濕潤傷口靈對大鼠創(chuàng)面修復(fù)作用及對VEGF和TGF-β1的影響

汪鍇 張小舟 李娟 陳科力

【摘要】 目的：探討濕潤傷口靈對大鼠創(chuàng)面修復(fù)的影響及可能的機制。方法：選取30只大鼠，每只大鼠背部打3個孔來建立皮膚創(chuàng)傷模型，采用自體對照研究，3個孔分別設(shè)定為給藥組（濕潤傷口靈，n=30）、陽性對照組（重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠，n=30）及模型組（生理鹽水，n=30）。分別在建模用藥后的第1、3、5、7、10、14天，觀察各組大鼠創(chuàng)面愈合情況，同時取創(chuàng)面組織樣本進行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）觀察病理變化，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）和免疫組化法比較各組創(chuàng)面血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達水平。結(jié)果：第3、5、7、10、14天，陽性對照組和給藥組的創(chuàng)面愈合率均高于模型組（P<0.05）;第7、10、14天，給藥組創(chuàng)面愈合率均高于陽性對照組（P<0.05）。第14天，模型組創(chuàng)面形成肉芽組織，膠原纖維排列不規(guī)整，給藥組創(chuàng)面明顯形成肉芽組織，膠原纖維及大量汗腺細胞和導(dǎo)管增生、毛囊規(guī)整排列。給藥組和陽性對照組VEGF與TGF-β1平均累計光密度值均高于模型組（P<0.05）。第3、7天，給藥組和陽性對照組VEGF和TGF-β1的mRNA相對表達量均高于模型組（P<0.05）。第14天，給藥組和陽性對照組VEGF和TGF-β1的mRNA相對表達量均低于模型組（P<0.05），且給藥組和陽性對照組VEGF和TGF-β1的mRNA相對表達量，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：濕潤傷口靈能通過促進大鼠創(chuàng)面中VEGF和TGF-β1的表達，顯著加快大鼠創(chuàng)面組織的愈合。

【關(guān)鍵詞】 濕潤傷口靈 血管生長因子 轉(zhuǎn)化生長因子-β1

Effects of Shirun Shangkou Ling on Wound Healing in Rats and Its Effect on VEGF and TGF-β1/WANG Kai， ZHANG Xiaozhou， LI Juan， CHEN Keli. //Medical Innovation of China， 2021， 18（34）： 032-037

[Abstract] Objective： To explore the effects of Shirun Shangkou Ling on wound healing in rats and its possible mechanism. Method： Thirty rats were selected， and 3 holes were perforated on the back of each rat to establish skin trauma model. Autologous control study was conducted， and 3 holes were set as drug administration group （Shirun Shangkou Ling， n=30）， positive control group （Recombinant Bovine Basic Fibroblast Growth Factor Gel， n=30） and model group （normal saline， n=30）， respectively. Wound healing of rats in each group was observed at day 1， 3， 5， 7， 10， and 14 after modeling medication， respectively. Meanwhile， wound tissue samples were collected for hematoxylin-eosin staining （HE staining） to observe pathological changes. Vascular endothelial growth factor （VEGF） and transforming growth factor -β1 （TGF-β1） were compared in each group by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction （RT-QPCR） and immunohistochemistry. Result： On days 3， 5， 7， 10 and 14， the wound healing rate in positive control group and administration group were higher than those in model group （P<0.05）. On days 7， 10 and 14， the wound healing rate in the administration group were higher than those in the positive control group （P<0.05）. On day 14， granulation tissue was formed on the wound surface of the model group， and collagen fibers were arranged irregularly， while granulation tissue was obviously formed on the wound surface of the administration group， and collagen fibers， a large number of sweat cells and ducts were hyperplasia， and hair follicles were arranged regularly. The average cumulative optical density of VEGF and TGF-β1 in the administration group and positive control group were higher than those in the model group （P<0.05）. On days 3 and 7， the mRNA relative expression levels of VEGF and TGF-β1 in the administration group and positive control group were higher than those in the model group （P<0.05）. On day 14， the mRNA relative expression levels of VEGF and TGF-β1 in the administration group and positive control group were lower than those in the model group （P<0.05）， and there was no statistical significance in the mRNA relative expression levels of VEGF and TGF-β1 between the administration group and positive control group （P>0.05）. Conclusion： Shirun Shangkou Ling can significantly accelerate the healing of rat wound tissues by promoting the secretion of VEGF and TGF-β1 in rat wounds.

[Key words] Shirun Shangkou Ling VEGF TGF-β1

First-author’s address： Xiaogan Hospital Affiliated to Wuhan University of Science Technology， Xiaogan 432000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.34.008

隨著人口老齡化的來臨、抗生素的濫用、大量耐藥菌種的出現(xiàn)，燙傷、燒傷、感染、糖尿病足、壓瘡等各種原因?qū)е码y愈性皮膚缺損患者日趨增多，如何快速有效的治愈此類患者、找到有效針對此類傷口的治療手段有著巨大的社會效益和經(jīng)濟效益[1-2]。日前，國內(nèi)外針對難愈性創(chuàng)面治療的手段不斷更新迭代，但仍對一部分難愈性創(chuàng)面無效。在日常工作中，本科自制配方研制的濕潤傷口靈（專利號ZL201010278057.X）對治療難愈性創(chuàng)面的患者有著良好的效果，且其制備方法簡便快速，創(chuàng)面能夠較常規(guī)換藥提前愈合的天數(shù)、縮短住院時長，且愈合質(zhì)量較常規(guī)手段顯著提高，患者免受取皮植皮的痛苦，為難愈性傷口的良好愈合提供了一種新的有效治療手段，減輕了患者經(jīng)濟負擔和醫(yī)師工作量[3]。

濕潤傷口靈是由鹿角、龍骨、血竭、象皮、二花、生地、當歸、冰片、小麻油等熬制而成，其主要原理是祛瘀生肌，其促進傷口愈合的作用機制尚未明確，因而，課題組申請了湖北省衛(wèi)生健康委項目：濕潤傷口靈對大鼠創(chuàng)面EGF、VEGF表達水平影響的實驗研究。通過建立大鼠皮膚創(chuàng)傷模型，利用免疫組化法和RT-qPCR等方法，對大鼠皮膚創(chuàng)面愈合過程中VEGF和TGF-β1的分子生物學檢測，從分子生物學水平探討其促進創(chuàng)面愈合的內(nèi)在作用機制，并與促進傷口愈合常用藥重組人表皮細胞生長因子進行比較，從動物模型監(jiān)測其療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 湖北省實驗動物研究中心的無特定病原體級實驗動物（SPF級動物），SD大鼠30只，6～8周齡，體重160～180 g，許可證號：[SCXK（鄂）2015-0018]。

1.1.2 藥物與試劑 濕潤傷口靈油劑：由鹿茸30 g、龍骨30 g、血竭30 g、象皮30 g、二花30 g、生地30 g、當歸30 g及冰片50 g、小麻油1 000 g按重量配比準備原料，再將其用不銹鋼鍋微火加熱至80 ℃左右，再用無菌紗布包裹前上所述材料、浸泡在小麻油中并不斷翻動使其受熱均勻熬制成鐵銹色時停止加熱、形成小麻油混合物，最后將冰片置入其內(nèi)完全溶解后瓶裝，制備完成。重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠（生產(chǎn)廠家：珠海億勝生物制藥有限公司，批準文號：國藥準字S20040001，規(guī)格：10 g）、戊巴比妥鈉（生產(chǎn)廠家：Sigma公司，CAS編號：57-33-0，批號P5764-5G，規(guī)格：5 g）、VEGF和TGF-β1（博奧森生物技術(shù)有限公司）。FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（KR106-2）及SuperReal PreMix熒光定量預(yù)混試劑（FP205-02）均于天根生化科技有限公司采購。RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、VEGF和TGF-β1的RT-PCR的引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。石蠟切片免疫組化所使用的EDTA（pH8.0）抗原修復(fù)液、EDTA（pH9.0）抗原修復(fù)液、檸檬酸（pH6.0）抗原修復(fù)液、PBS緩沖液、3%雙氧水、BSA、正常兔血清、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍液、中性樹膠均購自Servicebio公司。無水乙醇和二甲苯購自國藥集團化學試劑有限公司。HE染色所使用的HE染液、分化液、返藍液、組化試劑DAB顯色劑購自Servicebio公司。

1.1.3 主要實驗器械 一次性使用5 mL負壓采血管（山東奧賽特醫(yī)療器械有限公司，型號：肝素鈉）;一次性使用1、5 mL無菌注射器帶針（上海金塔醫(yī)用器材有限公司）;電子分析天平（XB220A）;冷凍離心機（Centrifuge 5804 R）;超聲波清洗器（KQ 3200B）;酶標儀（Synergy 2）;PCR儀（Roche Light cycle 480Ⅱ）;超微量紫外（Nanodrop 2000）;移液槍（型號：Research plus）;Water purifier實驗室專用超純水機及包埋機、凍臺（JJ-12J、JB-P5、JB-L5）;病理切片機（型號：RM2016）;組織攤片機（型號：KD-P）;日本尼康正置光學顯微鏡、成像系統(tǒng)（Nikon Eclipse E100、DS-U3）;脫色搖床（TSY-B）;渦旋混合器（MX-F）;掌上離心機（D1008E）。

1.2 分組與干預(yù)后造模

1.2.1 大鼠皮膚創(chuàng)傷模型的建立與分組方法 選取30只大鼠，動物模型制備參考文獻[3]中的方法，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，稱重，剃除背部及其周圍毛，用0.25%的戊巴比妥腹腔注射麻醉，將麻醉后的大鼠俯臥固定，生理鹽水洗凈擦干，局部消毒后，用直徑0.6 cm的打孔器于背部正中兩側(cè)打3個孔，深達肌筋膜，破壞部分肌肉表面筋膜，表面以凡士林紗布覆蓋。采用自體對照研究，3個孔分別設(shè)定為模型組，陽性對照組，給藥組，每組30個孔。動物單籠飼養(yǎng)，防止大鼠撕咬、舔蹭，給予充分的喂養(yǎng)。

1.2.2 各組處理方法 給藥組創(chuàng)面每天常規(guī)消毒后，給予浸潤濕潤燒傷靈的無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，1次/d;模型組給予浸潤生理鹽水的無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，1次/d;陽性對照組給予重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠，1次/d。

1.3 觀察指標

1.3.1 比較各組肉眼觀察皮膚修復(fù)情況

1.3.2 比較各組創(chuàng)面病理切片觀察情況及創(chuàng)面愈合率 末次給藥2 h后取創(chuàng)口皮膚組織，分別在用藥后的第1、3、5、7、10、14天用0.25%的戊巴比妥麻醉大鼠取樣，用刀片切取各組創(chuàng)面皮膚組織，約0.05 cm3。至于-80 ℃的冰箱中備用，另取部分組織甲醛固定，用于組織學光鏡觀察。建模后第3、5、7、10、14天為各組大鼠創(chuàng)面拍攝圖像，再用圖像分析軟件（Image J）自動計算面積，最后算出創(chuàng)面愈合率。

1.3.3 比較各組創(chuàng)面VEGF和TGF-β1的mRNA表達情況 取各組大鼠皮膚組織，用Trizol裂解后，按照RNA試劑盒提取方法提取總RNA將2 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA稀釋5倍備用，采用SYBR法進行實時熒光定量PCR，反應(yīng)體系為10 μL，引物由Invitrogen上海公司合成，內(nèi)參為GAPDH。使用2-ΔΔCt方法計算mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

1.3.4 比較各組創(chuàng)面VEGF和TGF-β1水平 采用免疫組化法進行檢測。組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH 6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù);后切片放入3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min，將玻片置于PBS（pH 7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，5 min/次;在組化圈內(nèi)滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min;分別加入VEGF和TGF-β1、GAPDH的一抗（濃度

1︰1 000）4 ℃孵育過夜;脫色搖床上晃動洗滌3次孵化相應(yīng)的二抗（濃度1︰8 000～1︰4 000）室溫孵育50 min，DAB顯色。待組織切片干燥后，使用光學顯微鏡進行觀察和拍照，數(shù)據(jù)處理軟件使用Image J，利用光密度（integrated optical density，IOD）為指標用以表示陽性表達量的多少，最后結(jié)果以用平均累計光密度表示。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)擬行方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)比較行單因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著差異。畫圖軟件應(yīng)用GraphPad Prism 8。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肉眼觀察皮膚修復(fù)情況比較 觀察期間所有小鼠均沒有發(fā)生個體死亡或切口感染的情況。建模當天各組創(chuàng)面周邊皮膚和創(chuàng)面中組織均發(fā)紅腫脹，有滲液。第3天僅模型組稍有紅腫和滲液，周緣皮膚開始褶皺，陽性對照組和給藥組周緣皮膚收縮明顯，且創(chuàng)面覆蓋新生薄皮。第5天，各組痂皮均開始形成，模型組創(chuàng)面周緣稍顯縮小;給藥組和陽性對照組創(chuàng)面周緣明顯收縮，整個創(chuàng)面被較厚痂皮覆蓋。第7天，三組創(chuàng)面均漸漸縮小，給藥組有部分大鼠痂皮已脫落。第10天，三組創(chuàng)口附近毛發(fā)開始明顯生成，給藥組和陽性對照組創(chuàng)面明顯縮小，模型組創(chuàng)面面積雖有所縮小，但創(chuàng)面面積明顯大于陽性對照組和給藥組。第14天，三組創(chuàng)面基本修復(fù)，被新生表皮覆蓋，模型組仍可觀察到小塊暗紅色瘢痕，陽性對照組可觀察到微小暗紅色瘢痕，而給藥組創(chuàng)口已經(jīng)全部覆蓋毛發(fā)。見圖1。

2.2 創(chuàng)面愈合過程中各組大鼠創(chuàng)面愈合率的比

較 第3、5、7、10、14天，陽性對照組和給藥組的創(chuàng)面愈合率均高于模型組（P<0.05）;第7、10、14天，給藥組創(chuàng)面愈合率均高于陽性對照組（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠創(chuàng)面病理切片結(jié)果比較 HE染色結(jié)果顯示，與模型組比較，建模第3天，模型組有炎癥細胞浸潤，新生毛細血管，汗腺細胞相對較少見，成纖維細胞排列紊亂;少量炎細胞浸潤給藥組和陽性對照組組，可見新生毛細血管、汗腺細胞、成纖維細胞、上皮細胞大量增生。第7天，模型組仍有炎癥細胞浸潤，上皮細胞增生明顯，新生毛細血管和成纖維細胞數(shù)量較前幾天增多，給藥組和陽性對照組組可見大量成纖維細胞和新生毛細血管，密集汗腺細胞，導(dǎo)管內(nèi)徑增大。第14天，模型組創(chuàng)面形成肉芽組織，膠原纖維排列不規(guī)整，給藥組創(chuàng)面明顯形成肉芽組織，膠原纖維及大量汗腺細胞和導(dǎo)管增生、毛囊規(guī)整排列。見圖2。

2.4 各組大鼠創(chuàng)面VEGF和TGF-β1水平比

較 第3天，模型組創(chuàng)面VEGF與TGF-β1均呈弱陽性表達，見圖3。給藥組和陽性對照組VEGF與TGF-β1平均累計光密度值均高于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.5 各組創(chuàng)面VEGF和TGF-β1的mRNA表達情況比較 第3、7天，給藥組和陽性對照組VEGF和TGF-β1的mRNA相對表達量均高于模型組（P<0.01）。第14天，給藥組和陽性對照組VEGF和TGF-β1的mRNA相對表達量均低于模型組（P<0.05），且給藥組和陽性對照組VEGF和TGF-β1的mRNA相對表達量，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖4、表4。

3 討論

難愈性創(chuàng)面是指患者受傷時皮膚組織損傷嚴重，后期治療過程中由于各種因素造成的傷口未愈合或無愈合傾向的創(chuàng)面，此類創(chuàng)面殘留壞死組織多、局部促進組織修復(fù)的生長因子濃度低、局部血供差等特點[4-5]，這是常規(guī)清創(chuàng)換藥不能解決的，一直是臨床治療中較為棘手的問題。市面?zhèn)鹘y(tǒng)藥物所用敷料由于材料特性和缺乏對創(chuàng)面組織的主動干預(yù)能力，只能起到保護作用[5-6]。與之相比，濕潤傷口靈具有如下優(yōu)點：（1）原料獲取簡單、制備程序簡便、易于保存、操作易重復(fù)、且療效確切;（2）包含祛瘀生肌、解毒清熱、涼血活血、止血收斂及潤滑的功效，將其涂于傷口即可止疼消炎、清除潰爛、解毒生肌，創(chuàng)面愈合快，痊愈后不留瘢痕;（3）治療過程中不需任何設(shè)施，費用低廉，減少患者住院天數(shù)。

本研究通過建立大鼠皮膚創(chuàng)傷模型，在體內(nèi)水平來探討濕潤傷口靈對傷口創(chuàng)面愈合的促進作用及機制。本實驗采用大鼠背部打孔的方法，在同一大鼠上分別肉眼觀察和創(chuàng)面HE染色檢測模型組、給藥組和陽性對照組的傷口修復(fù)情況，避免了動物的個體差異。結(jié)果顯示：從造模第3天開始，給藥組的傷口愈合率明顯強于模型組;從第7天起，傷口愈合率顯著優(yōu)于陽性對照組，給藥組促進傷口愈合速度和效果明顯強于模型組和陽性組。

在慢性難愈性創(chuàng)面中，血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)HF）、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）及TGF-β1等多種生長因子含量均減少[7-10]。創(chuàng)傷愈合是一個復(fù)雜的生物學過程，包括出血與凝血、炎癥滲出、血管和肉芽組織的形成、再上皮化、纖維化和瘢痕改建過程等，在這一系列的生物學過程中TGF-β1、VEGF等各種生長因子發(fā)揮著重要的作用[11-15]。急性損傷時，人體內(nèi)前述生長因子含量尚能發(fā)揮正常功能而參與愈合過程，使皮膚屏障功能得以復(fù)建;隨著愈合時間的延長，炎癥細胞持續(xù)浸潤傷口、蛋白環(huán)境的改變導(dǎo)致生長因子不斷降解的因素，使生長因子不能在傷口處發(fā)揮應(yīng)有的促進愈合的功能，從而不斷延長傷口愈合過程[16-20]。通過RT-qPCR和免疫組化法，本研究結(jié)果顯示，給藥組在用濕潤傷口靈干預(yù)后，和空白對照組相比較，給藥組創(chuàng)面VEGF、TGF-β1含量明顯高于模型組和陽性對照組，揭示濕潤傷口靈可能是通過加速傷口VEGF、TGF-β1分泌來促進難愈性傷口的愈合，這與國內(nèi)外大量研究證明創(chuàng)面組織中VEGF、TGF-β1等生長因子含量的增高有利于創(chuàng)傷愈合，反之則創(chuàng)傷愈合不良相一致[2，7-8]。

綜上所述，濕潤傷口靈能降低傷口炎細胞浸潤，促進大鼠創(chuàng)面中VEGF和TGF-β1的分泌，顯著加快大鼠創(chuàng)面的組織愈合，其促進傷口愈合的效果強于重組人表皮細胞生長因子，有望成為治療難愈性傷口的候選藥物，值得在臨床工作中推廣。

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（收稿日期：2021-09-13）

基金項目：湖北省衛(wèi)生健康委2019年度第一批聯(lián)合基金立項項目（WJ2019H250）

①武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院 湖北 孝感 432000

②湖北中醫(yī)藥大學

通信作者：張小舟