劉桂鳳,周志強(qiáng),許妍,廖爭(zhēng)爭(zhēng)
1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院,國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心,江西 南昌 330029;2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院,江西 南昌 330004
黃秋葵Abelmoschus esculentus(L.)Moench 為原產(chǎn)于非洲熱帶地區(qū)的錦葵科秋葵屬一年生草本植物,又稱羊角豆等。黃秋葵以果實(shí)供食用,既是營(yíng)養(yǎng)豐富的鮮美蔬菜,又有藥用保健效果。于20 世紀(jì)90 年代引入我國,具有利咽、通淋、下乳、調(diào)經(jīng)之功效[1]。在民間,人們稱其果實(shí)為植物界的“偉哥”[2]。隨著對(duì)黃秋葵研究的深入,發(fā)現(xiàn)黃秋葵的花、種子、根對(duì)惡瘡及癰癤具有較好的療效。近年來,又發(fā)現(xiàn)其有許多新的藥理作用,例如抗疲勞、保肝護(hù)肝、提高免疫力等功效。除此之外,本課題組還發(fā)現(xiàn)黃秋葵的鎮(zhèn)靜催眠效果也較為明顯[3]。目前為止,黃秋葵中分離得到化學(xué)成分主要有不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、黃酮類化合物、生物堿、甾醇類以及氨基酸等多種成分。
為了研究黃秋葵的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本課題組對(duì)黃秋葵果實(shí)的正丁醇部位經(jīng)AB-8 型大孔樹脂富集后的化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化,并利用其理化性質(zhì)及1H-NMR、13C-NMR 等波譜技術(shù)鑒定了其中的10個(gè)化合物結(jié)構(gòu),分別為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、熊果酸、山柰酚、金絲桃苷、沒食子酸、香草酸、楊梅苷(myricetrin)、橙皮苷。
閃式提取器(河北金鼎科技有限公司),Bruker ARX-300,AV-600 型核磁共振儀(TMS 為內(nèi)標(biāo),瑞士Bruker 公司),Shimadzu LC-8A 型制備型高效液相色譜儀(日本Shimadzu 公司)。大孔樹脂AB-8、柱層析硅膠(200~300 目)、柱層析聚酰胺(60~90 目)和薄層色譜硅膠(青島海洋化工有限公司),ODS 柱層析材料(美國Merck 公司),SephadexLH-20 凝膠(瑞典Amersham Biosciences 公司),分析純?cè)噭ㄌ旖虼竺瘜W(xué)試劑廠),色譜甲醇(山東禹王事業(yè)有限公司),水為超純水。
黃秋葵于2015 年8 月購自山東萊陽,經(jīng)沈陽藥科大學(xué)功能食品與葡萄酒學(xué)院賈英教授鑒定為黃秋葵Abelmoschus esculentus(L.) Moench 成熟果實(shí)。
黃秋葵果實(shí)(去種子)7.5 kg,自然干燥后粉碎,以藥材10 倍量60%乙醇閃式提取3 次,每次提取30 s,合并濾液,回收溶劑,減壓干燥后得總浸膏1 321 g。加60 ℃熱水使其溶解,依次用二氯甲烷、正丁醇各萃取三次,得二氯甲烷部位(189.3 g)、正丁醇部位(380 g)。
正丁醇部位浸膏用60 ℃熱水溶解后,經(jīng)大孔樹脂AB-8 處理后,依次用30%、50%、75%、100%乙醇梯度洗脫,合并相同梯度洗脫液,得30%洗脫餾分浸膏60.8 g。此部位通過聚酰胺柱色譜(60~90目)分離,用二氯甲烷-乙酸乙酯(50∶1,25∶1,4∶1,1∶10,1∶50)梯度洗脫,通過薄層檢視,合并相同餾分,得餾分Fr.1~Fr.5。Fr.1(10 g)經(jīng)硅膠柱色譜(200~300 目),以二氯甲烷-甲醇(30∶1,20∶1,15∶1,10∶1,7∶1,5∶1,3∶1,1∶1)進(jìn)行梯度洗脫,得到化合物1(32 mg)和化合物2(24 mg)。Fr.2(11 g)通過ODS 柱色譜,以甲醇-水(20∶80~60∶50)梯度洗脫,合并相近組分Fr.2-1~Fr.2-6,F(xiàn)r.2-3(83 mg)經(jīng)制備高效液相色譜,以甲醇-水(35∶65)為流動(dòng)相,分離得到化合物3(23 mg)和化合物5(9 mg)。Fr.3(8.5 g)經(jīng)硅膠柱色譜(200~300 目),以二氯甲烷-甲醇(15∶1,10∶1,7∶1,5∶1,3∶1,1∶1)進(jìn)行梯度洗脫,合并相同組分Fr.3-1~Fr.3-4,F(xiàn)r.3-2(108 mg)通過凝膠柱色譜,純甲醇洗脫,得到化合物6(19 mg);Fr.3-3(183 mg)經(jīng)ODS 柱色譜,以甲醇-水(15∶80~60∶50)梯度洗脫,合并相近組分Fr.3-3-1~Fr.3-3-3,F(xiàn)r.3-3-2(55 mg)經(jīng)制備高效液相色譜,以甲醇-水(26∶74)為流動(dòng)相,制備得到化合物7(12 mg)。Fr.4(13 g)通過凝膠柱色譜,以甲醇洗脫,分離得到相近組分Fr.4-1~Fr.4-6,F(xiàn)r.4-2(131 mg)通過凝膠柱色譜,純甲醇洗脫,分離得到化合物4(18 mg)和化合物8(51 mg);Fr.4-4(381 mg)通過ODS 柱色譜,以甲醇-水(20∶80~60∶50)梯度洗脫,經(jīng)薄層檢視,合并相近組分Fr.4-4-1~Fr.4-4-7,F(xiàn)r.4-4-3(107 mg)通過凝膠柱色譜,甲醇洗脫,分離得到化合物9(25 mg)。Fr.5(3 g)通過ODS 柱色譜,以甲醇-水(20∶80~60∶50)梯度洗脫,經(jīng)薄層檢視,合并相近組分Fr.5-1~Fr.5-6,F(xiàn)r.5-3(81 mg)經(jīng)過制備高效液相色譜,以甲醇-水(15∶85)為流動(dòng)相,制備得到化合物10(29 mg)。
化合物1:黃色粉末,HCl-Mg 粉反應(yīng)、三氯化鐵試劑顯色反應(yīng)均為陽性。ESI-MS(m/z):449.2 [M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.66(1H,br s,5-OH),10.85(1H,brs,7-OH),9.72(1H,brs,4′-OH),9.38(1H,brs,3′-OH),7.31(1H,s,H-2′),7.26(1H,dd,J=8.3,2.0 Hz,H-6′),6.87(1H,d,J=8.3 Hz,H-5′),6.21(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.40(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),5.27(1H,d,J=1.21 Hz,H-1″),0.83(3H,d,J=5.9Hz,H-6″);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:156.5(C-2),134.2(C-3),177.8(C-4),161.0(C-5),98.5(C-6),164.1(C-7),93.3(C-8),157.0(C-9),103.8(C-10),121.2(C-1′),115.4(C-2′),145.0(C-3′),148.2(C-4′),115.2(C-5′),120.5(C-6′),101.7(C-1″)、70.2(C-2″)、70.1(C-3″)、71.2(C-4″)、70.1(C -5″)、17.5(C -6″),以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4],故鑒定為槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷。
化合物2:黃色粉末,HCl-Mg 粉反應(yīng)、三氯化鐵試劑顯色反應(yīng)均為陽性。ESI-MS(m/z):465.4 [M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.65(1H,brs,5-OH),10.87(1H,brs,7-OH),9.75(1H,brs,4′-OH),9.24(1H,brs,3′-OH),7.59(2H,m,H-2′,6′),6.84(1H,d,J=8.9 Hz,H-5′),6.40(1H,d,J=1.7 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=1.7 Hz,H-6),5.47(1H,d,J=7.2 Hz,H-1′′),3.08~3.56(m,sugar protons);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:156.5(C-2),133.0(C-3),177.8(C-4),161.5(C-5),98.5(C-6),164.4(C-7),93.2(C-8),156.0(C-9),104.5(C-10),121.3(C-1′),116.0(C-2′),144.3(C-3′),148.0(C-4′),115.5(C-5′),121.7(C-6′),糖區(qū)碳信號(hào):100.3(C-1′′)、74.4(C-2′′)、76.1(C-3′′)、69.5(C-4′′)、77.2(C -5′′)、61.3(C -6′′),以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5],故鑒定為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物3:黃色粉末,HCl-Mg 粉反應(yīng)、三氯化鐵試劑顯色反應(yīng)均為陽性。ESI-MS(m/z):303.2[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.48(1H,brs,5-OH),7.74(1H,s,H-2′),7.56(1H,d,J=8.09 Hz,H-6′),6.91(1H,d,J=8.12 Hz,H-5′)是一組B 環(huán)未完全裂分的ABX 耦合系統(tǒng),6.41(1H,s,H-8),6.19(1H,s,H-6)是一組A 環(huán)未裂分的間位耦合的芳環(huán)系統(tǒng);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:147.0(C-2),136.0(C-3),176.1(C-4),156.5(C-5),98.5(C-6),164.2(C-7),93.7(C-8),161.0(C-9),102.8(C-10),121.9(C-1′),115.4(C-2′),144.8(C-3′),147.4(C-4′),115.0(C-5′),118.5(C -6′),以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6],故鑒定為槲皮素。
化合物4:白色粉末狀結(jié)晶,Molish 反應(yīng)呈陰性。ESI-MS(m/z):373.8[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:5.12(1H,brs,H-12),4.31(1H,d,J=5.28 Hz,H-3 ),3.00(1H,m,H-3α),2.10(1H,d,J=11.28 Hz,H-18),1.31(3H,s,H-27),1.04(3H,s,H-26),0.86(3H,s,H-30),0.74(3H,s,H-23),0.67(3H,s,H-24),0.91(3H,d,J=7.95 Hz,H-29),0.81(3H,d,J=6.20 Hz,H-25);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:38.5(C-1),26.5(C-2),76.3(C-3),38.1(C-4),54.4(C-5),22.4(C-6),32.3(C-7),39.0(C-8),46.2(C-9),36.1(C-10),17.7(C-11),124.2(C-12),137.8(C-13),41.2(C-14),27.8(C-15),23.3(C-16),46.5(C-17),52.0(C-18),38.0(C-19),37.8(C-20),29.8(C-21),35.9(C-22),27.1(C-23),14.8(C-24),15.8(C-25),16.5(C-26),22.4(C-27),177.9(C-28),22.9(C-29),20.8(C-30),以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7],故鑒定為熊果酸。
化合物5:黃色粉末,HCl-Mg 粉反應(yīng)、三氯化鐵試劑顯色反應(yīng)均為陽性。ESI-MS(m/z):287.2[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.19(1H,d,J=1.89 Hz,H-6),6.43(1H,d,J=1.91 Hz,H-6),6.92(2H,d,J=9.08 Hz,H-3′,5′),8.04(2H,d,J=8.84 Hz,H-2′,6′);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:146.8(C-2),135.5(C-3),175.8(C-4),160.8(C-5),98.3(C-6),163.7(C-7),93.7(C-8),156.4(C-9),103.3(C-10),121.5(C-1′),129.3(C-2′,6′),115.2(C-3′,5′),159.3(C-4′)。以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[8],故鑒定為山柰酚。
化合物6:黃色粉末,HCl-Mg 粉反應(yīng)、三氯化鐵試劑顯色反應(yīng)均為陽性,Molish 反應(yīng)呈陽性。ESI-MS(m/z):465.4[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:7.52(1H,d,J=1.98 Hz,H-2′),7.67(1H,dd,J=8.14,2.10 Hz,H-6′),6.81(1H,d,J=8.52Hz,H-5′),6.40(1H,d,J=1.78Hz,H-8),6.20(1H,d,J=1.99 Hz,H-6),5.38(1H,d,J=7.72,H-1′′);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:156.3(C-2),133.7(C-3),177.3(C-4),161.5(C-5),98.6(C-6),164.3(C-7),93.6(C-8),156.5(C-9),104.4(C-10),122.0(C-1′),115.4(C-2′),144.7(C-3′),148.3(C-4′),116.2(C-5′),121.3(C-6′),101.8(C-1′′),71.2(C-2′′),73.2(C-3′′),68.0(C-4′′),75.9(C-5′′),60.2(C-6′′),以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9],故化合物6 鑒定為金絲桃苷。
化合物7:無色針狀結(jié)晶,ESI-MS(m/z):171.2[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.25(1H,brs,-COOH),9.23(2H,brs,3,5 -OH),8.87(1H,brs,4 -OH),6.93(2H,s,H -2,6);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:120.6(C-1),108.9(C-2,6),145.5(C-3,5),138.1(C-4),167.6(C-7),以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10],故鑒定化合物7 為沒食子酸。
化合物8:淡黃色針狀結(jié)晶,三氯化鐵-鐵氰化鉀反應(yīng)陽性,Molish 反應(yīng)呈陰性。ESI-MS(m/z):169.2[M+H]+。1H-NMR(600 MHz,DMSO-d6)δ:12.52(1H,brs,H-1),9.86(1H,s,H-4 ),7.42(2H,brsJ=7.8Hz,H=2,6),6.84(1H,d,J=7.8Hz,H-5),3.80(3H,s);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:56.0(-OCH3),122.0(C-1),113.3(C-2),147.9(C-3),151.3(C-4),115.3(C-5),122.0(C-6),167.7(C-7),以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11],故鑒定為香草酸。
化合物9:淡黃色片狀結(jié)晶,HCl-Mg 粉反應(yīng)陽性、三氯化鐵試劑顯色反應(yīng)均為陽性,Molish 反應(yīng)呈陽性。ESI-MS(m/z):465.1[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.68(1H,brs,5-OH),9.30(2H,brs,3′-OH,5′-OH),6.90(2H,s,H-2′,6′),6.37(1H,s,H-8),6.20(1H,s,H-6),5.21(1H,s,H-1′′),4.97(1H,brs,2′′-OH),4.74(1H,brs,3′′-OH),4.62(1H,brs,4′′-OH),3.99(1H,s,H-2′′),3.55(1H,d,J=8.8Hz,H-3′′),3.15(2H,m,H-4′,5′),0.84(3H,d,J=6.1Hz,H-6′′);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:156.6(C-2),134.4(C-3),178.0(C-4),161.5(C-5),98.9(C-6),164.4(C-7),93.7(C-8),157.7(C-9),104.1(C-10),119.9(C-1′),108.3(C-2′,6′),145.7(C-3′,5′),136.4(C-4′),102.3(C-1′′),70.4(C-2′′),70.9(C-3′′),71.6(C-4′′),70.5(C-5′′),17.5(C-6′′)。以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12],故鑒定為楊梅苷(myricetrin)。
化合物10:白色粉末,三氯化鐵試劑顯色反應(yīng)、HCl-Mg 粉反應(yīng)和Molish 反應(yīng)均為陽性。ESIMS(m/z):593.3[M+H]+。1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:12.02(1H,brs,5-OH),5.50(1H,m,H-2),2.77(1H,dd,J=3.13,7.17 Hz,H-3),4.98(1H,t,J=6.8 Hz,H-1′′′),3.24(1H,m,H-3a),3.38(3H,s,4′-OCH3),1.08(3H,d,J=6.0 Hz,6′′′-CH3);13C-NMR(150 MHz,DMSO-d6)δ:55.7(C-CH3),78.3(C-2),42.2(C-3),197.0(C-4),163.0(C-5),96.3(C-6),165.1(C-7),95.5(C-8),162.5(C-9),100.6(C-10),130.9(C-1′),114.1(C-2′),147.9(C-3′),146.4(C-4′),112.0(C-5′),117.9(C-6′),99.4(C-1′′),73.0(C-2′′),76.2(C-3′′),70.2(C-4′′),75.5(C-5′′),66.0(C-6′′),103.3(C-1′′′),70.6(C-2′′′),72.0(C-3′′′),69.6(C-4′′′),68.3(C-5′′′),17.8(C-6′′′)。以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13],故鑒定為橙皮苷。