MIF蛋白、EMT標(biāo)記蛋白在肝癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性

梁輝

【摘要】 目的：探究巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)記蛋白鈣黏附蛋白E（E-cadherin）和波形纖維蛋白（Vimentin）在肝癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。方法：選取2016年1月-2018年1月于本院就診的45例肝癌患者，收集患者肝癌組織和癌旁組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織標(biāo)本中MIF、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)，對(duì)比腫瘤組織和癌旁組織中各分子表達(dá)差異，并分析其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：肝癌組織中MIF的陽(yáng)性率為71.11%高于癌旁正常組織的33.33%，E-cadherin陽(yáng)性率為24.44%低于癌旁正常組織的62.22%，Vimentin陽(yáng)性率為64.44%高于癌旁正常組織的31.11%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌組織中MIF和Vimentin陽(yáng)性率均較高，E-cadherin陽(yáng)性率均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同性別、年齡、AFP水平和Edmondson分級(jí)肝癌患者的MIF、E-cadherin和Vimentin蛋白水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。MIF陽(yáng)性患者中位生存期為20.01個(gè)月，95%CI為（17.11，23.82）個(gè)月，MIF陰性患者中位生存期為25.50個(gè)月，95%CI為（17.87，25.50）個(gè)月，MIF表達(dá)為陰性的肝癌患者預(yù)后更好（P=0.028）。E-cadherin陽(yáng)性患者中位生存期為22.73個(gè)月，95%CI為（19.62，22.73）個(gè)月，E-cadherin陰性患者中位生存期為16.66個(gè)月，95%CI為（13.89，25.50）個(gè)月，E-cadherin表達(dá)為陽(yáng)性的肝癌患者預(yù)后更好（P=0.040）。Vimentin陽(yáng)性患者中位生存期為17.11個(gè)月，95%CI為（15.55，17.87）個(gè)月，Vimentin陰性患者中位生存期為23.88個(gè)月，95%CI為（19.62，23.88）個(gè)月，Vimentin表達(dá)為陰性的肝癌患者預(yù)后更好（P=0.032）。結(jié)論：MIF蛋白、EMT標(biāo)記蛋白與肝癌的病情進(jìn)展有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】 巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 鈣黏附蛋白E 波形纖維蛋白 肝癌

Expressions of MIF Protein and EMT Marker Proteins in Liver Cancer Tissues and Their Correlation with Clinicopathological Characteristics and Prognosis/LIANG Hui. //Medical Innovation of China， 2021， 18（29）： 00-006

[Abstract] Objective： To explore the expressions of macrophage migration inhibitory factor （MIF） and epithelial-mesenchymal transition （EMT） marker proteins E-cadherin and Vimentin in liver cancer tissues and their correlation with clinicopathological characteristics and prognosis. Method： A total of 45 patients with liver cancer admitted to our hospital from January 2016 to January 2018 were selected， and the liver cancer tissues and paracancer tissues of the patients were collected. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of MIF， E-cadherin and Vimentin in tissue specimens， and the differences of molecular expressions in tumor tissues and paracancer tissues were compared， and their relationship with clinicopathological features and prognosis were analyzed. Result： The positive rate of MIF in liver cancer tissues was 71.11%， which was higher than 33.33% in adjacent normal tissues， the positive rate of E-cadherin in liver cancer tissues was 24.44%， which was lower than 62.22% in normal adjacent tissues， the positive rate of Vimentin in liver cancer tissues was 64.44%， which was higher than 31.11% in normal adjacent tissues （P<0.05）. The positive rates of MIF and Vimentin were higher and the positive rate of E-cadherin were lower in liver cancer tissues with stage Ⅲ-Ⅳ， tumor diameter ≥5 cm， lymph node metastasis and distant metastasis， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significant differences in MIF， E-cadherin and Vimentin protein levels in patients with liver cancer with different genders， ages， AFP levels and Edmondson grade （P>0.05）. The median survival time of MIF positive patients was 20.01 months， 95%CI （17.11， 23.82） months， while MIF negative patients had a median survival of 25.50 months， 95%CI （17.87， 25.50） months. Patients with negative MIF expression had better prognosis （P=0.028）. The median survival time of E-cadherin positive patients was 22.73 months， 95%CI （19.62， 22.73） months， while E-Cadherin negative patients was 16.66 months， 95%CI （13.89， 25.50） months. Patients with positive E-cadherin expression had better prognosis （P=0.040）. The median survival time of Vimentin positive patients was 17.11 months， 95%CI （15.55， 17.87） months， while Vimentin negative patients was 23.88 months 95%CI （19.62， 23.88） months. Patients with negative Vimentin expression had better prognosis （P=0.032）. Conclusion： MIF protein and EMT marker proteins are related to the progression of liver cancer and can be used as important biomarkers to predict the prognosis of liver cancer.

[Key words] Macrophage migration inhibitory factor Epithelial-mesenchymal transition E-cadherin Vimentin Liver cancer

First-authors address： The Second Affiliated Hospital of Nanchang University， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.29.001

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤疾病之一，屬于全球第六大惡性腫瘤[1]。依據(jù)起源方式的不同，可將肝癌分為原發(fā)性和繼發(fā)性?xún)纱箢?lèi)，原發(fā)性肝癌起源于肝臟上皮細(xì)胞或間葉組織，而繼發(fā)性肝癌則是由胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移引起的[2]。肝癌的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育極為迅速，具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，惡性程度高，發(fā)病率和死亡率逐年上升[3]。早期肝癌無(wú)特異性臨床癥狀，60%～80%的患者確診時(shí)處于晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)治療時(shí)間[4]。因此，尋找診斷肝癌的生物標(biāo)志物以制定新的治療策略對(duì)肝癌患者而言意義重大。有研究發(fā)現(xiàn)，多種分子參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肝癌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，調(diào)控肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5]。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是調(diào)控機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞活動(dòng)的細(xì)胞因子，被先前的研究證實(shí)在多種慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病和惡性腫瘤疾病中異常表達(dá)，影響疾病進(jìn)展[6-7]。然而，MIF蛋白和EMT標(biāo)記基因鈣黏附蛋白E（E-cadherin）、波形纖維蛋白（Vimentin）在肝癌中的相關(guān)研究較少，目前尚不清楚其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系?；诖?，本次實(shí)驗(yàn)探究MIF、E-cadherin和Vimentin在肝癌組織中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月-2018年1月來(lái)本院就診的45例肝癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均為肝膽外科收治的需進(jìn)行手術(shù)切除患者，且術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)確診為肝細(xì)胞癌;（2）年齡≥18歲;（3）預(yù)期生存期≥3個(gè)月;（4）依從性較好，能夠配合完成術(shù)后隨訪(fǎng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤疾病;（2）術(shù)前1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)放化療或抗腫瘤免疫治療;（3）哺乳期或妊娠期婦女;（4）臨床資料不全。男32例，女13例，年齡18～69歲，平均（46.38±11.37）歲;Edmondson分級(jí)：Ⅰ、Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)29例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期27例。收集所有患者腫瘤組織和癌旁約3 cm處的正常組織，脫水后制成石蠟標(biāo)本待用。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且所有入組患者均對(duì)本次實(shí)驗(yàn)知情，同意參與本次研究并簽署同意書(shū)。

1.2 方法 取患者腫瘤組織和癌旁正常組織石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織中MIF、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)。首先將組織切片脫蠟至水，0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液微波爐加熱15 min以修復(fù)抗原，室溫下冷卻后以3%H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清室溫下封閉30 min后，加入MIF、E-cadherin和Vimentin一抗（均購(gòu)自上海艾博抗公司），4 ℃下孵育過(guò)夜，PBS洗去浮色后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗室溫下再次孵育30 min，DBA染色液染色后沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水后，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，生物顯微鏡（生產(chǎn)廠(chǎng)家：上海普赫光電科技有限公司，型號(hào)：CX43）下拍照觀(guān)察顏色情況。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) （1）免疫組化染色結(jié)果觀(guān)察：參考《免疫組化結(jié)果的圖像分析與人工計(jì)數(shù)方法的對(duì)比研究》對(duì)患者免疫組化陽(yáng)性和陰性進(jìn)行界定，具體根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞占比來(lái)進(jìn)行。染色結(jié)果中胞質(zhì)、胞核著色為棕黃色記3分，黃色記2分，淺黃色記1分，胞質(zhì)、胞核著色程度較差，無(wú)明顯染色記0分。染色結(jié)果中陽(yáng)性細(xì)胞占比>75%記3分，≥50%但≤75%記2分，≥25%但<50%記1分，<25%記0分?？傇u(píng)分=染色強(qiáng)度得分×陽(yáng)性細(xì)胞占比得分，當(dāng)總評(píng)分<3分視為陰性，≥3分視為陽(yáng)性[8]。（2）收集患者臨床病理信息，分析MIF、E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。（3）對(duì)患者進(jìn)行3年的隨訪(fǎng)，記錄其生存情況，并分析MIF、E-cadherin和Vimentin表達(dá)水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);采用Kaplan-Meier分析患者預(yù)后情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MIF和EMT標(biāo)記物在肝癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá) 肝癌組織中MIF的陽(yáng)性率為71.11%高于癌旁正常組織的33.33%，E-cadherin陽(yáng)性率為24.44%低于癌旁正常組織的62.22%，Vimentin陽(yáng)性率為64.44%高于癌旁正常組織的31.11%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 MIF和EMT標(biāo)記物與臨床病理特征的關(guān)系 腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌組織中MIF和Vimentin陽(yáng)性率均較高，E-cadherin陽(yáng)性率均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同性別、年齡、AFP水平和Edmondson分級(jí)肝癌患者的MIF、E-cadherin和Vimentin陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 MIF表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 MIF陽(yáng)性患者中位生存期為20.01個(gè)月，95%CI為（17.11，23.82）個(gè)月，MIF陰性患者中位生存期為25.50個(gè)月，95%CI為（17.87，25.50）個(gè)月，MIF表達(dá)為陰性的肝癌患者預(yù)后更好（P=0.028）。見(jiàn)圖1。

2.4 E-cadherin表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 E-cadherin陽(yáng)性患者中位生存期為22.73個(gè)月，95%CI（19.62，22.73）個(gè)月，E-cadherin陰性患者中位生存期為16.66個(gè)月，95%CI（13.89，25.50）個(gè)月，E-cadherin表達(dá)為陽(yáng)性的肝癌患者預(yù)后更好（P=0.040）。見(jiàn)圖2。

2.5 Vimentin表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Vimentin陽(yáng)性患者中位生存期為17.11個(gè)月，95%CI為（15.55，17.87）個(gè)月，Vimentin陰性患者中位生存期為23.88個(gè)月，95%CI為（19.62，23.88）個(gè)月，Vimentin表達(dá)為陰性的肝癌患者預(yù)后更好（P=0.032）。見(jiàn)圖3。

3 討論

肝癌是現(xiàn)階段發(fā)病率、致死率和惡性程度極高的惡性腫瘤之一，臨床表現(xiàn)為包膜侵犯、血管浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除、經(jīng)皮穿刺肝動(dòng)脈栓塞化療等是治療肝癌的常用方案，但因肝癌具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性特點(diǎn)，治療效果不理想[9-11]。因此，探究肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的相關(guān)機(jī)制，尋找新的分子標(biāo)志物，揭示其與臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，對(duì)于延長(zhǎng)肝癌患者的生命周期而言意義重大。

既往研究表明，癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的EMT有關(guān)，EMT標(biāo)記蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等分子的改變，導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去黏附能力，由上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，并獲得細(xì)胞遷移和侵襲的能力，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[12]。T細(xì)胞分泌的多效趨化因子MIF是EMT的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，并與膿毒癥、骨關(guān)節(jié)炎、急性胰腺炎等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[13]。Cho等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MIF同樣可參與介導(dǎo)乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤的疾病進(jìn)展，影響患者預(yù)后。本次研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中MIF的陽(yáng)性率為71.11%高于癌旁正常組織的33.33%，E-cadherin陽(yáng)性率為24.44%低于癌旁正常組織的62.22%，Vimentin陽(yáng)性率為64.44%高于癌旁正常組織的31.11%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌組織中MIF和Vimentin陽(yáng)性率均較高，E-cadherin陽(yáng)性率均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。不同性別、年齡、AFP水平和Edmondson分級(jí)肝癌患者的MIF、E-cadherin和Vimentin表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明，MIF和Vimentin表達(dá)的增加和E-cadherin表達(dá)的減少與肝癌患者腫瘤血管侵襲、浸潤(rùn)、新生血管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，推測(cè)原因，可能與MIF蛋白對(duì)EMT的調(diào)控作用有關(guān)。文獻(xiàn)[15-17]研究指出，MIF可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤新生血管生成，上調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，激活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路的Wnt通路，影響腫瘤細(xì)胞黏附、分化、細(xì)胞骨架重塑以及外基質(zhì)降解，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，MIF和Vimentin陽(yáng)性率越高，E-cadherin陽(yáng)性率越低，肝癌惡性程度越高，遷移侵襲能力越強(qiáng)。

此外，本次研究結(jié)果還顯示，MIF、E-cadherin和Vimentin的表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)，MIF和Vimentin陽(yáng)性率越高，E-cadherin陽(yáng)性率越低，肝癌患者的總生存期越短，預(yù)后越差。也這與QIN等[18]研究結(jié)果相符。腫瘤惡性程度越高，侵襲性越強(qiáng)，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的概率越大，手術(shù)治療無(wú)法完全切除病灶，且極易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命周期[17，19]。MIF和Vimentin高表達(dá)和E-cadherin低表達(dá)與肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力和腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，不利于患者預(yù)后。

綜上所述，MIF蛋白、EMT標(biāo)記蛋白Vimentin在肝癌組織中高表達(dá)，E-cadherin在肝癌組織中低表達(dá)，MIF、Vimentin表達(dá)上調(diào)和E-cadherin表達(dá)下調(diào)與患者腫瘤TNM分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，并影響患者的疾病進(jìn)展，提示MIF蛋白和EMT標(biāo)記蛋白可作為預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。

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（收稿日期：2021-09-03） （本文編輯：張明瀾）