乳腺癌細胞來源的外泌體對乳腺癌BT549細胞增殖、侵襲和遷移的影響

王軍 鄭文祥 周娜 高帥2 侯琳

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，山東 青島 266021； 2 青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院心臟中心)

乳腺癌是最常見的惡性實體腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率排在了第1位，在女性的惡性腫瘤中占比約為20%，是女性的主要死亡原因之一[1-2]。由于乳腺癌早期篩查工作的普及，可以做到早期發(fā)現(xiàn)確診[3-4]，乳腺癌早期經(jīng)手術(shù)、放療、化療以后可取得較好的預(yù)后，但晚期乳腺癌的預(yù)后仍不理想，患者總體生存率僅為26%[5-6]。而且乳腺癌易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，嚴重影響了患者的生存時間和質(zhì)量[7]。外泌體是細胞分泌的由核酸(如ncRNA、DNA)及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等組成的具有磷脂雙分子層的橢圓形外囊泡分子，直徑40～100 nm，廣泛存在于血液、尿液、羊水、腹水等體液中[8-10]。外泌體作為一種重要的介體，常被稱為癌癥調(diào)節(jié)劑，對肝癌、肺癌等腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移、血管生成以及腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建發(fā)揮重要作用[11-12]。目前國內(nèi)外關(guān)于腫瘤細胞自身所分泌的外

泌體與腫瘤的相關(guān)性研究并不多，本研究就乳腺癌BT549細胞自身分泌的外泌體對乳腺癌細胞的細胞功能學(xué)的影響進行研究，探討自身分泌的外泌體對細胞自身的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。 現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人乳腺癌BT549細胞系購自中國科學(xué)院上海生物研究所細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液、胎牛血清購自美國HyClone公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海漢恒生物科技有限公司；牛血清白蛋白 (BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；TSG101抗體、CD63抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細胞的培養(yǎng)

乳腺癌BT549細胞在含體積分數(shù)0.10胎牛血清(FBS)、10×107U/L青霉素與10 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度達 90%以上時, 用胰蛋白酶消化液消化，收集細胞制成單細胞懸液，細胞計數(shù)，將細胞傳代于6孔板中。

1.3 外泌體的提取

使用超速離心法對BT549細胞培養(yǎng)上清液進行外泌體的提取和純化。當乳腺癌BT549細胞密度達50%左右時，更換培養(yǎng)基為含體積分數(shù)0.10 FBS的不含外泌體DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，收集細胞培養(yǎng)上清液；4 ℃下依次以1 000 r/min離心10 min，5 000 r/min離心10 min，10 000 r/min離心30 min，每次離心后分別收集上清液以后再進行下一次的離心操作，最后以100 000 r/min離心90 min后棄掉上清液，收集沉淀物，以PBS緩沖液重懸后，再以100 000 r/min離心90 min，然后收集沉淀物，獲得外泌體。用100 μL PBS緩沖液重懸外泌體，如立即使用保存于4 ℃冰箱，長期使用保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.4 外泌體的形態(tài)觀察

取上述提取的外泌體溶液10 μL，滴于銅網(wǎng)支持膜上，室溫靜置 2 min，用濾紙吸干多余液體；將質(zhì)量分數(shù)為0.02的磷鎢酸溶液10 μL滴加在銅網(wǎng)上，室溫負染 2 min， 濾紙吸干多余液體；白熾燈下晾干15 min，于80～120 kV工作電壓下，以透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)及大小，拍照保存。

1.5 蛋白免疫印記(Western-blot)實驗檢測外泌體標志蛋白

嚴格參照蛋白質(zhì)微量提取試劑盒說明書的步驟操作，從提取的外泌體中提取總蛋白，采用 BCA法測定蛋白濃度。將提取的蛋白加入含體積分數(shù)0.25的十二烷基硫酸鈉的緩沖溶液中，沸水浴5 min，冷卻后離心，取定量蛋白進行SDS蛋白電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉15 min，一抗室溫孵育2.5 h后，TBST溶液洗膜，二抗室溫孵育1.5 h，TBST溶液洗膜，ECL顯影液顯影，拍照并保存。

1.6 CCK-8法檢測外泌體對BT549細胞增殖影響

乳腺癌BT549細胞生長密度達85%～90%且處于對數(shù)生長期時，以胰蛋白酶進行消化，吹打細胞成單細胞懸液，計數(shù)細胞后接種于96孔板中，每孔接種2 000個細胞，設(shè)置5個復(fù)孔。實驗分為對照組(僅含有乳腺癌BT549細胞，不含有外泌體的培養(yǎng)基)、實驗組(含乳腺癌BT549細胞及其外泌體的培養(yǎng)基)，分別在共培養(yǎng)0、12、24、36、48 h后，按照CCK8試劑盒的說明書步驟每孔加入10 μL CCK-8溶液，于CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2.5 h后，以酶標儀測量各孔在450 nm波長處的吸光度值。

1.7 細胞劃痕實驗檢測外泌體對BT549細胞遷移的影響

使用細胞劃痕實驗檢測外泌體對BT549細胞遷移的影響。取細胞生長密度達到85%～90%時的BT549細胞，胰蛋白酶消化細胞，吹打細胞制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后接種于6孔板之中，每孔約50 000個細胞。當細胞生長密度達到95%時,用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，用槍頭垂直于6孔板標線畫線，用PBS緩沖液沖洗2次，實驗組加入無血清且含有外泌體培養(yǎng)基，對照組加入無血清且不含有外泌體的培養(yǎng)基，分別于BT549細胞培養(yǎng)0、24 h時，用倒置顯微鏡觀察并拍照，用Image J軟件測量愈合面積并計算細胞遷移率。細胞遷移率=(0 h劃痕面積-24 h培養(yǎng)后劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.8 Transwell實驗檢測外泌體對BT549細胞侵襲的影響

取細胞生長密度達到85%～90%時BT549細胞，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，胰蛋白酶消化細胞，吹打細胞制成單細胞懸液。細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度為200×106個/L，將200 μL細胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室加入600 μL體積分數(shù)0.30血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24 h。甲醇固定10 min后,以質(zhì)量分數(shù)0.01的結(jié)晶紫染色液染色20 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照，用Image J軟件計算穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 外泌體形態(tài)觀察以及外泌體標志蛋白的檢測結(jié)果

透射電子顯微鏡下觀察可見外泌體形狀為經(jīng)典的橢圓形，直徑40～100 nm，外包被一層磷脂雙分子膜(圖1A)。Western-blot實驗檢測結(jié)果顯示，在提取的外泌體中檢測到其標志性的蛋白TSG101、CD63蛋白(圖1B)。

2.2 外泌體對BT549細胞增殖、遷移及侵襲的影響結(jié)果

將BT549細胞自身分泌的外泌體與BT549細胞共培養(yǎng)0、12、24、36、48 h，觀察兩組細胞增殖情況，重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示,時間、組別、時間與組別對乳腺癌細胞BT549增殖能力均有明顯影響(F時間=970.316,F組別=117.178,F時間*組別=28.318，P<0.001)。單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示,與0 h相比,兩組細胞的增殖能力明顯增強(F=592.84、1 126.15，P<0.001)；與對照組相比,共培養(yǎng)24、36、48 h時實驗組的細胞增殖能力明顯高于對照組細胞(F=12.99～50.95，P<0.001)。見表1。

A:透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)和大小，B:外泌體標志蛋白

表1 外泌體對BT549細胞增殖能力的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果示，對照組和實驗組的細胞遷移率分別為0.55±0.02和0.79±0.02，兩組比較差異有顯著性(t=8.93,P<0.01)。見圖2。

A:對照組BT549細胞遷移情況，B:實驗組BT549細胞遷移情況

Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組和實驗組透過基質(zhì)膠的細胞個數(shù)分別為21.33±1.45和12.33±1.20，兩組比較具有顯著差異(t=4.73,P<0.01)。見圖3。

A:對照組BT549 細胞侵襲情況，B:實驗組BT549 細胞侵襲情況

3 討 論

外泌體為一個納米級的囊泡，在細胞之間、細胞與微環(huán)境之間的物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的橋梁作用[13]。腫瘤細胞的信號傳導(dǎo)和物質(zhì)交換方式主要有兩種，一種是細胞與細胞間的直接物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)，另一種是通過周圍細胞進行間接的物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)。外泌體的主動釋放機制是一種腫瘤細胞與周圍的細胞相互作用的新機制，外泌體將其內(nèi)含的物質(zhì)傳遞給周圍細胞，實現(xiàn)細胞間的物質(zhì)交換和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。外泌體通過多種途徑促進腫瘤的增殖侵襲與轉(zhuǎn)移，如增加腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力和促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成；增加腫瘤的血管形成，改變血管的通透性，參與形成免疫抑制微環(huán)境維持細胞增殖；逃避機體的免疫監(jiān)督，在形成腫瘤代謝微環(huán)境等多方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。本文研究了乳腺癌BT549細胞分泌的外泌體對乳腺癌細胞自身的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，實驗結(jié)果表明腫瘤來源的外泌體可作為一個交叉信號傳導(dǎo)平臺，在腫瘤的形成和生長等方面發(fā)揮自分泌作用，在促進腫瘤細胞生長方面發(fā)揮自分泌和旁分泌的作用，這一理論最早由QU等[16]于外泌體在胃癌中的作用研究中提出。

腫瘤微環(huán)境指腫瘤細胞周圍的各種正常細胞、信號分子、血管和細胞外基質(zhì)，常被比作腫瘤細胞生長的土壤，在調(diào)控腫瘤進展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，目前僅有少量學(xué)者研究外泌體在乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的作用[14]。外泌體是微環(huán)境的重要組成部分，可以由腫瘤細胞釋放到細胞外基質(zhì)進而進入循環(huán)系統(tǒng)，且外泌體中含有的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，可以作為腫瘤早期診斷以及預(yù)后檢測的新型標志物。SCHW-ARZENBACH等[17]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者的血清外泌體中miR-21以及miR-1246的表達水平明顯升高，GALINDO等[18]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者血清和胸腔積液的外泌體中基質(zhì)金屬蛋白酶10、熱激蛋白90、膜聯(lián)蛋白-1中異常表達，同時還在乳腺癌血漿外泌體中檢測到發(fā)育內(nèi)皮基因座-1以及纖維連接蛋白異常表達[19-20]，因此miR-21、miR-1246、發(fā)育內(nèi)皮基因座-1和纖維連接蛋白均可以作為乳腺癌早期診斷的生物標志物。惡性增殖是乳腺癌的重要特征，抑制乳腺癌細胞的惡性增殖是治療乳腺癌的重要治療手段，紫草素和鹵夫酮可以抑制乳腺癌細胞外泌體的釋放，調(diào)節(jié)細胞周期，抑制腫瘤細胞的增殖[21-22]。侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌的另一重要特征，轉(zhuǎn)移性乳腺癌可以危及生命安全,因此抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移是另一治療手段[23-25]。外泌體中的蛋白質(zhì)、miRNA可通過激活一些信號通路影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[26]。PIAO等[27]證實，乳腺癌細胞來源的外泌體的增殖可通過刺激巨噬細胞極化的途徑為淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。研究發(fā)現(xiàn)外泌體中的miR-105可以減少緊密蛋白的表達，破壞細胞間的緊密連接，從而促進細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[28]?？梢娡饷隗w有望成為乳腺癌早期篩查的快速、簡便的標志物，并可能對乳腺癌的治療提供新思路。

本研究通過對乳腺癌BT549細胞來源的外泌體進行提取以及鑒定，首次證明了人乳腺癌細胞BT549來源的外泌體可以促進腫瘤細胞自身的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。但其中分子調(diào)控機制尚不明確。雖然對外泌體的研究逐步深入，其在液體活檢和藥物遞送方面已在臨床獲得初步應(yīng)用，但在腫瘤臨床診療中的應(yīng)用仍處于初級階段[29-30]。相信在多學(xué)科的共同努力下，外泌體一定會在臨床上展現(xiàn)出更多的應(yīng)用價值，在不久的將來，越來越多的外泌體潛在應(yīng)用價值將會被發(fā)現(xiàn)并逐步應(yīng)用于臨床。