不同來(lái)源膠原蛋白對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

羅德威，歐陽(yáng)輝，黃光春

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌 330045；2.南昌傲凡良品科技有限公司，江西 南昌 331799

成纖維細(xì)胞（Fibroblasts）是皮膚真皮層構(gòu)成中最常見的細(xì)胞，其作為一種修復(fù)細(xì)胞可以合成及分泌膠原、細(xì)胞外基質(zhì)和生長(zhǎng)因子，在創(chuàng)傷修復(fù)、愈合、收縮中起著極其重要的作用［1-3］。皮膚損傷創(chuàng)面的臨床治療方法選擇，一直是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，膠原蛋白在皮膚燒傷的修復(fù)、治療和護(hù)理中能發(fā)揮重要的作用，其能有效地改善傷口燒傷的程度,并起到預(yù)防感染的效果［4-6］。本研究運(yùn)用體外培養(yǎng)人真皮膚成纖維細(xì)胞，觀察不同來(lái)源的膠原蛋白對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)干預(yù)的影響，對(duì)各膠原蛋白生物活性進(jìn)行考察，為進(jìn)一步研究膠原蛋白提供了基礎(chǔ)［7-10］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

不同廠家來(lái)源膠原蛋白粉、彈性蛋白、復(fù)合彈性蛋白、玫瑰花粉、鮭魚蛋白粉共12 種，具體編號(hào)見表1。

表1 膠原蛋白受試樣品編號(hào)

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（GE 有限公司）；胰蛋白酶（Solarbio 有限公司）；青霉素、鏈霉素（Solarbio 有限公司）；胎牛血清（Invitrogen 有限公司）；四氮甲唑藍(lán)（MTT，北京索萊寶科技有限公司）；SDS、異丁醇、鹽酸均試劑均為AR 級(jí)（國(guó)藥試劑）；人真皮成纖維細(xì)胞株（HDF-a 細(xì)胞，中科院上海細(xì)胞庫(kù)，Lot.No 13056）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

3111 細(xì)胞培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技有限公司）；倒置顯微鏡（上海皆準(zhǔn)儀器設(shè)備有限公司）；DK-420S 恒溫水浴鍋（江蘇榮華儀器制造有限公司）；124986D 微量進(jìn)樣器（Eppendorf 公司）；LEICA DMI3000 B 倒置顯微鏡（萊卡公司）；Infinite M2000 PRO 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（TECAN 有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 不同來(lái)源膠原蛋白樣品處理 根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，配制10 000 μg/mL不同來(lái)源膠原蛋白作為評(píng)價(jià)母液，并用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，并稀釋至5 000、2 000、1 000、500、250、125、100、62.5 μg/mL 共8 個(gè)濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 四氮甲唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)膠原蛋白 對(duì)HDF-a 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響將HDF-a 細(xì)胞用胰酶消化，吹打計(jì)數(shù)，稀釋至1×105個(gè)/mL，每孔100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h 后吸出培養(yǎng)基，樣品組加入不同濃度膠原蛋白100 μL，空白對(duì)照組加入等量的細(xì)胞培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)孵育48 h后每孔加入20 μL（5 mg/mL）MTT，再于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL 濃度10%的SDS 三聯(lián)溶解液，靜置孵育過夜后，于酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度（檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm）。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組吸光度/空白對(duì)照組吸光度均值×100。

2 結(jié)果

由（圖1）可見，1 號(hào)、2 號(hào)除在濃度100 μg/mL 外，在其他各濃度對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)均為促進(jìn)作用。4號(hào)、8 號(hào)、10 號(hào)、11 號(hào)和12 號(hào)，于本實(shí)驗(yàn)的不同濃度下對(duì)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)均起到促進(jìn)效果，且10 號(hào)對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)作用最為顯著。9 號(hào)除在濃度62.5 μg/mL 外，在其他各濃度下作用成纖維細(xì)胞均起到了促進(jìn)生長(zhǎng)效果。5 號(hào)在本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的濃度下對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)均為抑制作用。3 號(hào)、6 號(hào)除了在濃度為10 000 μg/mL 情況之外，在其他濃度下對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)均為抑制作用。7 號(hào)除了在10 000 μg/mL、2 000 μg/mL 情況外，在其他濃度下對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)均為抑制作用。具體影響情況見表2。

圖1 膠原蛋白在不同濃度下對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞存活率的影響

表2 膠原蛋白對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響

3 討論

MTT 檢測(cè)法結(jié)果顯示，不同來(lái)源的膠原蛋白，大部分對(duì)HDF-a 細(xì)胞均能起到生長(zhǎng)促進(jìn)的作用，驗(yàn)證了膠原蛋白可以作用臨床皮膚損傷創(chuàng)面治療使用。過高或過低濃度的膠原蛋白，均不能起到最佳促進(jìn)纖維蛋白生長(zhǎng)作用，在臨床中要選擇最適濃度進(jìn)行治療。部分膠原蛋白對(duì)HDF-a 細(xì)胞生長(zhǎng)起到了抑制作用，這種情況的出現(xiàn)可能與對(duì)HDF-a 細(xì)胞起到了免疫排斥作用有關(guān)，在臨床使用中，需進(jìn)一步甄別不同來(lái)源膠原蛋白，杜絕不合理膠原蛋白使用。

本研究中，考察了12 個(gè)批次來(lái)源膠原蛋白對(duì)HDF-a 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。各批次樣品設(shè)置了10 000 μg～62.5 μg 范圍內(nèi)9 個(gè)濃度值，涵蓋范圍廣。對(duì)膠原蛋白發(fā)揮對(duì)細(xì)胞活性影響進(jìn)行了有效的篩選，對(duì)于解釋膠原蛋白對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控提供了基礎(chǔ)。本次研究只針對(duì)體外活性進(jìn)行了考察，由于創(chuàng)面損傷修復(fù)過程發(fā)生在復(fù)雜體內(nèi)，關(guān)于膠原蛋白參與真皮組織修復(fù)的內(nèi)在機(jī)制，尚有待于進(jìn)一步探索［11-13］。

膠原蛋白因其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，日漸成為生物醫(yī)學(xué)、功能性保健品領(lǐng)域的熱門研究課題［14-16］。皮膚損傷創(chuàng)面治療中使用具有優(yōu)良修復(fù)功能的膠原蛋白，展示出了極具前景的治療效果，但關(guān)于膠原蛋白促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)在基因水平、蛋白水平及分子水平的具體作用機(jī)制還有待深入研究。