FMRP/mTOR信號級聯(lián)失調與腦損傷早產兒遠期神經發(fā)育的關系

李慧玲 閔雙武 　司媛 　王麗陽 　衣蘭云 戚家峰

【摘要】 目的：探究FMRP/mTOR信號級聯(lián)失調與腦損傷早產兒遠期神經發(fā)育的關系。方法：選取2019年1月-2021年6月在省婦幼保健院出生的60例缺血缺氧性腦損傷早產兒為腦損傷組，選取同時期在醫(yī)院生產的無缺血缺氧性腦損傷早產兒60例為對照組。新生兒出生24 h后抽取血液樣本用于蛋白印跡分析FMRP/mTOR的表達。通過馬倫早期學習量表（MSEL）、皮博迪發(fā)育運動量表（PDMS）和Vineland適應性行為量表（VABS）評估新生兒的神經發(fā)育。結果：腦損傷組FMRP和磷酸化FMRP蛋白表達均低于對照組，p70S6K和磷酸化p70S6K蛋白表達均高于對照組（P<0.05）。腦損傷組MSEL、PDMS和VABS評分均低于對照組（P<0.05）。結論：FMRP/mTOR通路的失調可能在腦損傷早產兒的發(fā)病機制中起作用，會影響幸存者的神經發(fā)育功能，因此，F(xiàn)MRP/mTOR信號通路可能是治療腦損傷早產兒及其神經認知缺陷的一個可能的新分子靶點。

【關鍵詞】 FMRP/mTOR 腦損傷 早產兒 遠期神經發(fā)育 認知行為功能

Relationship between Long-term Neurodevelopment in Preterm Infants with Brain Injury and FMRP/mTOR Signal Cascade Maladjustment/LI Huiling， MIN Shuangwu， SI Yuan， WANG Liyang， YI Lanyun， QI Jiafeng. //Medical Innovation of China， 2021， 18（34）： -130

[Abstract] Objective： To explore the relationship between long-term neurodevelopment of preterm infants with brain injury and FMRP/mTOR signal cascade maladjustment. Method： A total of 60 premature infants with hypoxic-ischemic brain injury born in the Provincial Maternal and Child Health Hospital from January 2019 to June 2021 were selected as the brain injury group， and 60 preterm infants without hypoxic-ischemic brain injury born in the hospital during the same period were selected as the control group. Blood samples were taken at 24 h of birth for Western blot analysis of FMRP/mTOR expression. The neurodevelopment of newborns was evaluated by Marlen scale of early learning （MSEL）， Peabody developmental movement scale （PDMS） and Vineland adaptive behavior scale （VABS）. Result： The expressions of FMRP and phosphorylated FMRP protein in the brain injury group were lower than those in the control group， and the expressions of p70S6K and phosphorylated p70S6K protein were higher than those in the control group （P<0.05）. The scores of MSEL， PDMS and VABS in the brain injury group were lower than those in the control group （P<0.05）. Conclusion： The imbalance of FMRP/mTOR pathway may play a role in the pathogenesis of preterm infants with brain injury and affect the neurodevelopmental function of survivors. Therefore， FMRP/mTOR signaling pathway may be a possible new molecular target for the treatment of preterm infants with brain injury and their neurocognitive defects.

[Key words] FMRP/mTOR Brain damage Premature infant Long-term neurodevelopment Cognitive behavioral function

First-author’s address： Harbin Children’s Hospital， Harbin 150010， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.34.030

近年來，早產兒腦損傷是一個日益受到關注的問題。神經影像學的創(chuàng)新提高了對活嬰兒小腦損傷的診斷敏感性[1]，這些病變的信號特征表明有明顯的出血成分。盡管人們越來越認識到這個問題，但目前關于早產兒腦損傷長期神經發(fā)育后果的數(shù)據(jù)非常有限。迄今為止，結果研究僅限于病例報告或隨訪時年齡分布廣泛的小病例系列，結果通?；卺t(yī)學圖表審查或非正式神經發(fā)育評估。早產是導致包括腦癱在內的長期運動缺陷的一個公認原因[2]。此外，最近關于早產幸存兒長期的研究報告強調了神經發(fā)育的問題，包括認知功能障礙、學習和行為障礙[3]。傳統(tǒng)上，小腦被認為是運動系統(tǒng)的核心組成部分，幾乎沒有任何非運動功能[4]。然而，最近對成人和兒童的研究表明小腦在非運動功能（包括認知、學習和行為）中發(fā)揮重要作用[5]。迄今為止，關于早產相關小腦損傷在認知、語言障礙及行為障礙的數(shù)據(jù)非常有限。鑒于早產兒腦病和自閉癥譜系障礙之間的表型重疊，假設圍生期缺氧缺血性腦損傷可能影響包含與脆性X綜合征有關的FMRP基因的控制通路[6]。脆性X綜合征是智力障礙最常見的遺傳原因，在30%的病例中伴有自閉癥譜系障礙，占所有自閉癥診斷病例的6%。它通常是由FMR基因的三核苷酸重復擴增引起的，導致其轉錄減少或缺失，從而導致FMR蛋白的翻譯減少[7-8]。哺乳動物雷帕霉素靶標（mTOR）信號級聯(lián)是FMRP下游效應器之一，特別被認為是翻譯的中央調節(jié)器，在發(fā)育神經元以建立高級腦功能的突觸基礎上至關重要[9]。值得注意的是，mTOR底物p70S6K可以調節(jié)FMRP的mRNA結合活性，而Fmr1KO小鼠表現(xiàn)出增強的mTOR通路激活并表現(xiàn)出與自閉癥譜系障礙患者相似的行為表型[10]。盡管如此，雖然氧化應激和mGluRs已被證明在早產兒腦病和其他腦部疾病的發(fā)病機制中起主要作用，但缺氧缺血性損傷后圍生期FMRP表達的作用仍未確定。為了填補這項初步研究中的這一空白，筆者評估了腦損傷早產兒FMRP和mTOR的發(fā)育表達，并探討與遠期神經發(fā)育的關系。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月-2021年6月在省婦幼保健院出生的60例缺血缺氧性腦損傷早產兒作為腦損傷組，納入的腦損傷新生兒全部成活，未出現(xiàn)死亡病例。選取同時期無缺血缺氧性腦損傷早產兒60例作為對照組。納入標準：性別不限，胎齡28～37 d;研究組新生兒顱腦超聲報告確診為缺血缺氧性腦損傷，對照組為無缺血缺氧性腦損傷早產兒;參與后期神經發(fā)育功能檢查;全程參與隨訪研究。排除標準：疑似腦畸形、畸形特征、先天性異常;代謝紊亂或中樞神經系統(tǒng)感染。本研究已經醫(yī)院倫理學委員會批準，患兒家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 抗體 以下抗體用于蛋白印跡程序：（1）抗磷酸S6核糖體蛋白（Ser235/236）兔多克隆抗體（貨號2211，1∶200，Cell Signaling，波士頓，馬薩諸塞州）;（2）抗FMRP兔多克隆抗體（Ab17722，1∶5 000，Abcam，Cambridge，MA）;（3）抗GFAP小鼠單克隆抗體（M0761，預稀釋，Dako，安捷倫科技有限公司，加利福尼亞州卡賓蒂亞）;（4）抗OLIG2小鼠單克隆抗體（MABN50，1∶100，馬薩諸塞州比利里卡）;（5）抗mGluR5小鼠單克隆抗體（MABN540，1∶100，馬薩諸塞州比利里卡）。

1.2.2 蛋白質印跡分析 新生兒出生24 h后抽取血液樣本用于蛋白印跡分析。mTOR下游靶標的蛋白質印跡分析p70S6K（貨號2708，1∶200，Cell Signaling，波士頓，馬薩諸塞州）和磷酸化p70S6K（Thr389）（貨號9205，1︰250，Cell Signaling，波士頓。MA）和FMRP（貨號：Ab17722，1∶1 000，馬薩諸塞州劍橋市）和磷酸化FMRP（Ser499）（貨號：Ab48127，1︰500，馬薩諸塞州劍橋市）;抗β-肌動蛋白小鼠單克隆抗體（貨號：A5411，1︰2 000，西格瑪·奧爾德里奇，密蘇里州圣路易斯）根據(jù)常規(guī)方法進行。

1.2.3 神經發(fā)育評估 由兒科神經科醫(yī)生對兩組早產兒進行正式的神經系統(tǒng)檢查，其中包括評估顱骨大小、顱神經、特殊感覺和運動功能（即深腱反射、肌張力、肌肉力量、協(xié)調性和步態(tài)），這些領域中發(fā)現(xiàn)一項異常都被歸類為異常。小頭畸形的定義是頭圍低于矯正年齡的第二個百分位數(shù)。馬倫早期學習量表（MSEL）是針對0～69個月大兒童的標準化發(fā)育評估，由5個分量表組成，即粗大運動、精細運動、視覺接收、接受語言和表達語言。還導出了所有認知表現(xiàn)（早期學習綜合）的一般認知功能的匯總測量，并表示為標準分數(shù)[11]?？梢苑謩e計算五個等級的百分位等級和年齡當量，分數(shù)越高認知功能越好。皮博迪發(fā)育運動量表（PDMS）使用標準化程序客觀地評估兒童的粗大運動和精細運動能力，推導出每個運動域的發(fā)育運動商數(shù)。包括視覺追蹤、抓握能力、上肢移動能力、手眼協(xié)調能力、操作能力，量表各維度按3級評分制：0分為不能嘗試或沒有嘗試做某項動作;1分為在項目中的表現(xiàn)與標準相似，但沒有完全符合標準;2分為在項目中的表現(xiàn)已經達到掌握標準[12]。90分以下判定為該項發(fā)育遲緩，評分越低發(fā)育遲緩越嚴重。Vineland適應性行為量表（VABS）是衡量0～18歲兒童在交流、日常生活、社交和運動技能方面的功能狀態(tài)的判別性規(guī)范參考量度。量表各維度按3級評分制，分值范圍0～100分，平均分值≥90分為優(yōu)，75～89分為良，61～74分為可，≤60分為差，分數(shù)越高，適應性行為越強[13]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 腦損傷組，男嬰28例，女嬰32例;孕周28～36周，平均（32.46±3.52）周;出生體重1.6～3.1 kg，平均（2.25±0.41） kg。對照組，男嬰33例，女嬰27例;孕周27～36周，平均（31.84±3.45）周;出生體重1.7～3.3 kg，平均（2.35±0.43）kg。兩組性別、孕周、出生體重比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組FMR/PmTOR通路表達比較 腦損傷組FMRP和磷酸化FMRP蛋白表達均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;腦損傷組p70S6K和磷酸化p70S6K蛋白表達均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 兩組神經行為發(fā)育評分比較 腦損傷組MSEL、PDMS和VABS評分均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

3 討論

新生兒-圍生期醫(yī)學的技術進步導致早產兒存活率穩(wěn)步上升。雖然早產兒的存活率得到了顯著的提高，但早產兒的腦損傷和長期神經發(fā)育缺陷風險仍然很高，尤其是腦損傷早產兒。

大量幸存早產兒患有嚴重的神經認知缺陷和腦癱，因此早產兒缺氧缺血引起的腦損傷對公共健康具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)FMRP在對照組中過度表達，表明FMRP在該特定時期影響突觸可塑性基因的翻譯調節(jié)中具有生理作用。相比之下，腦損傷早產兒在這個關鍵的發(fā)育時期表現(xiàn)出FMRP的下調和伴隨的mTOR下游靶點的過度表達。在腦損傷組觀察到mTOR信號通路的激活增強，伴隨著FMRP和磷酸化FMRP的下調，這與先前在Fmr1KO小鼠中報道的分子表達非常相似[14]?；钚砸蕾嚨臉渫粻頼RNA翻譯通常由FMRP調節(jié)，F(xiàn)MRP通常與多種其他信號蛋白一起作用，抑制影響突觸可塑性的各種基因的翻譯。FMRP水平與臨床后果的水平相關，包括結構、功能和認知大腦受累[15]。已知mTOR信號級聯(lián)的激活通過促進發(fā)育過程中的分化、軸突伸長和分支以及突觸形成來促進正常神經元生長。然而，正常生理過程的任何中斷都可能對大腦發(fā)育產生影響。mTOR信號的過度激活會導致神經元和神經膠質的異常發(fā)育，從而導致腦畸形[16]。在本研究中，這些新的觀察表明，過早缺氧缺血性腦損傷可能導致其長期后遺癥的機制之一是通過信號通路失調，與遺傳性智力障礙和自閉癥綜合征有關。早產兒腦病包括各種神經元/軸突缺陷、多動癥和自閉癥譜系障礙在內的認知缺陷是其主要的神經發(fā)育后遺癥。

在對遠期神經發(fā)育的研究中，本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比，腦損傷早產兒的后續(xù)神經發(fā)育障礙的風險顯著增加，表明腦損傷早產兒神經行為與患兒的預后相關。眾所周知，小腦在協(xié)調運動中起著核心作用，尤其是在妊娠晚期，小腦的生長發(fā)育迅速增加，這種加速生長的特征是顆粒前體細胞從小腦皮質的外部顆粒層增殖和遷移到內部顆粒層。這個過程對小腦的結構和功能完整性至關重要。在這個發(fā)育階段，小腦特別容易受到缺氧缺血造成發(fā)育損傷。對胎羊的實驗研究表明，圍生期窒息會增加神經元死亡和氧化應激，并減少早產小腦中的小腦層和星形膠質細胞[17]。這些最近的研究結果表明，小腦損傷可能導致與“早產兒腦病”相關的發(fā)病率，并強調了保護小腦免受圍生損傷以防止長期神經發(fā)育障礙的重要性。最近對成人和年齡較大兒童的研究表明，小腦在語言、認知和社會功能的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，因此需要對小腦病理學的功能后果進行更廣泛的調查?，F(xiàn)有報告描述了一個選定的早產兒亞組，具有廣泛和對稱形式的小腦損傷，這些損傷總是與腦橋發(fā)育不全和幕上實質損傷相關[18]。這些嬰兒表現(xiàn)出嚴重的神經功能障礙，包括小頭畸形、痙攣性四肢癱瘓、肌張力障礙、共濟失調和癲癇發(fā)作。然而，這些研究受到使用小樣本、測試時年齡范圍廣泛以及缺乏標準化評估的限制。

綜上所述，F(xiàn)MRP/mTOR通路的失調可能在腦損傷早產兒的發(fā)病機制中起作用，會影響幸存者的神經發(fā)育功能，因此，F(xiàn)MRP/mTOR信號通路可能是治療腦損傷早產兒及其神經認知缺陷的一個可能的新分子靶點。

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（收稿日期：2021-09-14）

基金項目：黑龍江省衛(wèi)生健康委科研項目（2019-235）

①哈爾濱市兒童醫(yī)院 黑龍江 哈爾濱 150010

通信作者：戚家峰