性,構(gòu)建穩(wěn)定表達、不改變BMSCs生物學特性、易于標記的多模態(tài)分子影像探針,結(jié)合直接標記和間接標記的優(yōu)點,解決BMSCs轉(zhuǎn)歸的在體、實時分子影像監(jiān)測問題是現(xiàn)代干細胞治療的課題之一。多模態(tài)分子影像探針解決了多分子探針重復成像的弊端,還可通過基因轉(zhuǎn)染實現(xiàn)穩(wěn)定表達和標記,適合長期反復使用。

    2 移植BMSCs在體分化的示蹤技術

    通過以上所述的示蹤技術,能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)外BMSCs的遷移、分布、定位的多模態(tài)分子影像學監(jiān)測。然而,在動物模型上的活體BMSCs分化示蹤由于受到某些因素如成像所需分化細胞數(shù)量級別、差異性分子影像探針構(gòu)建和成像設備分辨率等的限制而進展緩慢,而對BMSCs在體分化進行示蹤監(jiān)測更有價值和研究意義,可以實現(xiàn)追蹤BMSCs在特定微環(huán)境下定向誘導分化的去向。因此,BMSCs分化轉(zhuǎn)歸的在體示蹤技術受到關注。BMSCs分化示蹤可以分為細胞學水平示蹤和動物模型水平示蹤兩個層次。要完成BMSCs分化轉(zhuǎn)歸的示蹤,必須借助分子生物學研究的最新技術。

    2.1 報告基因BMSCs成像 典型的報告基因成像技術是熒光蛋白成像,熒光蛋白成像目前多限于基礎生物學研究。熒光蛋白基因通過病毒和質(zhì)粒等載體與目的蛋白基因整合后,可以在宿主細胞內(nèi)表達并在激發(fā)光照射下發(fā)出熒光。在體小動物報告基因成像原理是,BMSCs在特定微環(huán)境誘導下的定向分化過程中,會有某些特異性生物活性因子的表達,利用其中某種特異性生物活性因子基因作為目的基因,利用該目的基因表達的特異性活性蛋白(或因子)作為啟動子驅(qū)動MRI報告基因表達,可實現(xiàn)通過MRI報告基因成像監(jiān)測BMSCs的定向分化;反之,當組織中出現(xiàn)某些特異性生物活性因子表達升高時可以說明BMSCs的分化狀態(tài)及其特定分化方向,因此將某種特異性生物活性因子基因作為啟動子基因就可以實現(xiàn)BMSCs特定方向分化的示蹤,基于磁性物質(zhì)內(nèi)源性鐵MRI成像成為研究的首選報告基因。有研究者通過構(gòu)建神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)啟動子驅(qū)動FTH1基因表達的慢病毒(NSE-FTH1)載體并轉(zhuǎn)染BMSCs,并將轉(zhuǎn)基因BMSCs誘導分化為神經(jīng)元樣細胞,檢測其FTH1的表達及MRI信號變化,研究NSE啟動子驅(qū)動FTH1基因表達的變化并利用MRI成像監(jiān)測BMSCs向神經(jīng)細胞分化的可行性,結(jié)果顯示,NSE啟動子在BMSCs向神經(jīng)細胞分化的過程中能特異性地啟動報告基因FTH1表達,并且MRI信號也發(fā)生改變,作者認為基于NSE啟動子報告基因內(nèi)源性鐵MRI成像可用于BMSCs向神經(jīng)細胞分化的監(jiān)測[24]??梢姡ㄟ^基因轉(zhuǎn)染技術實現(xiàn)BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像是可以實現(xiàn)的,但特異性高表達基因的啟動子的尋找是實現(xiàn)BMSCs定向分化過程中分化示蹤的關鍵。

    2.2 調(diào)控表達報告基因BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像 報告基因成像技術雖然可以實現(xiàn)BMSCs定向分化示蹤,但是這時的BMSCs分化是人為啟動的、非正常BMSCs生理狀態(tài)下、非自然發(fā)生的,人為干預可能改變BMSCs的生物學行為。有研究采用四環(huán)素誘導Tet-On/Tet-Off基因表達調(diào)控系統(tǒng),攜帶自殺基因治療間變型甲狀腺癌,取得良好的效果[25]。利用這個思路,可利用四環(huán)素衍生物強力霉素作為通用誘導啟動子調(diào)控跨膜蛋白如NIS或TfR、FTH目的基因的表達, 且可以有效調(diào)控基因表達的時間和水平[26-28],即當BMSCs在特定微環(huán)境下發(fā)生定向分化時啟動目的基因的表達,實現(xiàn)BMSCs分化示蹤。因此可以進行如下設計:可以將NIS和TfR、FTH基因整合到Tet-On/Tet-Off基因表達調(diào)控系統(tǒng)中作為載體,基因轉(zhuǎn)染BMSCs,通過強力霉素作為誘導啟動子,在BMSCs開始分化的時間段內(nèi)開啟NIS或TfR基因的表達,并進行多模態(tài)分子影像成像,通過對成像規(guī)律的總結(jié)與分子生物學結(jié)果的互證實現(xiàn)對BMSCs分化的在體示蹤監(jiān)測。但BMSCs體外細胞學容易觀察到定向分化時間,而在體動物模型或人體中難以準確觀察到定向分化時間。這就需要用到篩選BMSCs定向分化最終細胞與BMSCs的分子生物標志物的差異技術。

    2.3 自動調(diào)控表達報告基因BMSCs內(nèi)源性鐵MRI成像 采用荷肝癌鼠血清作為誘導刺激培養(yǎng)基,體外誘導培養(yǎng)BMSCs,miRNA 微陣列技術分析BMSCs表達譜的差異,篩選差異最顯著的miRNA,將顯著變化的miRNAs輸入miRNA數(shù)據(jù)庫進行下游目的基因的預測。在體動物模型根據(jù)該目的基因表達相應蛋白水平將其作為指示因子(非啟動子),啟動Tet-On/Tet-Off基因表達調(diào)控系統(tǒng)實現(xiàn)靶基因(如NIS和TfR、FTH)表達[29],進行在體分子影像學BMSCs示蹤成像。更進一步設計,并在此基礎上,探索設計特異性啟動子(specific promoter),當目的基因表達出現(xiàn)差異時,該特異性啟動子啟動靶基因(如NIS或TfR、FTH)的表達,進行MRI分子影像學成像,觀察成像規(guī)律,實現(xiàn)在體BMSCs定向分化的在體示蹤。

    雖然通過這種設計,理論上可以實現(xiàn)BMSCs的分化的自動示蹤,但也存在諸多問題,比如BMSCs內(nèi)轉(zhuǎn)染多種生物活性因子后,對BMSCs的定向分化是否會有影響?對干細胞的生物活性是否存在影響?由此可見,實現(xiàn)BMSCs的在體分化示蹤需要多種生物技術進行合力攻關。

    目前,BMSCs遷移、分布、定位的在體示蹤技術通過合適的標記技術基本可以實現(xiàn),尤其是通過基因修飾實現(xiàn)多模態(tài)分子影像成像成為可能。相比較而言,BMSCs分化的在體多模態(tài)分子影像示蹤技術實現(xiàn)較為困難,主要與靶分子的標記、分化后的降解、設備的分辨率有關,但通過多種生物學技術的合理應用將有望實現(xiàn)BMSCs在體分化的多模態(tài)分子影像示蹤。設計簡單易行、特異性強、靈敏度高、細胞毒性低、受外界干擾小以及移植干細胞的長期定量等優(yōu)點的內(nèi)、外源分子影像探針是科研攻關的目標。

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