SMYD3基因在急性髓系白血病中的表達(dá)及其臨床意義

張怡 王娟娟 馬超 徐凱紅 歐陽桂芳 牧啟田

【摘要】 目的：研究SMYD3基因在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中的表達(dá)情況，探討其臨床意義。方法：收集2012年9月-2015年7月在本院就診的初發(fā)AML骨髓樣本87例，非腫瘤患者骨髓20例為對(duì)照樣本，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SMYD3基因表達(dá)水平，統(tǒng)計(jì)分析其與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果：初發(fā)AML的SMYD3基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.001）;將AML分為M3組與非M3組，M3組與非M3組的SMYD3基因表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P<0.001）;非M3組的SMYD3基因表達(dá)水平高于M3組（P<0.05），年齡大于M3組和對(duì)照組（P<0.05）。結(jié)論：SMYD3在初發(fā)AML中呈現(xiàn)高表達(dá)，是一種AML相關(guān)基因，非M3比M3有更高的SMYD3表達(dá)水平。

【關(guān)鍵詞】 SMYD3 急性髓系白血病 基因表達(dá)

Expression Level of SMYD3 Gene in Acute Myeloid Leukemia and Its Clinical Significance/ZHANG Yi， WANG Juanjuan， MA Chao， XU Kaihong， OUYANG Guifang， MU Qitian. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： 0-026

[Abstract] Objective： To investigate the expression level of SMYD3 gene in patients with acute myeloid leukemia （AML） and to evaluate its clinical significance. Method： A total of 87 bone marrow samples of AML patients with initial onset was collected from our hospital from September 2012 to July 2015， and 20 bone marrow samples from non-tumor patients was used as control samples. The expression level of SMYD3 gene was determined by real time quantitative PCR， and the relationship between SMYD3 gene and clinical features were analyzed. Result： The expression level of SMYD3 gene in newly diagnosed AML was significantly higher than that in the control group （P<0.001）; AML was divided into M3 group and non-M3 group， SMYD3 gene expression level of M3 group and non-M3 group was significantly higher than that of control group （P<0.001）; the expression level of SMYD3 gene in non-M3 group was higher than that in M3 group （P<0.05）， older than those of M3 group and control group （P<0.05）. Conclusion： SMYD3 is highly expressed in primary AML， it is an AML-related gene， non-M3 has higher SMYD3 expression levels than M3.

[Key words] SMYD3 Acute myeloid leukemia Gene expression

First-author’s address： Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.006

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，其耐藥率、復(fù)發(fā)率和死亡率居高不下，因此迫切需要尋找新的相關(guān)基因作為診斷、預(yù)后監(jiān)測(cè)的新靶點(diǎn)。SET和MYD結(jié)構(gòu)域蛋白3（SET and MYND domain-containing 3 protein，SMYD3）由東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院Hamamoto等[1]于2004年在肝癌及結(jié)腸癌中首次發(fā)現(xiàn)，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，成為近幾年腫瘤研究的新熱潮。本研究前期的體外研究也證明沉默SMYD3基因后乳腺癌細(xì)胞侵襲性明顯降低[2-4]。但是SMYD3在血液腫瘤中的報(bào)道較為少見，在AML中的研究迄今尚無報(bào)道。為探討SMYD3基因在AML中的表達(dá)情況，本研究分析87例初發(fā)AML中的SMYD3表達(dá)情況，為AML的研究提供了新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取2012年9月-2015年7月在本院就診的初發(fā)AML骨髓樣本87例為AML組，其中男53例，女34例;年齡15～87歲，中位49歲。AML的診療標(biāo)準(zhǔn)參考成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血病）中國診療指南（2011年版）和急性早幼粒細(xì)胞白血病中國診療指南（2011年版）[5-6]。FAB分型：M0 1例，M1 3例，M2 3例，M3 38例，M4 24例，M5 18例。將初發(fā)AML的標(biāo)本按FAB分型分為M3組（n=38）和非M3組（n=49）。對(duì)照組樣本20例為非腫瘤患者骨髓。本研究已通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批（2021-R039），獲得患者或其家屬的知情同意。

1.2 材料 TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑為賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品。TB Green PCR試劑為寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品。Ficoll細(xì)胞分離液為美國GE公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司StepOne Plus。核酸蛋白檢測(cè)儀為賽默飛世爾科技（中國）有限公司NANODROP 2000。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）提取RNA：按骨髓樣本2 mL︰Ficoll細(xì)胞分離液1 mL的比例，密度梯度離心法獲取單個(gè)核細(xì)胞，按TRIzol試劑說明書提取mRNA，核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)mRNA濃度和純度（A260/A280為1.8～2.0）。（2）cDNA合成：按反轉(zhuǎn)錄試劑說明書兩步法合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL。RNA

1 μg，隨機(jī)引物1 μL，水補(bǔ)至12 μL，65 ℃，5 min，至冰上，加M-Mulv 1 μL，dNTP 2 μL，5×緩沖液4 μL，RNA酶抑制劑1 μL，42 ℃，60 min，70 ℃，5 min。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增SMYD3基因：引物序列（5’-3’）：SMYD3基因上游TGT GAC TGT TTC CGT TGC，下游 CAG AAC CTG CTC CCA CTT[2-4];內(nèi)參基因GAPDH上游GAA GGT GAA GGT CGG AGT C，下游GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC。反應(yīng)體系為20 μL：2×TB Green PCR混合液10 μL，

上下游引物各0.8 μL，50×ROX染料0.4 μL，cDNA 2 μL，水6 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃，30 s，1個(gè)循環(huán);95 ℃，5 s，60 ℃，30 s（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。SMYD3和GAPDH基因的擴(kuò)增效率須在90%以上。擴(kuò)增后增加熔解曲線步驟以確定擴(kuò)增特異性。熔解曲線條件：95 ℃，15 s，60 ℃，60 s+

0.3 ℃（收集熒光信號(hào)），95 ℃，15 s。每孔樣本的熔解曲線須僅見單峰，峰值在80～90 ℃。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每批次樣本均以細(xì)胞株THP-1為內(nèi)對(duì)照，并設(shè)陰陽性對(duì)照。（4）SMYD3基因表達(dá)量計(jì)算方法：以細(xì)胞株THP-1為內(nèi)對(duì)照，2-??Ct法計(jì)算SMYD3基因表達(dá)量。?Ct=[CtSMYD3-CtGAPDH]樣本-[CtSMYD3-CtGAPDH]內(nèi)對(duì)照。因部分?jǐn)?shù)據(jù)較小，SMYD3基因量以2-??Ct×100表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈非正態(tài)分布，以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用字2檢驗(yàn)、連續(xù)校正字2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML組和對(duì)照組患者臨床特征及SMYD3基因表達(dá)水平比較 兩組年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;AML組的SMYD3基因表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見表1。

2.2 非M3組、M3組和對(duì)照組的臨床特征及SMYD3基因表達(dá)水平比較 非M3組的年齡大于M3組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;M3組和對(duì)照組的年齡及三組的性別構(gòu)成比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;非M3組和M3組的SMYD3基因表達(dá)水平均高于對(duì)照組（P<0.001）;非M3組的SMYD3基因表達(dá)水平高于M3組（P<0.05）。見表2。

2.3 初發(fā)AML患者高表達(dá)水平組和低表達(dá)水平組的SMYD3基因表達(dá)水平和臨床特征比

較 以SMYD3基因作為分類變量，將初發(fā)AML根據(jù)SMYD3中位表達(dá)數(shù)27.49分為高水平表達(dá)組（≥27.49，n=44）和低水平表達(dá)組（<27.49，n=43）。高水平表達(dá)組的SNYD3基因表達(dá)水平為39.67（34.00，56.44），低水平表達(dá)組為16.75（12.66，20.41）。兩組的年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、高白細(xì)胞（≥100×109/L）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)以及FAB分型比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.4 非M3患者SMYD3基因表達(dá)水平和臨床特征關(guān)系 以SMYD3基因作為分類變量，將初發(fā)AML（非M3）根據(jù)SMYD3中位表達(dá)數(shù)29.86分為高水平表達(dá)組（≥29.86，n=25）和低水平表達(dá)組（<29.86，n=24）。高水平表達(dá)組的SNYD3基因表達(dá)水平為49.26（37.26，101.84），低水平表達(dá)組為17.50（12.72，25.15）。兩組的臨床特征與SMYD3基因表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

SMYD3是近幾年備受關(guān)注的腫瘤相關(guān)基因，位于染色體1q44，是SMYD（含有SET和MYND結(jié)構(gòu)域）家族蛋白中的重要成員[1]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)SMYD3不僅高表達(dá)于肝癌和結(jié)腸癌[1]，在乳腺癌[2-4]、肺癌[7]、前列腺癌[8]、膽囊癌[9]、胰腺癌[10]、卵巢癌[11]等各種實(shí)體腫瘤中也均呈現(xiàn)高表達(dá)。針對(duì)其作用機(jī)制的多方研究證實(shí)，SMYD3位于多條通路的關(guān)鍵位置，可接受多種上游基因的調(diào)節(jié)[12]，也可調(diào)節(jié)多種下游基因[13]，在促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮不可或缺的作用。敲除SMYD3可恢復(fù)其所調(diào)節(jié)的基因的正常表達(dá)模式，從而阻止癌細(xì)胞不可控制的無限增殖[14]。本研究前期的體外實(shí)驗(yàn)也顯示，SMYD3在乳腺癌細(xì)胞株上呈現(xiàn)高表達(dá)，microRNA沉默SMYD3后可通過Wnt/β-Catenin通路下調(diào)C-Myc基因表達(dá)，從而減弱乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移能力[2-4]。因此國內(nèi)外研究者均認(rèn)為SMYD3是表觀遺傳調(diào)控和信號(hào)通路的致癌驅(qū)動(dòng)因子，靶向SMYD3的小分子抑制劑的開發(fā)是當(dāng)前的研究趨勢(shì)[15]。

SMYD3在血液腫瘤方面的研究相對(duì)實(shí)體腫瘤要少得多。文獻(xiàn)[16]分析了59例慢性淋巴細(xì)胞白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）中SMYD2和SMYD3的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)兩者在CLL患者中過表達(dá)，有殘留表達(dá)的患者呈現(xiàn)高白細(xì)胞計(jì)數(shù)和復(fù)雜的染色體核型。文獻(xiàn)[17]的研究對(duì)象為SMYD2基因，通過分析83例兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）骨髓樣本，證實(shí)了SMYD2基因在兒童ALL患者中的表達(dá)顯著高于非腫瘤對(duì)照組，并且SMYD2高表達(dá)與較差的生存率相關(guān)，化療緩解后SMYD2表達(dá)明顯下降。由此可見SMYD3對(duì)血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展的影響并不弱于實(shí)體腫瘤，在血液腫瘤領(lǐng)域研究SMYD3具有同樣重要的意義。但迄今為止SMYD3在急性髓系白血病中的研究尚未見報(bào)道。本研究在AML標(biāo)本中檢測(cè)SMYD3的表達(dá)情況，為AML研究尋找新的分子指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，非腫瘤對(duì)照組20例樣本均存在低水平的SMYD3基因表達(dá)，提示SMYD3并非腫瘤特異性基因，它作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的一員，在多種生物過程如染色質(zhì)形成、X染色體失活及轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要功能[1]。而87例初發(fā)AML樣本的SMYD3基因表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，這與眾多實(shí)體瘤和上述CLL及兒童ALL的報(bào)道一致，充分說明AML中也存在SMYD3的高表達(dá)。

在AML中，急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL），F(xiàn)AB分型M3，是一種特殊類型，絕大多數(shù)患者具有特異性染色體易位t（15;17）（q22;q12），形成PML-RARα融合基因。近三十年來，由于全反式維甲酸及砷劑的規(guī)范化臨床應(yīng)用，APL已成為基本不用進(jìn)行造血干細(xì)胞移植即可治愈的白血病[6]。國內(nèi)外診療指南均將M3單獨(dú)分析而與其他類型的AML區(qū)別開來。從成人急性髓系白血病（非急性早幼粒細(xì)胞白血?。┰\療指南可知，年齡≥60歲則是AML（非M3）的不良預(yù)后因素之一[5];急性早幼粒細(xì)胞白血病診療指南中提到M3易見于中青年，平均發(fā)病年齡為44歲，年齡并不是M3預(yù)后不良的判斷因素[6]?？梢娔挲g在AML（非M3）中是需要重點(diǎn)考慮的因素之一，而在M3中所占的比重要小得多。本研究通過將AML分為非M3組與M3組進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)M3作為一種特殊的AML類型，與AML（非M3）在SMYD3的表達(dá)水平和年齡上均存在差異：AML（非M3）比M3有更高的SMYD3表達(dá)水平和更高的年齡。

本研究結(jié)果顯示，初發(fā)AML樣本SMYD3基因中位表達(dá)水平為27.49，范圍為3.68～182.48，SMYD3基因表達(dá)的異質(zhì)性較大。因此本研究將SMYD3作為分類變量，以中位表達(dá)水平將AML樣本分為SMYD3高水平表達(dá)組和低水平表達(dá)組進(jìn)行比較，本研究將AML（含M3）和AML（非M3）均進(jìn)行了高低水平的對(duì)比，但并未發(fā)現(xiàn)SMYD3表達(dá)量與年齡、性別、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、高白細(xì)胞（≥100×109/L）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)以及FAB分型有相關(guān)性。

綜上所述，本研究證實(shí)了SMYD3在AML中高表達(dá)，或許可以作為一種新的分子靶點(diǎn)應(yīng)用于AML的診斷中。近幾年，隨著醫(yī)學(xué)檢測(cè)方法和診療水平的發(fā)展，國內(nèi)外醫(yī)學(xué)組織更多地采用遺傳學(xué)變異和基因突變等來進(jìn)行白血病的診斷、分型和危險(xiǎn)度分層，患者也可以選擇更多的檢測(cè)方法來提高診斷的準(zhǔn)確性和生存預(yù)測(cè)的精準(zhǔn)性。因此本研究將在之后的實(shí)驗(yàn)中收集更多的病例和臨床指標(biāo)來分析SMYD3與白血病之間的相關(guān)性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行患者的生存分析及作用機(jī)制研究，為白血病研究提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Hamamoto R，F(xiàn)urukawa Y，Morita M，et al.SMYD3 encodes a histone methyltransferase involved in the proliferation of cancer cells[J].Nature Cell Biology，2004，6（8）：731-740.

[2]王娟娟，張樂鳴，戴永平，等.microRNA沉默SMYD3基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞侵襲能力影響及其機(jī)制的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17（19）：1532-1536.

[3]張怡，王娟娟，郭宇，等.SET-和MYND-結(jié)構(gòu)域含有蛋白基因沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231Wnt/β-連環(huán)蛋白通路及c-Myc基因的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012，29（11）：2218.

[4]張怡，王娟娟，郭宇，等.microRNA沉默SMYD3基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞Wnt/β-Catenin通路及c-Myc基因影響的研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2013，42（6）：171-173.

[5]中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì).成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┲袊\療指南（2011年版）[J].中華血液學(xué)雜志，2011，32（11）：804-807.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)血液學(xué)分會(huì).急性早幼粒細(xì)胞白血病中國診療指南（2011年版）[J].中華血液學(xué)雜志，2011，32（12）：885-886.

[7] LI Jing，ZHAO Lifang，PAN Yunjian，et al.SMYD3 overexpression indicates poor prognosis and promotes cell proliferation， migration and invasion in non-small cell lung cancer[J].Int J Oncol，2020，57（3）：756-766.

[8] Lobo J，Rodrigues N，Antunes L，et al.High immunoexpression of Ki67，EZH2，and SMYD3 in diagnostic prostate biopsies independently predicts outcome in patients with prostate cancer[J/OL].Urol Oncol，2018，36（4）：e7-e17.

[9] Chandra P，Dixit R，Pratap A，et al.Analysis of SET and MYND Domain-Containing Protein 3（SMYD3） Expression in Gallbladder Cancer：a Pilot Study[J].Indian J Surg Oncol，2021，12（Suppl 1）：111-117.

[10] ZHU Chenglin，HUANG Qiang.Overexpression of the SMYD3 Promotes Proliferation， Migration，and Invasion of Pancreatic Cancer[J].Dig Dis Sci，2020，65（2）：489-499.

[11] JIANG Yahui，LYU Tianjiao， CHE Xiaoxia，et al.

Overexpression of SMYD3 in Ovarian Cancer is Associated with Ovarian Cancer Proliferation and Apoptosis via Methylating H3K4 and H4K20[J].J Cancer，2019，10（17）：4072-4084.

[12] LIU Mo，LIU Qingwen，F(xiàn)AN Song，et al.LncRNA LTSCCAT promotes tongue squamous cell carcinoma metastasis via targeting the miR-103a-2-5p/SMYD3/TWIST1 axis[J].Cell Death Dis，2021，12（2）：144.

[13] ZHANG Liwei，JIN Yue， YANG Hao，et al.SMYD3 promotes epithelial ovarian cancer metastasis by downregulating p53 protein stability and promoting p53 ubiquitination[J].Carcinogenesis，2019，40（12）：1492-1503.

[14] Alshiraihi I M，Jarrell D K，Arhouma Z，et al.In Silico/In Vitro Hit-to-Lead Methodology Yields SMYD3 Inhibitor That Eliminates Unrestrained Proliferation of Breast Carcinoma Cells[J].Int J Mol Sci，2020，21（24）：9549.

[15] Fabini E，Manoni E，F(xiàn)erroni C，et al.Small-molecule inhibitors of lysine methyltransferases SMYD2 and SMYD3：current trends[J].Future Med Chem，2019，11（8）：901-921.

[16] Oliveira-Santos W，Rabello D A，Lucena-Araujo A R，et al.

Residual expression of SMYD2 and SMYD3 is associated with the acquisition of complex karyotype in chronic lymphocytic leukemia[J].Tumour Biol，2016，37（7）：9473-9481.

[17] Sakamoto L H，Andrade R V，F(xiàn)elipe M S，et al.SMYD2 is highly expressed in pediatric acute lymphoblastic leukemia and constitutes a bad prognostic factor[J].Leuk Res，2014，38（4）：496-502.

（收稿日期：2021-09-09） （本文編輯：張爽）