基于拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬的黃嘌呤氧化酶抑制劑解離途徑的理論研究

齊人睿，李明昊，常 浩，付學(xué)奇，高 波，韓葳葳，韓 璐，李婉南

（1.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生命科學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春130012；2.吉林省特醫(yī)食品生物科技有限公司,長(zhǎng)春130052）

痛風(fēng)的臨床癥狀有高尿酸血癥、腎尿酸結(jié)石、慢性腎炎以及關(guān)節(jié)畸形和慢性關(guān)節(jié)炎，給患者造成極大的痛苦［1，2］.痛風(fēng)是由嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致尿酸沉積在組織中而引發(fā)的慢性疾?。?］.嘌呤代謝過(guò)程中產(chǎn)生的黃嘌呤和次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶（XO）的氧化作用下生成尿酸，是導(dǎo)致尿酸在體內(nèi)堆積的主要原因之一.目前，黃嘌呤氧化酶的抑制劑是用于治療痛風(fēng)及高尿酸血癥的主要藥物，因此黃嘌呤氧化酶與抑制劑的相互作用是一個(gè)研究熱點(diǎn).

XO是一種復(fù)合型的核黃素蛋白，由兩個(gè)完全重復(fù)對(duì)稱的結(jié)構(gòu)單元組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)單元由3條異源的肽鏈組成［圖1（A）］，其催化中心包括一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）、兩個(gè)鐵-硫中心（Iron-sulfur centers，F(xiàn)e/S I，II）以及一個(gè)鉬蝶呤中心（Molybdopterin，Mo-pt）.圖1（B）給出了黃素腺嘌呤二核苷酸（C27H33N9O15P2，F(xiàn)AD）、MTE（Phosphonic acidmono ester，C10H14N5O6PS2）、鳥嘌呤（Guanine，C5H5N5O）、MOS（Dioxothiomolybdenum ion，HMoO2S）和鐵硫簇（Fe2S2cluster，F(xiàn)ES）5種小分子配體的三維（3D）結(jié)構(gòu)，其中鳥嘌呤，MOS及MTE結(jié)合在由氨基酸殘基Phe767，Phe798，Gly800，Glu802，Gly876，Arg880，Ala910，Phe911，Phe914，Thr1077，Ala1078，Ala1079，Ser1080，Val1081及Ser1082組成的鉬蝶呤中心口袋［圖1（C）］，F(xiàn)ES結(jié)合在由氨基酸殘基Lys40，Leu41，Gly42，Cys43，Gly44，Gly46，Ala50，Cys51，Asn71，Cys73，Ser111，Gln112，Cys113，Phe115，Cys116，Cys143，Cys148，Cys150及Thr151組成的鐵-硫中心口袋［圖1（D）］，F(xiàn)AD結(jié)合在由殘基Asn251，Lys256，Leu257，Val258，Val259，Gly260，Asn261，Thr262，Val342，Ser347，Asp360，Leu398，Glu402，Ile403，Leu404及Arg426組成的黃素腺嘌呤二核苷酸中心口袋［圖1（E）］.而鉬蝶呤中心是黃嘌呤氧化酶催化底物產(chǎn)生尿酸的關(guān)鍵位點(diǎn)［4，5］，在黃嘌呤的氧化過(guò)程中，Mo（Ⅵ）被還原為Mo（Ⅳ），產(chǎn)生的電子經(jīng)由FAD和Fe/S傳遞給氧分子，與氫離子結(jié)合形成過(guò)氧化氫，Mo（Ⅳ）則再氧化為Mo（Ⅵ）［6］.

Fig.1 Overview of xanthine oxidase(XO,PDB ID:3NVW)

別嘌呤醇（Allopurinol）的結(jié)構(gòu)與黃嘌呤相似，可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制黃嘌呤氧化酶［7］，使黃嘌呤氧化酶不能催化次黃嘌呤和黃嘌呤生成尿酸，從而降低了尿酸在體內(nèi)的沉積，是治療高尿酸血癥的主要藥物，但其具有惡心、頭痛、白細(xì)胞減少或增多等一系列副作用［8～10］.有研究表明，屬于異黃酮類化合物的葛根素（Puerarin）對(duì)黃嘌呤氧化酶表現(xiàn)出較好的抑制效果，屬于溫和性的競(jìng)爭(zhēng)型黃嘌呤氧化酶抑制劑，能夠明顯降低高尿酸血癥患者血清中的尿酸水平［11～13］，有望被開(kāi)發(fā)為新的治療痛風(fēng)的藥物，但是關(guān)于抑制劑與黃嘌呤氧化酶解離途徑之間的相互作用卻鮮有報(bào)道.本文通過(guò)對(duì)XO/allopurinol和XO/puerarin 2種復(fù)合物進(jìn)行拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬，從計(jì)算生物學(xué)的角度解釋黃嘌呤氧化酶與抑制劑的結(jié)合方式，以及抑制劑從黃嘌呤氧化酶上解離的過(guò)程.

1 計(jì)算模擬方法

1.1 模擬體系準(zhǔn)備

蛋白質(zhì)的初始結(jié)構(gòu)為XO（PDB ID：3NVW）［14］.從Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)中下載Allopurinol和Puerarin的幾何結(jié)構(gòu)，底物初始結(jié)構(gòu)采用Gaussian 09軟件包，在B3LYP 6-31+G*基組水平上進(jìn)行優(yōu)化［15］.優(yōu)化后結(jié)構(gòu)的分子軌道使用Multiwfn程序［16］顯示.采用AutoDock Vina［17，18］對(duì)接構(gòu)建XO/allopurinol和XO/puerarin 2種復(fù)合物的結(jié)構(gòu).

1.2 XO蛋白通道預(yù)測(cè)

采用CAVER 3.0軟件，分別對(duì)2種復(fù)合物的10 ns常規(guī)分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡產(chǎn)生的1000個(gè)快照進(jìn)行配體解離通道的預(yù)測(cè)［19］.設(shè)置每個(gè)構(gòu)象中識(shí)別出的通道瓶頸半徑（Bottleneck radiu）≥0.12 nm，聚類閾值（Clustering_threshold）為7.5.由于在同一構(gòu)象中可能會(huì)識(shí)別出多條幾乎同軸線的通道，為了去除多余通道，則保留每個(gè)構(gòu)象中能量最低通道（One_tunnel_in_snapshot cheapest）.

1.3 拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬

依據(jù)CAVER 3.0得到的結(jié)果，確定配體解離通道及其拉伸方向，蛋白采用GROMACS軟件中AMBER99SB-ILDN力場(chǎng)，小分子力場(chǎng)參數(shù)由GAFF程序生成，進(jìn)而實(shí)施拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬［20，21］.在進(jìn)行拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬之前，將分子對(duì)接得到的2個(gè)復(fù)合物分別放入到兩個(gè)周期性邊界為1 nm的立方體盒子中，盒子中除蛋白外的位置采用TIP3P［22］水模型填充，其中在含有別嘌呤醇的體系中添加57349個(gè)水分子，在含葛根素的體系中添加57340個(gè)水分子.為了保證電荷的平衡，向2個(gè)模擬體系中均添加5個(gè)Cl-.在進(jìn)行拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬時(shí)，首先使用最陡下降法對(duì)模擬體系進(jìn)行50000步的能量最小化，然后再進(jìn)行100 ps的恒溫恒容（NVT）模擬和100 ps的恒溫恒壓（NPT）模擬.在進(jìn)行NVT模擬時(shí)，2個(gè)體系均采用LINCS算法［23］約束所有共價(jià)鍵的振動(dòng).采用Berendsen算法［24］控溫，將體系的溫度保持在300 K，溫度耦合常數(shù)為0.1 ps.采用SETTLE算法限制水分子的幾何構(gòu)象，范德華相互作用的雙程截?cái)喟霃皆O(shè)為1.0和1.2 nm，長(zhǎng)程靜電相互作用使用Particle mesh Ewald（PME）［25］方法處理.在進(jìn)行NPT模擬時(shí)，采用Berendsen算法［24］控壓，壓力耦合的時(shí)間常數(shù)設(shè)為2.0 ps，壓力耦合的參考?jí)毫υO(shè)為1×105Pa，原子的各種參數(shù)限制及溫度設(shè)置均與NVT模擬相同，NPT模擬之后體系的密度達(dá)到最優(yōu)狀態(tài).限制之后對(duì)2個(gè)體系進(jìn)行步長(zhǎng)為1 fs、牽引力常數(shù)為1000 kJ·mol-1·nm-2、時(shí)長(zhǎng)為4000 ps的恒速拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬（0.001 nm/ps）.

1.4 平均力勢(shì)計(jì)算

為了研究別嘌呤醇、葛根素與黃嘌呤氧化酶之間的結(jié)合能，需要計(jì)算一系列傘形采樣模擬的平均力勢(shì)（PMF）［26，27］.使用傘形偏離勢(shì)將黃嘌呤氧化酶的質(zhì)心限制在窗口中，以質(zhì)心與抑制劑之間的距離作為反應(yīng)坐標(biāo)，沿反應(yīng)軸，每隔約0.1～0.2 nm設(shè)置一個(gè)傘形采樣窗口，其中XO/allopurinol體系取9個(gè)窗口，XO/puerarin體系取7個(gè)窗口，每個(gè)窗口獨(dú)立模擬，首先進(jìn)行100 ps的NPT模擬，再進(jìn)行10 ns的采樣，最終通過(guò)使用GROMACS軟件的gmx wham工具獲得PMF曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 抑制劑結(jié)構(gòu)的優(yōu)化及與黃嘌呤氧化酶的相互作用

為了得到模擬復(fù)合物中合理的抑制劑結(jié)構(gòu)，對(duì)別嘌呤醇和葛根素2種抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，研究了它們的化學(xué)性質(zhì).最高占據(jù)分子軌道（HOMO）與最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）之間的能量差稱為HOMO-LUMO gap，可用于預(yù)測(cè)電子轉(zhuǎn)移的強(qiáng)度和穩(wěn)定性.其中別嘌呤醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其LUMO軌道分別見(jiàn)圖2（A）和（B）；葛根素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其LUMO軌道分別見(jiàn)圖2（C）和（D）.2種抑制劑LUMO軌道能量貢獻(xiàn)主要位于2個(gè)芳香環(huán)上，結(jié)構(gòu)與黃嘌呤相似，這可能是2種化合物能競(jìng)爭(zhēng)性抑制XO的原因.

Fig.2 Chemical structures(A,C)and population analysis of LUMO orbits(B,D)for Allopurinol(A,B)and Puerarin(C,D)

采用AutoDock Vina軟件，將別嘌呤醇和葛根素分別對(duì)接到黃嘌呤氧化酶中.對(duì)接結(jié)果顯示，XO的Glu802，Leu873，Arg880，Phe914，Phe1009，Thr1010，Val1011，Ala1078，Ala1079及Glu1261氨基酸殘基將別嘌呤醇包裹在中心［圖3（A）］，XO的Leu648，Phe649，Lys771，Glu802，Leu873，His875，Ser876，Arg880，Ser1008，Phe1009，Thr1010，Val1011，Phe1013，Leu1014，Pro1076及Ala1078等氨基酸殘基將葛根素包裹在中心［圖3（B）］.其結(jié)果與圖1（C）中鳥嘌呤的結(jié)合位置極其相似，由此可見(jiàn)，兩者均成功地對(duì)接到了XO的MO-pt中心.此外，別嘌呤醇和葛根素與活性中心氨基酸形成的氫鍵可以幫助其更好地結(jié)合在XO的鉬蝶呤中心.

Fig.3 Allopurinol(A)and Puerarin(B)docking to MO-pt pocket of XO

丙氨酸掃描是指將活性中心的氨基酸突變成丙氨酸，用以分析單個(gè)氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的影響.XO的丙氨酸掃描的結(jié)果顯示，來(lái)自于MO-pt中心的Val789，Arg880，Phe911，Phe914和Val1081突變成丙氨酸之后，XO與別嘌呤醇之間的結(jié)合自由能分別下降了-11.13，-9.67，-16.50，-13.45和-7.60 kJ/mol［圖4（A）］，與葛根素的結(jié)合自由能分別下降了-11.97，-10.50，-14.41，-15.12和-8.44 kJ/mol［圖4（D）］，這種結(jié)合自由能下降較為明顯的結(jié)果說(shuō)明以上氨基酸在XO與抑制劑的結(jié)合中起到非常重要的作用.此外，來(lái)自于Fe/S結(jié)合中心［圖4（B）和（E）］和FAD結(jié)合中心［圖4（C）和（F）］氨基酸的突變也能在一定程度上影響XO與抑制劑的結(jié)合.

Fig.4 Computational scanning of the binding site residues in the XO/allopurinol(A―C)and XO/puearin(D―F)complexes

2.2 XO蛋白通道的分析

在進(jìn)行拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬之前，利用CAVER 3.0軟件預(yù)測(cè)抑制劑從XO蛋白上離去的通道，圖5顯示了通道的形狀及其在XO中的相對(duì)位置.抑制劑從XO的離去通道位于MO-pt中心，主要由Leu648，Phe649，Lys771，Ser876，Val1011和Phe1013組成，這些氨基酸在空間結(jié)構(gòu)上形成一個(gè)較為規(guī)則的近似圓形的通道，且XO通道的形狀也較為規(guī)則.蛋白通道的瓶頸半徑（Bottleneck radius）、長(zhǎng)度（Length）和彎曲率（Curvature）是用于定性分析蛋白質(zhì)通道的指標(biāo)，瓶頸半徑越大，表示蛋白通道的空間維度越大；長(zhǎng)度越短，表示配體從蛋白上解離需要經(jīng)過(guò)的路程越短；彎曲率越小，則配體從蛋白解離的通道形狀越平坦.

Fig.5 CAVER 3.0 analysis of the shape and size of tunnel for XO

依據(jù)XO/allopurinol復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡，得到XO蛋白離去通道的平均瓶頸半徑（Average bottleneck radius）、平均長(zhǎng)度（Average length）和平均彎曲率（Average curvature）分別為0.26，1.24和0.12 nm；依據(jù)XO/puerarin復(fù)合物的分子動(dòng)力學(xué)模擬軌跡，得到XO蛋白離去通道的平均瓶頸半徑、平均長(zhǎng)度和平均彎曲率分別為0.25，0.58和0.12 nm.由此可見(jiàn)，抑制劑從XO蛋白上解離時(shí)會(huì)經(jīng)過(guò)一個(gè)相對(duì)較為順暢的通道，接下來(lái)的拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬即基于這條通道進(jìn)行.從計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，兩個(gè)蛋白通路的瓶頸半徑和彎曲率相差無(wú)幾，而通路的長(zhǎng)度相差較大，這可能導(dǎo)致相比于葛根素，別嘌呤醇更不易從XO蛋白中解離.

2.3 別嘌呤醇和葛根素從XO蛋白上解離的過(guò)程

為了研究別嘌呤醇和葛根素從XO蛋白上解離的過(guò)程，分別對(duì)XO/allopurinol和XO/puerarin進(jìn)行了6次時(shí)長(zhǎng)為4000 ps的拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬，表1顯示了抑制劑從XO解離所需要的拉力和時(shí)間，發(fā)現(xiàn)別嘌呤醇從XO中解離所需要的拉力值明顯高于葛根素.同樣的，別嘌呤醇從XO中解離所需要的時(shí)間也明顯高于葛根素.這說(shuō)明相比葛根素，別嘌呤醇在解離過(guò)程中受到的阻礙更大，更不容易從XO中解離，即XO與別嘌呤醇之間的結(jié)合更加緊密，也可能是別嘌呤醇對(duì)XO具有較強(qiáng)抑制效果的原因.

Table 1 Time and largest applied force of ligand dissociating from XO during the SMD simulations

Fig.6 Steered molecular dynamics(SMD)simulation of typical force profiles of allopurinol and purearin pulled out of the MO-pt pocket of XO along the unbinding pathway

圖6 給出了別嘌呤醇在解離過(guò)程中所需外力隨模擬時(shí)間的變化.為驗(yàn)證該曲線具有代表性，共進(jìn)行了6次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖S1（A）（見(jiàn)本文支持信息）.在0～700 ps時(shí)間內(nèi)，別嘌呤醇所受的外力沿直線上升至700.54 pN.外力達(dá)到最大值之后逐漸下降，直至920 ps時(shí)，外力出現(xiàn)小幅度的上升.在2526 ps時(shí)到達(dá)平衡，所受外力在0 pN處波動(dòng)，說(shuō)明此時(shí)別嘌呤醇已經(jīng)成功從XO上解離.圖6還給出了葛根素在解離過(guò)程中所需外力隨模擬時(shí)間的變化.為驗(yàn)證該曲線具有代表性，同樣進(jìn)行了6次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖S1（B）.在0～425 ps時(shí)間內(nèi)，葛根素所受的外力沿直線上升到428 pN.外力達(dá)到最大值之后逐漸下降，直至706 ps時(shí)，所受外力產(chǎn)生小幅度的上升.在1089 ps時(shí)達(dá)到平衡，所受外力在0 pN處波動(dòng)，說(shuō)明此時(shí)葛根素已經(jīng)成功從XO上解離.

為了分析在拉伸過(guò)程中別嘌呤醇與XO成鍵即相互作用的變化，選取了700和920 ps時(shí)的構(gòu)象進(jìn)行分析.在700 ps時(shí)，外力達(dá)到峰值，別嘌呤醇與Arg880和Thr1010之間存在氫鍵作用；與Ala1079之間存在碳?xì)滏I作用和疏水作用；與S原子產(chǎn)生的π-Sulfur作用對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定起重要作用；與Ser1008，Phe1009，Val1011，Leu1014和Glu1261之間存在范德華作用［圖7（A）］.在920 ps時(shí)，別嘌呤醇與Phe649和Ser876之間存在范德華作用；與His875之間新產(chǎn)生的π-π堆積類型的疏水作用，可能是導(dǎo)致外力上升的原因［圖7（B）］.外力到達(dá)峰值后，隨著模擬時(shí)間的延長(zhǎng)，XO與別嘌呤醇形成的非鍵相互作用減少，所受外力減小，說(shuō)明非鍵相互作用是阻礙別嘌呤醇從XO上解離的主要因素.因此這些殘基在拉伸過(guò)程中對(duì)維持XO與別嘌呤醇之間的相對(duì)穩(wěn)定起到重要作用.

Fig.7 Non-bond interactions between ligands and residues

為了分析在拉伸過(guò)程中葛根素與XO成鍵即相互作用的變化，分別選取了425和706 ps時(shí)的構(gòu)象進(jìn)行分析.在425 ps時(shí)，外力達(dá)到峰值，葛根素與Ser876和Ala1079之間存在氫鍵作用；與Leu648，Leu873，Phe914，Phe1009，Val1011，Leu1014和Ala1078之間存在疏水作用，其中與Leu648之間的π-σ相互作用是氫與sp2雜化原子組成平面環(huán)之間的弱相互作用；與Phe649，Lys771，His875，Arg880，Ala910，Thr1010，Phe1013和Pro1076之間存在范德華作用［圖7（C）］.在706 ps時(shí)，葛根素與Leu648，Phe649，Phe1013和Leu1014之間存在范德華作用；與Val1011之間依舊存在疏水作用，與His875之間新產(chǎn)生的碳?xì)滏I即一種弱的氫鍵作用，可能是導(dǎo)致外力小幅度上升的原因［圖7（D）］.外力到達(dá)峰值后，隨著模擬時(shí)間的延長(zhǎng)，XO與葛根素之間的非鍵相互作用減少，所受外力減小，顯然，這些殘基也在拉伸過(guò)程中對(duì)維持XO與葛根素之間的相對(duì)穩(wěn)定也起到重要作用.

通過(guò)分析別嘌呤醇、葛根素從XO解離路徑離去過(guò)程中所受外力隨時(shí)間變化的曲線可見(jiàn)，相比于葛根素，別嘌呤醇需更大的外力與更長(zhǎng)的時(shí)間才能從XO中解離，這可能是由別嘌呤醇與XO的活性中心殘基存在更強(qiáng)的相互作用所致；從圖7（A）與（C）可見(jiàn)，拉力最大時(shí)，Phe1009，Arg880，Ala1079，Val1011和Thr1010均對(duì)2種復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起到重要作用.隨著模擬時(shí)間增加，由圖7（B）與（D）可見(jiàn)，His875在兩者從XO的解離過(guò)程中均起到阻礙作用，由于別嘌呤醇與His875之間新產(chǎn)生的π-π堆積類型的疏水作用要強(qiáng)于葛根素與His875之間產(chǎn)生的碳?xì)滏I（即一種弱的氫鍵）作用，所以，與葛根素相比，別嘌呤醇更不易從XO中離去.

拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬和CAVER的分析結(jié)果表明，Phe649和Phe1013在抑制劑離去以及組成通道的過(guò)程中起到非常重要的作用.由圖8（A）可見(jiàn)，Phe649與Phe1013位于XO通道的兩邊，猶如兩扇門控制著通道的大小.因此，分析了Phe649與Phe1013苯環(huán)之間的距離在6次拉伸模擬過(guò)程中隨時(shí)間的變化.由圖8（B）和（C）可見(jiàn)，在別嘌呤醇存在時(shí)，Phe649與Phe1013苯環(huán)之間的距離收斂為1.25 nm，小于葛根素存在時(shí)的1.30 nm［圖8（C）］.雖然圖8（C）中藍(lán)色和粉色曲線分別在2000和3000 ps開(kāi)始從1.30 nm處下降，但此時(shí)葛根素已從XO中離去（見(jiàn)表1），所以可忽略不計(jì).這種距離上差異也說(shuō)明別嘌呤醇在解離時(shí)遇到的阻礙比較大，不容易從XO蛋白中解離.

2.4 抑制劑解離過(guò)程中PMF計(jì)算

為了進(jìn)一步了解別嘌呤醇、葛根素與黃嘌呤氧化酶解離途徑之間的相互作用，通過(guò)計(jì)算PMF，得到了抑制劑與黃嘌呤氧化酶之間的結(jié)合能.圖9（A）和（B）分別為別嘌呤醇與葛根素從黃嘌呤氧化酶中解離過(guò)程的PMF曲線.起初能量值迅速增加，這是由抑制劑與活性位點(diǎn)殘基之間相互作用導(dǎo)致的，說(shuō)明2個(gè)抑制劑初始位置與XO的結(jié)合狀態(tài)非常穩(wěn)定，且相比于葛根素，別嘌呤醇與XO結(jié)合更穩(wěn)定.從計(jì)算結(jié)果分析，別嘌呤醇從XO中解離的能壘為41.46 kJ/mol，葛根素從XO中解離的能壘為21.70 kJ/mol，說(shuō)明別嘌呤醇與XO結(jié)合更加緊密，這也是別嘌呤醇對(duì)XO具有更強(qiáng)抑制效果的原因.

Fig.9 PMF profile along the unbinding pathway of XO/allopurinol(A)and XO/puerarin(B)

綜上所述，通過(guò)對(duì)XO/allopurinol與XO/puerarin 2個(gè)復(fù)合物的拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬和PMF的計(jì)算，從蛋白質(zhì)構(gòu)象和能量差異兩個(gè)角度研究了抑制劑別嘌呤醇和葛根素分別從XO蛋白上解離的過(guò)程.通過(guò)分子對(duì)接結(jié)果顯示，兩者均處于XO的活性中心位置；丙氨酸掃描的結(jié)果顯示，Val789，Arg880，Phe911，Phe914和Val1081在XO與別嘌呤醇和葛根素的結(jié)合中均起到非常重要的作用；拉伸分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果顯示，隨著模擬時(shí)間的增加，所受外力值的變化趨勢(shì)基本一致，且發(fā)現(xiàn)在拉伸過(guò)程中Arg880，Phe1009，Thr1010，Val1011和Ala1079對(duì)維持兩種復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定均起到重要作用，Phe649與Phe1013在其解離的過(guò)程中起到門控的作用，His875對(duì)2個(gè)抑制劑均起到阻礙解離的作用，但相比于葛根素，別嘌呤醇則需更大的外力和更長(zhǎng)的時(shí)間才能從XO的MO-pt中心解離.研究結(jié)果闡釋了別嘌呤醇、葛根素與黃嘌呤氧化酶解離途徑之間有著非常相似的相互作用，在解離過(guò)程中，兩者均受到許多相同殘基的阻礙作用，但發(fā)現(xiàn)這些殘基對(duì)別嘌呤醇的阻礙作用更大，這也體現(xiàn)了葛根素會(huì)較易從XO中解離，該結(jié)果也為研究抑制劑與XO的相互作用提供了一定的理論指導(dǎo).

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