CRISPR基因編輯技術(shù)在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究進(jìn)展

李洋，申曉林，孫新曉，袁其朋，閆亞軍，王佳

（1北京化工大學(xué)化工資源有效利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029，中國(guó)；2美國(guó)佐治亞大學(xué)工程學(xué)院，佐治亞州，阿森斯 30602）

進(jìn)入新世紀(jì)以來(lái)，隨著科學(xué)與技術(shù)的蓬勃發(fā)展，出現(xiàn)了很多交叉學(xué)科。合成生物學(xué)是其中一門重要的新型交叉學(xué)科，主要涉及基因工程、系統(tǒng)生物學(xué)、生物化學(xué)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和工程學(xué)等領(lǐng)域。微生物合成生物學(xué)作為合成生物學(xué)的一個(gè)重要分支，是以微生物為載體，通過(guò)改造已有微生物細(xì)胞或設(shè)計(jì)并創(chuàng)建新的微生物元件，使底盤生物實(shí)現(xiàn)其特定的生物學(xué)功能。在改造或創(chuàng)制這些微生物的過(guò)程中，需要對(duì)底盤生物基因組進(jìn)行精簡(jiǎn)、插入或重構(gòu)，而高效精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)成為解決這些問(wèn)題的有效手段，為微生物合成生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展提供了強(qiáng)有力的支持。

基因編輯技術(shù)作為基因工程、代謝工程、醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域的重要技術(shù)，一直以來(lái)都是研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)的基因編輯方法如同源重組，存在打靶效率低、操作時(shí)間長(zhǎng)和操作煩瑣等問(wèn)題。為了解決這些問(wèn)題，陸續(xù)出現(xiàn)了P1 轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)［1］、鋅指核酶技術(shù)（zinc-finger nucleases，ZFNs）［2］、RNA 干擾技術(shù)（RNAi）［3］和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)蛋白核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）［4］等。近年來(lái)，研究者們又發(fā)明了CRISPR （clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技術(shù)［5］，相較于上述基因編輯技術(shù)，CRISPR 技術(shù)具有操作難度小、編輯成本低、打靶效率高、無(wú)痕編輯等優(yōu)點(diǎn)，在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用和研究，并由此開發(fā)和設(shè)計(jì)出了大量新的基因編輯元件、工具和基因線路［6］。

基于此，國(guó)內(nèi)外有大量研究人員對(duì)CRISPR 基因編輯技術(shù)從發(fā)現(xiàn)歷史、分類［7］、作用機(jī)理［8］及在微生物基因改造領(lǐng)域中的應(yīng)用［5，6，9，10］等方面進(jìn)行了綜述。近幾年來(lái)，隨著合成生物學(xué)和代謝工程的迅猛發(fā)展，利用CRISPR 基因編輯技術(shù)創(chuàng)建高效的微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)特定化學(xué)品、燃料和藥品不斷取得新的突破。本文綜述了CRISPR 基因編輯技術(shù)在不同微生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用，重點(diǎn)介紹了應(yīng)用不同技術(shù)在不同微生物中生產(chǎn)特定產(chǎn)品的最新進(jìn)展，闡述了在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展的CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13 等技術(shù)的研究現(xiàn)狀，闡明了該技術(shù)在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域的重要性，總結(jié)并展望了該技術(shù)在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域未來(lái)的發(fā)展方向。

1 CRISPR技術(shù)發(fā)展及分類

CRISPR 技術(shù)的高速發(fā)展，歸功于無(wú)意中發(fā)現(xiàn)的一種未知片段。1987 年，Ishino 等［11］在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了一段重復(fù)了5次，長(zhǎng)度為29 bp的序列，每段重復(fù)序列被長(zhǎng)度為32 bp 的雜亂序列隔開。2000 年，西班牙研究者M(jìn)ojica 等［12］通過(guò)收集不同微生物中這種類型的重復(fù)序列，發(fā)現(xiàn)這種序列在微生物中廣泛存在。直到2002 年，Jansen 等［13］觀察了大量細(xì)菌和古細(xì)菌基因組后，創(chuàng)造了縮寫CRISPR 代表之前提到的重復(fù)序列。之后，Barrangou 等［14］證實(shí)了CRISPR 序列被用于微生物對(duì)噬菌體免疫的猜想，揭示了CRISPR 序列在微生物中的主要功能。2008 年，Brouns 等和Marraffini等［15-16］對(duì)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的研究揭示了CRISPR轉(zhuǎn)錄并加工得到的crRNA（CRISPR-RNA）對(duì)DNA 具有靶向作用，因此推測(cè)CRISPR 系統(tǒng)具有作為基因編輯工具的潛力。2011年，Charpentier課題組發(fā)現(xiàn)RNA 酶Ⅲ參與crRNA 成熟前的修飾［17］，次年與Doudna 課題組合作完成單鏈嵌合RNA（single chimeric RNA）的研究［18］。2013 年，張鋒團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行多基因編輯的功能［19］，將CRISPR技術(shù)的應(yīng)用擴(kuò)大化。目前為止，CRISPR 技術(shù)在微生物混合篩選方面也有相關(guān)的應(yīng)用［20-23］。隨著CRISPR 系統(tǒng)研究得越來(lái)越深入，研究者們實(shí)現(xiàn)了該系統(tǒng)在小鼠［24］、斑馬魚［25］、線蟲［26］、擬南芥［27］、真菌［28］和細(xì)菌［29］等多種生物基因編輯中的應(yīng)用。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)由識(shí)別組件CRISPR 和切割組件Cas（CRISPR-associated proteins）組成。其中，識(shí)別組件CRISPR序列經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄形成crRNA前體（pre-crRNA），隨后pre-crRNA 經(jīng)過(guò)加工形成成熟的具有靶向識(shí)別功能的crRNA；切割組件Cas是一種核酸內(nèi)切酶，可與成熟的crRNA 形成RNA-蛋白質(zhì)結(jié)合體，隨著crRNA 與特定的DNA 序列特異性識(shí)別結(jié)合，Cas 切斷靶向的DNA 鏈，使基因產(chǎn)生缺口（double-strand breaks，DSBs），實(shí)現(xiàn)“打靶”；最后通過(guò)同源重組（homology-directed repair，HDR）［30］或非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）［31］等方式進(jìn)行基因修復(fù)，達(dá)到基因編輯的目的。

根據(jù)Cas蛋白的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系，CRISPR/Cas系統(tǒng)起初被分成3 種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型［32］。其中Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)的Cas蛋白均是多亞基蛋白質(zhì)；而Ⅱ型系統(tǒng)的Cas蛋白則是單亞基蛋白質(zhì)。隨著研究的深入，更多類型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)，如Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型，其中Ⅳ型是多亞基Cas 蛋白，Ⅴ型和Ⅵ型為單亞基Cas蛋白［33］。另外，根據(jù)Cas 蛋白功能不同，可將CRISPR/Cas 系統(tǒng)分為兩類：一類是由單亞基蛋白完成定點(diǎn)靶向和切割過(guò)程，目前該類系統(tǒng)僅在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)；另一類則是多亞基結(jié)構(gòu)的crRNA-蛋白復(fù)合體完成crRNA 加工、靶向定位和剪切［7］，這類系統(tǒng)廣泛存在于古細(xì)菌及細(xì)菌中。但是多亞基的CRISPR/Cas系統(tǒng)較為復(fù)雜，因此在基因編輯上應(yīng)用并不多，而單亞基蛋白如Cas9 蛋白［34］、Cas12a 蛋白［35］等，由于其原理簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較為廣泛。因此，本文將重點(diǎn)介紹CRISPR/Cas9在微生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展。

2 CRISPR/Cas9 在微生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用

Cas9 蛋白是一種單亞基的核酸酶，是目前微生物合成生物學(xué)研究中使用的CRISPR 系統(tǒng)中最常用的切割組件，通常將該類系統(tǒng)稱為CRISPR/Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)在進(jìn)行基因編輯時(shí)，tracrRNA（trans-activating crRNA）、pre-crRNA 和Cas9 蛋白先被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)出來(lái)；接著，tracrRNA 啟動(dòng)RNA酶Ⅲ修飾pre-crRNA，形成成熟的crRNA；然后crRNA、tracrRNA 和Cas9 蛋白形成復(fù)合物，通過(guò)crRNA 的識(shí)別作用將復(fù)合體靶向目標(biāo)DNA，與此同時(shí)，tracrRNA 激活Cas9 蛋白；接著，Cas9 發(fā)揮核酸酶的作用切割目標(biāo)DNA，使其雙鏈斷裂產(chǎn)生DSBs［17］。產(chǎn)生DSBs 后，細(xì)胞可通過(guò)不同修復(fù)方式修復(fù)DNA 雙鏈（圖1）。在該系統(tǒng)中，crRNA 和tracrRNA 可被一種單鏈的向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）取代，簡(jiǎn)化識(shí)別組件RNA。為了確保復(fù)合體的成功識(shí)別，在sgRNA 的靶序列下游必須含有PAM序列（protospacer adjacent motif）［18］。PAM 是位于靶向DNA 的3′端后長(zhǎng)度為3 bp 的序列，供sgRNA 和Cas9 蛋白復(fù)合體識(shí)別，其序列組合取決于Cas9 蛋白種類，通常為NGG［36］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過(guò)上述過(guò)程可在微生物中實(shí)現(xiàn)基因的缺失、增添和替換等基因編輯操作，使微生物表現(xiàn)出與編輯前不同的特性，實(shí)現(xiàn)特定的生物學(xué)功能。微生物合成生物學(xué)的兩個(gè)最重要的目的分別是改造已有的微生物底盤細(xì)胞或創(chuàng)造新的底盤細(xì)胞，使其實(shí)現(xiàn)特定的生物功能。因此，設(shè)計(jì)和構(gòu)建元件庫(kù)來(lái)改造、編輯或合成微生物底盤細(xì)胞基因組是合成生物學(xué)的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。CRISPR 系統(tǒng)的開發(fā)與發(fā)展為微生物合成生物學(xué)的研究提供了一個(gè)非常簡(jiǎn)便易操作的基因編輯技術(shù)，因此，本文將重點(diǎn)回顧與總結(jié)該技術(shù)在微生物合成生物學(xué)方面的研究與應(yīng)用。

2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)在大腸桿菌基因編輯中的應(yīng)用進(jìn)展

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割機(jī)制及修復(fù)機(jī)制圖［Cas9蛋白中藍(lán)色代表識(shí)別DNA被識(shí)別的位點(diǎn)，橙色代表PAM序列，深紫色代表sgRNA上的識(shí)別序列；在HDR過(guò)程中，淺紫色代表同源序列，綠色代表進(jìn)行替換的序列，橙色蛋白為RecE或Redα（負(fù)責(zé)供體DNA單鏈切割），藍(lán)色蛋白為RecT或Redβ（負(fù)責(zé)黏性末端的保護(hù)以及和基因斷裂位點(diǎn)的結(jié)合）；在NHEJ過(guò)程中，黃色蛋白表示Ku（負(fù)責(zé)保護(hù)斷裂位點(diǎn)兩側(cè)），橙色蛋白為ligD（負(fù)責(zé)連接斷裂位點(diǎn)）］Fig.1 The cleavage and repair mechanism of CRISPR/Cas9 systems(Blue represents the recognized site of DNA,orange represents PAM sequence,and dark purple represents the recognition sequence by sgRNA.During HDR,light purple represents homologous sequences,green represents substituted sequences,orange represents RecE or Red responsible for donor DNA single strand cutting,and blue represents RecT or Red responsible for protecting sticky ends and binding to the breaking sites of genes.During NHEJ,the yellow protein represents Ku responsible for protecting the fracture site,while the orange protein is ligD responsible for connecting to the fracture site)

大腸桿菌（Escherichia coli）由于其易于培養(yǎng)、增殖時(shí)間短、對(duì)環(huán)境的耐受性強(qiáng)、基因操作容易等特點(diǎn)，是微生物合成生物學(xué)研究中重要的模式生物［37］。因此，在大腸桿菌中構(gòu)建CRISPR/Cas9技術(shù)平臺(tái)十分重要。2013年，Jiang等［38］首先在大腸桿菌使用了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，通過(guò)Cas9 切斷目的基因，由λ-Red 蛋白修復(fù)實(shí)現(xiàn)目的基因的編輯，將突變序列引入宿主，證實(shí)了該系統(tǒng)在大腸桿菌中可有效進(jìn)行基因編輯，突變率達(dá)到65%。2015 年，天津大學(xué)趙學(xué)明團(tuán)隊(duì)改造了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，使其可進(jìn)行迭代基因編輯，從而降低多基因編輯的循環(huán)時(shí)間，該系統(tǒng)同時(shí)對(duì)3個(gè)基因進(jìn)行編輯的效率接近100%［39］。同年，中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所楊晟團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建了一個(gè)大腸桿菌CRISPR/Cas9基因編輯平臺(tái)，通過(guò)雙質(zhì)粒系統(tǒng)巧妙地同時(shí)實(shí)現(xiàn)了基因的斷裂、重組修復(fù)和質(zhì)粒的消除［40］。該團(tuán)隊(duì)簡(jiǎn)化了編輯方法，只需要替換質(zhì)粒中與靶DNA識(shí)別的20 個(gè)堿基（N20），即可編輯不同的基因，而在質(zhì)粒上引入多個(gè)具有特定N20結(jié)構(gòu)的sgRNA 的序列即可完成多基因的編輯［40］。2016 年，Zhao等［41］通過(guò)一個(gè)質(zhì)粒就實(shí)現(xiàn)單一基因的編輯，節(jié)省了質(zhì)粒構(gòu)建的時(shí)間。編輯平臺(tái)的建立在一定程度上方便了CRISPR/Cas9 技術(shù)在大腸桿菌中的應(yīng)用，同時(shí)提高了編輯效率，節(jié)約了時(shí)間。但有些問(wèn)題被暴露出來(lái)，如供體基因（donor DNA）長(zhǎng)度不能太長(zhǎng)、一次編輯的基因數(shù)量不能過(guò)多等。2016 年，為了將多個(gè)基因或大片段基因整合進(jìn)大腸桿菌，Chung 等［42］通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件并結(jié)合λ-Red 重組蛋白和線性dsDNA，實(shí)現(xiàn)供體DNA 和lacZ基因的高保真替換，效率達(dá)99%，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)度分別為2.4 kb、3.9 kb、5.4 kb 和7.0 kb DNA 片段的整合，效率分別達(dá)到91%、92%、71%和61%。研究發(fā)現(xiàn)，隨著引入大腸桿菌基因組片段長(zhǎng)度的增加，編輯效率逐步降低，為了進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)入長(zhǎng)片段的基因編輯效率，2018 年，Li 等［43］采用將大片段分割成多個(gè)片段整合的方法，每輪整合只提供小同源片段，同時(shí)優(yōu)化了gRNA（guide RNA）和Cas9 蛋白，成功將長(zhǎng)度為15 kb 的大片段引入大腸桿菌基因組。在大腸桿菌基因編輯的過(guò)程中，通常需要引入HDR 系統(tǒng)如Red 重組系統(tǒng)完成對(duì)于編輯后DSB的修復(fù)，而NHEJ修復(fù)很難在原核生物中實(shí)現(xiàn)［44］。為了使大腸桿菌擺脫對(duì)HDR 系統(tǒng)的依賴，提高修復(fù)效率，有研究者將真核生物的NHEJ修復(fù)系統(tǒng)引入大腸桿菌。Zheng等［45］通過(guò)引入恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）的NHEJ 系統(tǒng)，在大腸桿菌中突變了lacZ基因，并敲除了glnALG操縱子和兩段長(zhǎng)度分別為67 kb和123 kb的大片段DNA。為了進(jìn)一步解決大腸桿菌對(duì)外源HDR 系統(tǒng)或NHEJ 系統(tǒng)的依賴，Huang 等［46］通過(guò)優(yōu)化大腸桿菌天然的末端連接（ENEJ）系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了83 kb以下DNA片段的缺失或失活。這些研究都有效地提高了大腸桿菌基因編輯的效率，也為CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)在大腸桿菌中的應(yīng)用提供了有力保障。

微生物合成生物學(xué)一個(gè)重要目標(biāo)是對(duì)已知的生命體進(jìn)行基因編輯，高效合成目標(biāo)產(chǎn)品［47］。因此，有大量的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被應(yīng)用于提高目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)效率的研究。天津大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9 基因編輯平臺(tái)強(qiáng)化EMP 途徑和β-胡蘿卜素生產(chǎn)相關(guān)途徑，構(gòu)建了超過(guò)100種基因突變的突變文庫(kù)，最終，含有15 個(gè)修飾基因的大腸桿菌在發(fā)酵罐中生產(chǎn)了2.0 g/Lβ-胡蘿卜素［39］。夏軍等［48］利用楊晟團(tuán)隊(duì)構(gòu)建的CRISPR/Cas9 基因編輯平臺(tái)通過(guò)敲除丙酮酸羧化酶基因（ppc）、脂酰輔酶A合成酶基因（fadD）等基因，使脂肪酸產(chǎn)量增加了3.7%。Li 等［43］通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)將pyr操縱子、ppc和核糖磷酸焦磷酸激酶基因（prs）整合到大腸桿菌染色體中，在搖瓶中生產(chǎn)了5.6 g/L 尿苷。Abdelaal 等［49］敲除木糖產(chǎn)乙醇菌株的內(nèi)源性乙醇生產(chǎn)基因后，引入生產(chǎn)正丁醇的相關(guān)基因，在大腸桿菌中生產(chǎn)了4.32 g/L 正丁醇。Jung 等［50］在大腸桿菌中利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了丙酮酸甲酸裂解酶（pflb）、乳酸脫氫酶（ldhA）、乙醇脫氫酶（adhE）和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（fnr）的4 個(gè)編碼基因，降低副產(chǎn)物的生成，并過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)氫酶基因pntAB使聚羥基脂肪酸酯在搖瓶中產(chǎn)量達(dá)到32 g/L。Zhao 等［51］在原有研究基礎(chǔ)上用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了琥珀酰輔酶A 連接酶基因（sucD），促進(jìn)了己二酸合成前體琥珀酰輔酶A 的積累，使目標(biāo)產(chǎn)物己二酸的產(chǎn)量達(dá)到68.0 g/L。這些研究表明，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌進(jìn)行基因編輯的技術(shù)已十分成熟。但是，大腸桿菌仍具有不耐受強(qiáng)酸、有機(jī)溶劑和噬菌體等缺點(diǎn)。因此，提高大腸桿菌對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物或噬菌體的耐受性可在一定程度上提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量或降低噬菌體污染風(fēng)險(xiǎn)。Seo 等［52］用CRISPR/Cas9 技術(shù)在大腸桿菌基因組中插入了非編碼RNA 基因（dsrA）和DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子RcsB 基因（rcsB），提高了大腸桿菌對(duì)庚酸的耐受性，構(gòu)建了適于生產(chǎn)庚酸的工程大腸桿菌。Ou 等［53］通過(guò)引入N&P 系統(tǒng)在宿主中表達(dá)甲酰胺酶和亞磷酸酯脫氫酶使目標(biāo)大腸桿菌可以以甲酰胺和亞磷酸酯為氮源和磷源生長(zhǎng)，同時(shí)引入CRISPR/Cas9 系統(tǒng)協(xié)助大腸桿菌增強(qiáng)抵抗T7 噬菌體攻擊的能力，開發(fā)出了耐受性較強(qiáng)的大腸桿菌BL21（DE3）菌株，在工業(yè)發(fā)酵中具有很大的應(yīng)用潛力。綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)在大腸桿菌合成生物學(xué)中的應(yīng)用非常廣泛且較為成熟，但是該系統(tǒng)在細(xì)菌中的應(yīng)用還存在脫靶率較高、編輯成功率較低、多位點(diǎn)同時(shí)編輯效率低且應(yīng)用困難、PAM 序列依賴等問(wèn)題，因此需要通過(guò)進(jìn)一步的研究和開發(fā)如拓展PAM 序列、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)蛋白定點(diǎn)突變提高切割效率等，來(lái)完善和提高該技術(shù)在大腸桿菌基因編輯中的大規(guī)模應(yīng)用。

2.2 CRISPR-Cas9 技術(shù)在酵母基因編輯中的應(yīng)用進(jìn)展

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是常用真核模式生物，不僅可以生產(chǎn)酒精［54］，還常常作為合成生物學(xué)和代謝工程等領(lǐng)域的宿主菌，生產(chǎn)多種高附加值化學(xué)品［55］，如青蒿素［56］等。為了滿足科學(xué)研究和工業(yè)化的需求，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在酵母菌合成生物學(xué)中的研究和應(yīng)用越來(lái)越多，也日趨成熟。在sgRNA 的設(shè)計(jì)方面，已經(jīng)出現(xiàn)了一些非常方便的工具網(wǎng)站，如“Yeastriction web tool”，這些工具的出現(xiàn)極大地方便了在釀酒酵母中進(jìn)行基因編輯的操作［57］。早在2013 年，就有研究者使用90 bp 的雙鏈DNA 作為同源修復(fù)的模板，在can1位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)100%的編輯效率［58］。2015 年，Horwitz 等［59］證明了線性化質(zhì)粒與多個(gè)sgRNA 和供體DNA 的共轉(zhuǎn)化促進(jìn)了大片段高效多重基因整合，并將6 個(gè)總長(zhǎng)度為24 kb 的片段成功整合在酵母基因組中。但是，這些供體DNA同時(shí)整合的概率較低，因此有研究人員將HDR 系統(tǒng)引入到sgRNA 上，構(gòu)建了同源整合CRISPR（homology-integrated CRISPR，HI-CRISPR）系統(tǒng)。利用此方法，敲除了精氨酸透性酶基因（can1）、磷酸核糖酰氨基咪唑羧化酶基因（ade2）、賴氨酸透性酶基因（lyp1）三個(gè)基因［60］。Ryan 等［61］將δ 肝炎病毒核糖酶與sgRNA相連以提升sgRNA 豐度，構(gòu)建多重CRISPR（CRISPRm）系統(tǒng)，對(duì)多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行敲除，編輯效率接近100%。Mans 等［57］在酵母菌中構(gòu)建簡(jiǎn)單快速的敲除平臺(tái)，使用含有兩個(gè)sgRNA 的質(zhì)粒，一步轉(zhuǎn)化后可以同時(shí)引入6 個(gè)基因，促進(jìn)了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在酵母中的快速、標(biāo)準(zhǔn)、高效的應(yīng)用。2016 年，Shi 等［62］構(gòu)建了一個(gè)新的平臺(tái)Di-CRISPR（delta-integration CRISPR-Cas），用于高效、無(wú)標(biāo)記、單步、多拷貝的釀酒酵母生化途徑的整合，可整合長(zhǎng)度高達(dá)24 kb 共計(jì)18 個(gè)拷貝的基因片段。2018 年，Bao 等［63］開發(fā)了一種CRISPR/Cas9 同源定向修復(fù)基因組工程（CHAnGE）的方法，可快速編輯基因組單核苷酸，超過(guò)98%的目標(biāo)序列被成功編輯，編輯效率平均為82%，并利用該方法構(gòu)建了一個(gè)突變酵母文庫(kù)。2019 年，劉子鶴團(tuán)隊(duì)［64］構(gòu)建了一種gRNA-tRNA 陣列CRISPR/Cas9（GTR-CRISPR）系統(tǒng)用于釀酒酵母的多基因編輯，該系統(tǒng)能以80%的敲除效率同時(shí)敲除8 個(gè)基因，極大地提高了釀酒酵母基因組的編輯效率。

這些平臺(tái)的構(gòu)建，使酵母合成生物學(xué)得到快速發(fā)展，并應(yīng)用于許多其他種類的工程酵母菌中。2014 年，Ryan 等［61］利用CRISPRm 系統(tǒng)在二倍體酵母中改良纖維二糖利用途徑，使得纖維二糖發(fā)酵速率提高10 倍以上。2015 年，Jako?iūnas 等［65］嘗試了很多基因敲除的組合，在沒(méi)有過(guò)表達(dá)甲羥戊酸（MVA）途徑相關(guān)基因的情況下，得到了比野生型菌株MVA 產(chǎn)量高41 倍的工程菌株。2016 年，Shi 等［62］利用Di-CRISPR 平臺(tái)構(gòu)建了一個(gè)利用木糖生產(chǎn)（R，R）-（?）-2，3-丁二醇的酵母菌株，產(chǎn)量高達(dá)12.51 g/L。2017 年，Lian 等［66］提出了一種三功能CRISPR 系統(tǒng)組合代謝工程策略，即結(jié)合了酵母的轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和基因敲除三種功能，命名為CRISPRAID，這種策略能夠以模塊化、高通量的方式調(diào)控代謝網(wǎng)絡(luò)，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提升了3 倍。同年，Apel 等［67］構(gòu)建了一個(gè)基于CRISPR/Cas9 的無(wú)克隆工具包，該工具包包括了23 個(gè)Cas9-sgRNA 質(zhì)粒、37 個(gè)表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)時(shí)間不同的啟動(dòng)子以及10 個(gè)蛋白質(zhì)定位、降解和助溶標(biāo)簽，解決了酵母基因操作中選擇染色體整合位點(diǎn)、選擇啟動(dòng)子、蛋白質(zhì)定位和溶解性等問(wèn)題，利用該工具優(yōu)化了紫杉醇合成酶的表達(dá)，使紫杉二烯的產(chǎn)量提高了25 倍。2018 年，Xue等［68］通過(guò)使用CRISPR/Cas9 技術(shù)完全敲除乙醇脫氫酶基因（ADH2），使生物乙醇的產(chǎn)量提高了74.7%。2019 年，劉子鶴團(tuán)隊(duì)通過(guò)GTR-CRISPR 平臺(tái)簡(jiǎn)化了酵母脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)，將游離脂肪酸產(chǎn)量提高了30 倍［64］。另外，通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)生物乙醇［68-70］、3-羥基丙酸［71］、萜類［72］和青蒿素類［73］的生物合成過(guò)程進(jìn)行編輯和增強(qiáng)，這些物質(zhì)的產(chǎn)量均得到了很大的提升。這些研究說(shuō)明了在酵母中CRISPR/Cas9 技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用已經(jīng)非常成熟。基于此，大量高效、創(chuàng)新、實(shí)用的CRISPR/Cas9技術(shù)不斷被開發(fā)出來(lái)，服務(wù)于酵母合成生物學(xué)的研究與發(fā)展。

微生物合成生物學(xué)的另一個(gè)重要目標(biāo)就是人工設(shè)計(jì)并合成底盤生物，元英進(jìn)課題組運(yùn)用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了人工合成釀酒酵母5 號(hào)染色體［74］，拓寬了該技術(shù)在酵母中應(yīng)用的外延。另外，覃重軍課題組利用該技術(shù)將釀酒酵母天然的16 條染色體整合為一條具有完整功能的染色體SY14，并進(jìn)一步利用該技術(shù)將其構(gòu)建為環(huán)狀染色體［75-76］。這些研究為CRISPR/Cas9 在微生物合成生物學(xué)中的應(yīng)用和發(fā)展提供了新的思路和方向，也證明了該技術(shù)在酵母中的應(yīng)用效果優(yōu)于在細(xì)菌中的應(yīng)用，可作為一種強(qiáng)有力的基因編輯工具在更多的研究和實(shí)踐中大規(guī)模使用。

2.3 CRISPR-Cas9 技術(shù)在其他微生物基因編輯中的應(yīng)用進(jìn)展

放線菌（actinomycetes）是一類生產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、利福霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和糖肽類等抗生素的菌種［77］。2015 年，Cobb等［78］首次將CRISPR系統(tǒng)在鏈霉菌屬（Streptomycesspecies）中應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)S.lividans的雙基因同時(shí)編輯和31 kb 片段的敲除，同時(shí)構(gòu)建了含sgRNA 和Cas9 相關(guān)基因的pCRISPomyces-2 溫敏型質(zhì)粒，為CRISPR/Cas9 技術(shù)在鏈霉菌中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。為了更好地服務(wù)于工業(yè)生產(chǎn)，在工業(yè)放線菌中CRISPR/Cas9 技術(shù)也被開發(fā)出來(lái)。2016 年，Wolf 等［79］利用該技術(shù)在游動(dòng)放線菌SE50/110（Actinoplanessp.SE50/110）中敲除酪氨酸酶基因（melC2），消除副產(chǎn)物異黑素（different melanin）的生成，有助于提高目標(biāo)產(chǎn)品阿卡波糖的純度。2017 年，Jia 等［80］對(duì)S.rimosus中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶同工酶基因（zwf2）和6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶基因（devB）進(jìn)行突變和敲除，使土霉素產(chǎn)量增加了36.8%。2018年，Liu等［81］在紅色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）中敲除SACE_1765，并在SACE_0712 處引入pErmE 啟動(dòng)子，使紅霉素產(chǎn)量與野生型相比提高了80.3%。另外，還可通過(guò)敲除某些基因鑒定未知的代謝途徑。例如，Low 等［82］在鏈霉菌SD85 中利用該技術(shù)敲除模塊化聚酮合酶基因（sceN），證實(shí)了該基因負(fù)責(zé)合成抗真菌多烯大環(huán)內(nèi)酰胺。

絲狀真菌（filamentous fungi）是一類具有緊密基因組的真核微生物，參與一些初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，包括有機(jī)酸、酶、多糖和抗生素等，在工業(yè)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都發(fā)揮了重要作用［83-84］。2015 年，Liu 等［85］將體外轉(zhuǎn)錄的gRNA和外源供體DNA，引入組成型表達(dá)Cas9 蛋白的里氏木霉（Trichoderma reesei）中，實(shí)現(xiàn)了使用CRISPR/Cas9技術(shù)的基因編輯，其中單基因編輯效率近100%，雙基因同時(shí)編輯的效率為45%，三個(gè)基因同時(shí)編輯的效率4.2%。2016 年，Pohl等［86］在產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）中實(shí)現(xiàn)了負(fù)責(zé)綠色素合成的兩個(gè)基因amds和pks17的突變。2017 年，Qin 等［87］首次在大型真菌靈芝（Ganoderma）中應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)，有效提高了靈芝中抗癌物質(zhì)靈芝酸的含量。除此之外，CRISPR/Cas9技術(shù)在其他真菌中的應(yīng)用也非常廣泛，如米曲霉（Aspergillus oryzae）［88-89］、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）［90］、稻瘟菌（Pyricularia oryzae）［91］、白色念珠菌（Candida albicans）［92］、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）［28］。

噬菌體（bacteriophages）是地球上數(shù)量最多的生物，廣泛存在于地球上所有的水域中［93］。噬菌體通常有一個(gè)二十面體的頭部，在頭部的蛋白質(zhì)殼里包含了一個(gè)顯性的dsDNA 基因組。除了頭部以外，大部分噬菌體都有尾巴，其作用是將基因組傳遞到宿主細(xì)菌中，以達(dá)到增殖的目的［94］。為了更好地利用噬菌體，需要對(duì)噬菌體進(jìn)行基因編輯以符合特定的生物學(xué)需求。由于CRISPR 系統(tǒng)源于微生物對(duì)外來(lái)噬菌體抵抗，因此將CRISPR 技術(shù)用于噬菌體基因組編輯目前存在一定困難。2017 年，Tao 等［93］首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)T4 噬菌體進(jìn)行了基因編輯，他們將CRIPSR/Cas9 質(zhì)粒和供體DNA 質(zhì)粒共同導(dǎo)入宿主大腸桿菌，成功修飾了T4 噬菌體的基因組，為噬菌體的基因編輯提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。2019 年，Hoshiga 等［95］對(duì)T2 噬菌體的尾巴纖維進(jìn)行了修飾，使T2 噬菌體對(duì)大腸桿菌O157：H7 的吸附能力與PP01 相當(dāng)，對(duì)于治療由該種類大腸桿菌引起的腹瀉具有很大的意義。由上述研究可知，CRISPR/Cas9 技術(shù)在微生物合成生物學(xué)中具有廣泛而深入的應(yīng)用，使底盤生物的改造更加快速、準(zhǔn)確且高效，為微生物合成生物學(xué)的發(fā)展奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。因此，人們對(duì)于該技術(shù)有了更多的要求和研究，在此基礎(chǔ)上延伸出了更多的基因編輯技術(shù)。

3 CRISPR/Cas9 衍生技術(shù)在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 CRISPR/Cas12a（Cpf1）技術(shù)

CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)屬于V 型系統(tǒng)，Cas12a為單亞基蛋白［96］，與Cas9 蛋白相比，該蛋白具有以下特點(diǎn)：①識(shí)別切割DNA 不需要tracrRNA；②PAM序列富含胸腺嘧啶，通常為TTTN；③PAM序列位于被識(shí)別的DNA 的5′端；④識(shí)別點(diǎn)和切割點(diǎn)距離PAM 較遠(yuǎn)；⑤切割后產(chǎn)生黏性末端［35］；⑥蛋白分子量更??；⑦需要的crRNA 序列更短。該系統(tǒng)的具體作用機(jī)制如圖2（a）所示。目前，CRISPR/Cas12a 技術(shù)在常見(jiàn)的工業(yè)菌株如酵母［97-99］和鏈霉菌［100］中均有研究，并構(gòu)建了相應(yīng)的編輯平臺(tái)（表1）。如Liu 等［101］基于Cas12a 設(shè)計(jì)了一種具有基因編輯和轉(zhuǎn)錄抑制雙重功能的CRISPR 系統(tǒng)（RE-CRISPR），使谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）的半胱氨酸和絲氨酸產(chǎn)量分別提高了3.7倍和2.5倍。

藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）是一種可以進(jìn)行光合作用的原核微生物，藍(lán)細(xì)菌的光合固碳和生物合成化學(xué)品是合成生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)［102］。目前主要利用同源重組方法編輯藍(lán)細(xì)菌的基因，由于其基因拷貝數(shù)較高，導(dǎo)致基因編輯效率極低。有相關(guān)研究表明，Cas9 蛋白對(duì)藍(lán)細(xì)菌類微生物有一定的毒性，因此使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行基因編輯更加困難［103］。2016 年，Ungerer等［104］率先實(shí)現(xiàn)了利用CRISPR/Cas12a 對(duì)藍(lán)細(xì)菌的基因編輯，實(shí)現(xiàn)了在三種不同類型的藍(lán)細(xì)菌中進(jìn)行基因敲除、插入和突變的基因編輯操作。2019 年，Niu等［105］在AnabaenaPCC 7120 中利用不同抗性標(biāo)記多個(gè)基因組，同時(shí)使用蔗糖敏感性質(zhì)粒，使其在完成編輯后主動(dòng)丟失，實(shí)現(xiàn)了染色體大片段DNA缺失，單基因修飾達(dá)成功率100%。由此可知，CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌的編輯基因，這些研究為CRISPR 技術(shù)在藍(lán)細(xì)菌中大規(guī)模應(yīng)用奠定了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。上述研究都說(shuō)明CRISPR/Cas12a 編輯細(xì)胞的效率較高、特異性較高、脫靶率較低且可以編輯部分Cas9 敏感的菌種，我們可以推測(cè)其可以替代以大腸桿菌為代表的細(xì)菌中利用的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，提高細(xì)菌中基因編輯的效率和特異性。

表1 CRISPR技術(shù)在微生物合成生物學(xué)中生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的研究Tab.1 Applications of CRISPR-based technologies for the construction of microbial cell factories

3.2 CRISPR/Cas13 和Cas14

除了Cas9 和Cpf1 蛋白以外，Cas13 系列的蛋白也逐漸被重視（表2）。2016 年，張鋒團(tuán)隊(duì)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了一種能對(duì)抗RNA 病毒的核酸酶C2c2（Cas13a），該酶能與RNA 靶向結(jié)合并裂解RNA，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌自我防御［圖2（b）］。由此發(fā)展出RNA 水平上的基因編輯，可實(shí)現(xiàn)在DNA 不損傷的條件下對(duì)RNA 進(jìn)行干擾［106］。同時(shí)，Cas13 系列中的C2c6（Cas13b）和Cas13d 也具有相同的特點(diǎn)［107-108］。Cas14 來(lái)源于一種古細(xì)菌的CRISPR/Cas系統(tǒng)，與Cas9 蛋白相比，其體積更小，且可在不要PAM 序列的情況下靶向單鏈DNA 并對(duì)其切割，具有廣泛應(yīng)用的潛力［109］。目前為止，Cas13 和Cas14 在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域研究甚少，技術(shù)并不完善和成熟。但是，在RNA 水平上的編輯是可逆的、變化的，因此，可在此基礎(chǔ)上開發(fā)動(dòng)態(tài)調(diào)控元件，調(diào)節(jié)Cas13 或Cas14 蛋白的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間控制通路的調(diào)節(jié)程度和調(diào)節(jié)時(shí)間，是一種非常有前景的應(yīng)用方式。基于上述特點(diǎn)，這兩項(xiàng)技術(shù)未來(lái)在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域?qū)⒂袠O大的應(yīng)用和發(fā)展空間。

圖2 Cas12a和Cas13a系統(tǒng)作用機(jī)制［Cas12a中橙色序列為TTTN的PAM序列，Cas13a中藍(lán)色序列為PFS（Protospacer flanking site）序列］Fig.2 Working mechanism of Cas12a and Cas13a systems[Orange in Cas12a represents the PAM sequence of TTTN,and blue in Cas13a represents PFS(protospacer flanking site)sequence]

表2 CRISPR/Cas9、Cas12a、Cas13a對(duì)比總結(jié)Tab.2 The comparison and summary of CRISPR/Cas9,Cas12a and Cas13a

3.3 多亞基Cas蛋白的研究

目前，以單一亞基的Cas蛋白為核心的研究已廣泛應(yīng)用于基因組編輯、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等不同的領(lǐng)域，但大多數(shù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)中的Cas 蛋白是多亞基的［110］。因此，這種廣泛的多亞基Cas蛋白系統(tǒng)在應(yīng)用方面也有無(wú)窮的潛力。根據(jù)分類，多亞基的CRISPR/Cas系統(tǒng)包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型［33］。這些系統(tǒng)的Cas蛋白在發(fā)揮作用時(shí)，并非像Cas9等單一蛋白一樣，由一個(gè)亞基的不同結(jié)構(gòu)域發(fā)揮不同的作用，而是由多個(gè)不同的Cas 亞基共同發(fā)揮作用［7］。2019年，Dolan等［111］在人體胚胎干細(xì)胞和HPA1細(xì)胞中引入sgRNA，實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)程基因敲除。該研究通過(guò)T.fusca級(jí)聯(lián)和Cas3 的RNP 傳遞獲得了13%～60%的編輯效率，表明Ⅰ型CRISPR/Cas系統(tǒng)在真核生物的基因組編輯和敲除方面具有潛在的用途。同年，Hidalgo-Cantabrana 等［112］利用內(nèi)源性的Ⅰ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)，對(duì)卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）進(jìn)行了堿基缺失和插入的突變，這為重新利用內(nèi)源性CRISPR系統(tǒng)靈活靶向和編輯基因提供了一個(gè)框架。而Ⅲ型和Ⅳ型的CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理方面的研究已經(jīng)有了突破性的進(jìn)展［113-114］，但應(yīng)用并不廣泛，在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用也很少。因此，由于多亞基Cas蛋白系統(tǒng)的廣泛性，其在合成生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用還有待發(fā)掘。

4 總結(jié)和展望

CRISPR 技術(shù)的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了合成生物學(xué)的發(fā)展，由于其方便、快捷、高效、成本低、難度小等特點(diǎn)，為編輯動(dòng)植物和微生物的基因組提供了強(qiáng)有力的工具。但是，CRISPR 技術(shù)目前還存在一定的局限性。

（1）PAM 序列的依賴性。傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9 技術(shù)依賴于NGG 序列，因此無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)任意位點(diǎn)的編輯。雖然Cas12a 提供了新的PAM 依賴序列（T）TTN，在一定程度上緩解了NGG 依賴性的問(wèn)題［35］，但位點(diǎn)依賴性并沒(méi)有被徹底解決。因此，提高CRISPR 技術(shù)的普適性依賴于研究出一種不需要PAM 序列的方法，或者通過(guò)理性設(shè)計(jì)研究識(shí)別基因高保守區(qū)堿基序列如TATA 或NTG 的方法。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Cas14蛋白在靶向目標(biāo)DNA時(shí)不需要PAM 序列［109］，因此Cas14具有解決CRISPR技術(shù)對(duì)依賴PAM序列的潛力。

（2）編輯的脫靶率。研究者們?yōu)榱私鉀Q脫靶問(wèn)題分別從sgRNA和Cas蛋白入手進(jìn)行研究。張鋒團(tuán)隊(duì)建立了gRNA-Cas9n系統(tǒng)，Cas9n蛋白切割時(shí)只產(chǎn)生一個(gè)切口，通過(guò)兩套gRNA-Cas9n 系統(tǒng)同時(shí)對(duì)目標(biāo)基因切割，可提高sgRNA的特異性［115］，降低脫靶率。相關(guān)研究表明富含鳥嘌呤并缺乏腺嘌呤的sgRNA 更穩(wěn)定，由此開展了對(duì)sgRNA 活性的研究［116］。通過(guò)大規(guī)模數(shù)據(jù)的收集并研究sgRNA 的活性，Guo等建立了一個(gè)全面的sgRNA活性圖譜，可在模式生物任何位點(diǎn)選擇出高活性的sgRNA 序列，有助于提高sgRNA 的特異性并降低脫靶率［117］。同樣，對(duì)Cas蛋白的改進(jìn)研究較多，如使用FnCpf1［118］等，這些研究有望解決CRISPR技術(shù)脫靶率的問(wèn)題。

（3）該系統(tǒng)的安全性控制問(wèn)題。2017 年，Shin 等發(fā)現(xiàn)了抗CRISPR 蛋白Acr II A4 對(duì)CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的抑制作用［119］，為精準(zhǔn)控制CRISPR 系統(tǒng)奠定了基礎(chǔ)，也為控制該系統(tǒng)帶來(lái)了希望。

（4）應(yīng)用廣泛性。雖然CRISPR 技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種微生物系統(tǒng)，但在某些微生物中依然難以應(yīng)用。Cas9 蛋白對(duì)藍(lán)細(xì)菌等具有毒性，因此CRISPR 技術(shù)很難在藍(lán)細(xì)菌中應(yīng)用，雖然Cas12a可以應(yīng)用于藍(lán)細(xì)菌中，但是Cas9 蛋白對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性而Cas12a 蛋白的毒性較低的原因依然沒(méi)有較好的解釋。而這些問(wèn)題和困難的不斷解決會(huì)促使CRISPR 基因編輯技術(shù)在微生物合成生物學(xué)領(lǐng)域具有更加廣泛的應(yīng)用，從而可以快速、高效、精準(zhǔn)地創(chuàng)造出更多適合生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品的底盤生物。無(wú)論是微生物合成生物學(xué)還是CRISPR 技術(shù)都是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新興學(xué)科和技術(shù)，兩者都有很多問(wèn)題等待研究和解決，隨著兩者相輔相成地快速發(fā)展和深入研究，在未來(lái)一定會(huì)得到更多的研究成果和更好的技術(shù)應(yīng)用。