井穴放血對(duì)腦淋巴引流阻滯后缺血大鼠腦水腫的影響*

徐夢(mèng)瑤，杜元灝△，高 靚，孟 雪

1 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2 天津中醫(yī)藥大學(xué)

針刺井穴后放血療法輔助治療腦水腫已被證實(shí)有效，關(guān)于井穴放血的作用效應(yīng)和機(jī)制正從臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)等各個(gè)角度被深入發(fā)掘［1-6］。目前，對(duì)于腦水腫臨床療效觀察研究較多，基礎(chǔ)研究較少且多集中在生化、血液、神經(jīng)再生等方面，對(duì)于血管外體液循環(huán)的研究較少。相關(guān)研究［7-9］表明，大腦內(nèi)缺乏完整內(nèi)皮結(jié)構(gòu)的淋巴管結(jié)構(gòu)，而腦組織水腫液和腦內(nèi)大分子物質(zhì)清除主要通過(guò)腦淋巴引流途徑實(shí)現(xiàn)，針刺刺激和放血作用均可加強(qiáng)大鼠淋巴管回流。本研究通過(guò)截?cái)嗄X部淋巴引流的主要通路與井穴放血觀察缺血性水腫大鼠腦水腫引流情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康SD 雄性大鼠，體質(zhì)量約250 g，月齡2～3 個(gè)月，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房籠具內(nèi)（紹豐SIM型、SIR型獨(dú)立換氣系統(tǒng)籠具），溫度：（22±2）℃，濕度≥40%，動(dòng)物飼養(yǎng)及使用符合國(guó)際動(dòng)物倫理相關(guān)動(dòng)物福利要求，自由飲食進(jìn)水。

1.2 動(dòng)物分組將30 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、井穴放血組、缺血+淋巴引流阻滯組、缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組，每組5 只（造模成功并存活至實(shí)驗(yàn)要求時(shí)間，且符合入組標(biāo)準(zhǔn)），實(shí)驗(yàn)觀察周期6 h。

1.3 永久性大腦中動(dòng)脈栓塞模型制備參照LONG等［10］、KOIZUMI等［11］及BELAYEV等［12］的腔內(nèi)線栓法阻滯大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈，制備永久性腦中動(dòng)脈栓塞模型（Permaent Middle Cerebral Artery Occlusion，pMCAO）。大鼠稱重后按照3.5 mL/kg標(biāo)準(zhǔn)給予10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射，充分麻醉后仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，備皮消毒，大鼠頸部正中切口1 cm左右，分步鈍性剝離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，輕剝離圍繞各動(dòng)脈周圍的包膜、血管及神經(jīng)，仔細(xì)游離上述動(dòng)脈，充分暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，于分叉處使用縫合線結(jié)扎頸外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈近心端放置動(dòng)脈夾，使用血管剪在右側(cè)頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉5 mm 處斜剪一小口，用石蠟處理后，采用鈍頭直徑為0.26 mm的線栓經(jīng)切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈約18 mm，適時(shí)調(diào)整線栓推進(jìn)方向和角度，避免誤入翼腭動(dòng)脈，感到阻力后即可停止。阻塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈起始處，以頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處為標(biāo)志，深度約（18.0±0.5）mm。結(jié)扎線栓和右側(cè)頸總動(dòng)脈，松開(kāi)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾，將血管復(fù)位，縫合皮膚并局部消毒，每只注射慶大霉素0.5 mL。使用加熱烤燈將大鼠肛溫維持在（37±0.5）℃左右，假手術(shù)組大鼠除不插入線栓外，其余步驟相同。

1.4 腦淋巴引流阻滯模型制備將pMCAO 模型大鼠（造模 15 min 后）根據(jù) casley-smith 法［13］建立腦淋巴引流阻滯模型。分離兩側(cè)頸淺淋巴結(jié)，每側(cè)3～5 個(gè)，用1 號(hào)絲線分別結(jié)扎其輸入和輸出淋巴管，進(jìn)而摘除淋巴結(jié)。然后在頸總動(dòng)脈與迷走神經(jīng)的后外側(cè)分離出頸深淋巴結(jié)1～2 個(gè)，結(jié)扎其輸入及輸出淋巴管，并摘除淋巴結(jié)，然后逐層縫合創(chuàng)口。每只注射慶大霉素0.5 mL預(yù)防感染。使用加熱烤燈將大鼠肛溫維持在（37±0.5）℃左右。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分參照CHEN 等［14］的神經(jīng)功能缺損評(píng)分（neurological severity scores，NSS）方法，NSS 為一種運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡功能的綜合性評(píng)分指標(biāo)，最高18 分，最低0 分，評(píng)分越高損傷越重。NSS評(píng)分≥2分為造模成功。

1.6 干預(yù)方法除正常組、模型組、假手術(shù)組外，其余各組大鼠完全蘇醒約造模后2 h 開(kāi)始干預(yù)。采用比較解剖學(xué)定位參考人體有關(guān)井穴穴位定位，位于大鼠雙側(cè)前肢趾端十二井穴，使用采血針代替三棱針（針尖更鋒利，大鼠前肢趾端較人體上臂手指指端細(xì)段，采血針能更準(zhǔn)確刺破出血）井穴放血，針刺深度1 mm，快速針刺放血，出血量每穴15～20微升。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 腦組織含水量 大鼠迅速斷頭取腦，棄小腦和雙側(cè)嗅球，將剩余腦組織沿中線切開(kāi)，濾紙吸干表面液體，分別稱取左右腦組織濕重，然后在110℃恒溫烤箱中烘干直至恒重后稱取干重。

腦組織含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%

1.7.2 腦密度 5 mL 的注射器a 下口接三通管，通過(guò)膠管連通用支架垂直固定2 mL微量管和1 mL注射器b，先排凈裝置內(nèi)空氣，微量管內(nèi)定容至0刻度，將分好的左右腦分別放入盛有5 mL 生理鹽水的注射器中，液面升高，抽動(dòng)注射器b 至注射器a 中液面恢復(fù)至放入腦組織前，撥動(dòng)三通管，將注射器b 中生理鹽水打入微量管中并讀數(shù)即為腦組織體積。腦密度=濕重×體積

1.7.3 腦系數(shù) 腦系數(shù)=全腦濕重/動(dòng)物體質(zhì)量×100%；右腦系數(shù)=右腦濕重/動(dòng)物體質(zhì)量×100%；左腦系數(shù)=左腦濕重/動(dòng)物體質(zhì)量×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量本實(shí)驗(yàn)大鼠存活率100%，造模成功率100%。模型組右腦含水量升高，正常組和假手術(shù)組左右腦含水量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示單側(cè)腦淋巴引流阻斷會(huì)造成該側(cè)腦缺血；缺血+淋巴引流阻滯組、缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組右腦含水量與左腦比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功。與井穴放血組比較，模型組右腦含水量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組與缺血+淋巴引流阻滯組、缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組比較腦含水量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示腦淋巴引流自身引流速度有限；但井穴放血組右腦含水量明顯小于缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組（P＜0.05）；缺血+淋巴引流阻滯組與缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組右腦含水量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示井穴放血在淋巴引流阻滯狀態(tài)下無(wú)作用，井穴放血促進(jìn)腦水腫消退的機(jī)制與淋巴引流有關(guān)。見(jiàn)表1。

2.2 腦密度左側(cè)腦密度各組間比較差異均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示腦淋巴引流效應(yīng)在6 h 有限，也可能由于測(cè)量時(shí)的誤差導(dǎo)致；右側(cè)腦密度模型組、缺血+淋巴引流阻滯組、缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而井穴放血組與正常組、假手術(shù)組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示造模成功且井穴放血能抑制腦密度減?。蝗毖?淋巴引流阻滯+井穴放血組與井穴放血組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但存在效應(yīng)趨勢(shì)，提示淋巴阻斷在6 h內(nèi)對(duì)腦水腫的改變作用有限。見(jiàn)表1。

2.3 腦系數(shù)pMCAO 術(shù)后除井穴放血組外，模型組、缺血+淋巴引流阻滯組及缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組左右腦系數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明造模后各組大鼠右側(cè)腦水腫嚴(yán)重，而井穴放血可降低腦系數(shù)。左腦各組間腦系數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)（P＞0.05）。除正常組、假手術(shù)組外，其余各組右腦腦系數(shù)與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），右腦系數(shù)井穴放血組較模型組、缺血+淋巴引流阻滯組及缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組降低（P＜0.05）。全腦系數(shù)井穴放血組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但缺血+淋巴引流阻滯組及缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；缺血+淋巴引流阻滯組及缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組與井穴放血組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而缺血+淋巴引流阻滯組與缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示淋巴阻斷后井穴放血的效應(yīng)減低或消失。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠腦含水量及腦密度比較（）

表1 各組大鼠腦含水量及腦密度比較（）

注：與左腦比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組同側(cè)比較，Δ 表示P＜0.05，ΔΔ 表示P＜0.01；與正常組同側(cè)比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與井穴放血組同側(cè)比較，○表示P＜0.05

右腦1.0904±0.0201ΔΔ 1.0917±0.0207ΔΔ 1.0457±0.0214##1.0652±0.0455 1.0349±0.0318*##1.0421±0.0542##組別正常組假手術(shù)組模型組井穴放血組缺血+淋巴引流阻滯組缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組鼠數(shù)右腦78.6791±0.2815ΔΔ 78.5802±0.3134ΔΔ 80.7810±0.3685**##80.1539±0.3664*Δ#81.0867±0.4197**##81.2647±0.5227**##○腦含水量（%）左腦78.5542±0.1062 78.7192±0.0803 78.9433±0.4469 78.8318±0.5375 78.9918±0.4324 78.9478±0.3918 5 5 5 5 5 5腦密度左腦1.0937±0.0543 1.0895±0.0280 1.0811±0.0378 1.0875±0.0173 1.0841±0.0153 1.0797±0.0433

表2 各組大鼠腦系數(shù)比較（）

表2 各組大鼠腦系數(shù)比較（）

注：與左腦系數(shù)比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組同側(cè)比較，Δ 表示P＜0.05，ΔΔ 表示P＜0.01；與正常組同側(cè)比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與井穴放血組同側(cè)比較，○表示P＜0.05

全腦系數(shù)0.5054±0.0155 0.5072±0.0202 0.5396±0.0148 0.5200±0.0225 0.5509±0.0128Δ##0.5200±0.0225Δ##○組別正常組假手術(shù)組模型組井穴放血組缺血+淋巴引流阻滯組缺血+淋巴引流阻滯+井穴放血組鼠數(shù)5 5 5 5 5 5左腦系數(shù)0.2519±0.0184 0.2529±0.0121 0.2567±0.0102 0.2513±0.0179 0.2544±0.0110 0.2528±0.0152右腦系數(shù)0.2535±0.0125 0.2544±0.0091 0.2883±0.0105*0.2633±0.0134Δ 0.2965±0.0142**0.2887±0.0128*○

3 討論

腦水腫是腦梗死的嚴(yán)重并發(fā)癥，易導(dǎo)致顱內(nèi)壓升高，甚至形成腦疝而致死［15-17］。目前急性期腦水腫的治療方式常造成腎損傷、電解失衡，凝血功能障礙等副作用［18-21］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)阻斷腦淋巴引流通路后再對(duì)腦水腫大鼠進(jìn)行井穴放血治療，6 h 后發(fā)現(xiàn)治療作用基本消失，可能原因是井穴放血除了可以改善缺血局部微循環(huán)外，還可促進(jìn)頸部淋巴對(duì)腦水腫的引流作用，通過(guò)調(diào)節(jié)體液循環(huán)抑制腦水腫發(fā)展。阻斷腦淋巴引流途徑可加重腦水腫，無(wú)法實(shí)現(xiàn)針刺促進(jìn)淋巴管回流的功效，表明井穴放血療法在急救腦缺血方面的有效性，但是測(cè)量手段相對(duì)粗糙，誤差較大，后續(xù)將從腦脊液引流方面進(jìn)行進(jìn)一步研究。