合成生物學(xué)在蛋白質(zhì)功能材料領(lǐng)域的研究進展

王盼，朱晨輝，趙婧，范代娣

（1西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西省可降解生物醫(yī)用材料重點實驗室，陜西 西安 710069；2西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西省生物材料與發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710069）

自然界中蘊藏著極為豐富的生物大分子或天然高分子，它們是自然界賦予人類最重要的物質(zhì)資源和寶貴財富。其中蛋白質(zhì)功能材料最基本的特點是具備良好的生物相容性和可降解特性。生物相容性是指材料與人體之間接觸時相互作用產(chǎn)生的各種生物、物理及化學(xué)反應(yīng)的性質(zhì)，兩者之間的接觸不會對宿主產(chǎn)生不良影響的材料屬性［1］；生物可降解性是指材料通常具備被宿主降解并且不會對宿主產(chǎn)生持續(xù)性傷害的材料屬性［2］。此外許多蛋白質(zhì)功能材料還具備低毒性、抗菌性等多功能特性，對它們的使用早就不僅僅局限于衣食住行等日常生活方面，隨著科學(xué)技術(shù)的進步，蛋白質(zhì)功能材料的應(yīng)用獲得越來越多的關(guān)注，在醫(yī)藥、軍事和紡織等領(lǐng)域應(yīng)用價值巨大，是一類具有極大發(fā)展?jié)摿Φ奶烊淮蠓肿硬牧稀?/p>

這類蛋白如果直接用動物組織的化學(xué)法提取普遍存在諸多問題，如受制于倫理和法律不能用人體組織提?。ㄈ缒z原蛋白的胚胎提取），或者無法高密度飼養(yǎng)（如產(chǎn)生蛛絲蛋白的蜘蛛具有同類相殘的天性），同時存在排斥反應(yīng)大、產(chǎn)品批次質(zhì)量不均一、生物功效不穩(wěn)定等特點，嚴(yán)重阻礙了蛋白質(zhì)功能材料的廣泛應(yīng)用。因此如何大量制備這些性能優(yōu)異的蛋白質(zhì)功能材料，一直是生物工程和材料工程交叉領(lǐng)域的熱點問題。重組DNA 技術(shù)出現(xiàn)之后，這些天然蛋白質(zhì)功能材料的部分表達(dá)為人們帶來希望，但是在基因表達(dá)、代謝、細(xì)胞信號和細(xì)胞外組裝等過程中仍然存在諸多障礙。例如天然功能蛋白DNA 序列在微生物體系中存在不穩(wěn)定或者表達(dá)量低，甚至兩者兼具的情況。在使用質(zhì)粒載體系統(tǒng)進行微生物表達(dá)時，天然DNA序列的不穩(wěn)定性可能是由于其序列高度重復(fù)，而低表達(dá)的原因可能是高效表達(dá)的微生物宿主與天然宿主之間密碼子偏好性存在較大差異，另外這些具有高度重復(fù)氨基酸的蛋白質(zhì)功能材料可能與微生物宿主的氨基酸庫并不匹配，因而加劇了稀有密碼子的使用效率，甚至可能使若干tRNA 庫負(fù)擔(dān)過重，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過程中若干氨基酸殘基缺失，獲得重組蛋白的功能和產(chǎn)量無法滿足市場的需求，這也限制了蛋白質(zhì)功能材料的范圍、種類和功能。

為了克服這一限制，需要能夠設(shè)計生物過程的工具。合成生物學(xué)作為一門多科學(xué)交叉融合的新興學(xué)科，是現(xiàn)代生物化學(xué)和分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、進化系統(tǒng)學(xué)、信息學(xué)、數(shù)學(xué)、計算機和工程學(xué)等學(xué)科的綜合，利用標(biāo)準(zhǔn)化生物元件（part），構(gòu)建通用型生物學(xué)模塊（module）及器件（device），設(shè)計組裝具有特定新功能的人工生命系統(tǒng)（system），控制物質(zhì)的生物合成，包括基因表達(dá)、蛋白質(zhì)功能、新陳代謝、分泌和細(xì)胞外組裝。理論上可以消除體內(nèi)合成蛋白的歷史難題，為蛋白質(zhì)功能材料的高效生產(chǎn)與合成帶來新動力。本文將以“合成生物學(xué)”科學(xué)理念為指導(dǎo)，整合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、計算生物學(xué)和材料學(xué)等技術(shù)說明蛋白質(zhì)功能材料的高效合成策略，從蛋白質(zhì)功能材料的應(yīng)用發(fā)展、構(gòu)效關(guān)系解析及分子設(shè)計、蛋白質(zhì)功能材料細(xì)胞工廠構(gòu)建與適配調(diào)控、蛋白材料裝配加工及應(yīng)用四個方面對蛋白質(zhì)功能材料的高效合成展開介紹。

1 蛋白質(zhì)功能材料的應(yīng)用發(fā)展

蛋白質(zhì)功能材料，包括蛛絲蛋白、蠶絲蛋白、貽貝蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白等，由于其獨特的材料特性，近年來受到國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注，也開展了大量研究［3-6］。例如膠原蛋白以其良好的凝膠性、吸水性、生物相容性、可降解、無毒等諸多優(yōu)良特性，在傷口縫線、軟骨缺損填充、骨骼金屬植入物鍍膜等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，是一種非常重要的生物醫(yī)用材料。本文作者以微生物為底盤，在膠原蛋白的高效合成領(lǐng)域取得了重要突破，在國際上首次實現(xiàn)了類人膠原蛋白的量產(chǎn)，創(chuàng)制了類人膠原原料、系列新型修復(fù)敷料的生產(chǎn)技術(shù)。蠶絲應(yīng)用廣泛且具有優(yōu)異的穿戴舒適性，南開大學(xué)劉遵峰團隊利用天然純蠶絲制備了一種新型的“人工肌肉”纖維，能夠感知皮膚表面濕度而自動調(diào)節(jié)衣袖長短，可用于智能織物和柔軟機器人研發(fā)等領(lǐng)域［7］。此外蠶絲蛋白具有極佳的光學(xué)特性、優(yōu)異的生物兼容性、可控的生物降解性以及簡便的功能化手段，這些絲蛋白材料性質(zhì)特別穩(wěn)定，在高溫甚至極端條件下仍能保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且很容易被殺菌消毒，可以穩(wěn)定釋放生物活性物質(zhì)，因此絲蛋白材料制備在醫(yī)療領(lǐng)域有巨大優(yōu)勢。塔夫茨大學(xué)David L.Kaplan 教授團隊使用軟刻蝕技術(shù)加工蠶絲蛋白制作細(xì)胞培養(yǎng)支架、成骨細(xì)胞培養(yǎng)、骨骼修復(fù)螺釘、傷口愈合貼片等［8］。上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所利用瞬態(tài)可溶微納光學(xué)技術(shù)，展示了以蠶絲蛋白為基礎(chǔ)的功能材料在光學(xué)與光電子學(xué)上的潛在應(yīng)用，開創(chuàng)性地應(yīng)用到信息保密和生物醫(yī)療領(lǐng)域中［9］。海洋貽貝黏附蛋白具有高強度、高韌性、防水性以及極強的黏附基體等功能，兼具優(yōu)異的生物相容性和可降解性，是實現(xiàn)細(xì)胞和組織之間的高效黏合的理想材料，并且可以在皮膚組織、黏膜組織、軟骨、骨骼等創(chuàng)口和手術(shù)切口的黏合中發(fā)揮作用［10-11］，是一類極具優(yōu)勢和潛力的光譜生物黏合劑。天津大學(xué)張雷和齊海山團隊采用生物合成的方法成功制備出“貽貝仿生多功能蛋白材料”能夠簡便快速黏附在醫(yī)用材料表面，同時具備抗污、抗菌、防霧和良好生物相容性等多種功能，可成為應(yīng)用于醫(yī)療設(shè)備和體內(nèi)植入器件的“超級涂層”［12-13］。天然的蛛絲蛋白是一種極其柔軟的蛋白，同時具有強度高、彈性好等極佳性能，是一種十分誘人的生物材料，并且具有非常優(yōu)異的生物相容性和可降解性，在紡織、生物醫(yī)學(xué)、美容保健、特種工業(yè)等領(lǐng)域能夠為人類服務(wù)［14-15］?；隗w外重組蛛絲蛋白構(gòu)成的新型生物材料，如納米纖維、水凝膠、多孔海綿及微膠囊等，可應(yīng)用于藥物可控釋放、組織工程支架等材料［16］。這些蛋白質(zhì)功能材料的多元化應(yīng)用推動了科學(xué)家們對其進行更加深入的分子水平機理的闡釋，并在前沿領(lǐng)域中取得一系列重大進展，這將推動先進技術(shù)水平的提升，從而拓展并推動其應(yīng)用，帶動產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

蛋白質(zhì)功能材料的諸多優(yōu)異性能，促使科學(xué)家試圖利用生物技術(shù)的方式復(fù)制這些特性，以解決這類蛋白在表達(dá)、生產(chǎn)以及實際應(yīng)用中遇到的系列瓶頸問題。盡管蛋白材料的合成已取得了較大進展，但是利用人工細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)功能材料的研究還處在發(fā)展階段，蛋白的產(chǎn)量和性能還無法滿足應(yīng)用需求，融合多學(xué)科技術(shù)才有望實現(xiàn)蛋白材料的高效合成與應(yīng)用的更大突破。

2 蛋白質(zhì)功能材料的構(gòu)效關(guān)系解析及分子設(shè)計

蛋白質(zhì)的功能活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)是理解其蛋白質(zhì)功能以及活性機理的基礎(chǔ)，其中序列特征和結(jié)構(gòu)特征是蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系研究的重要參數(shù)。在人類基因組計劃開展以來，我們已經(jīng)獲取了海量的生物序列數(shù)據(jù)，但是深入有效的信息挖掘和分析才能提煉出物質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，解析生命的本質(zhì)，從而實現(xiàn)蛋白生物合成的定向性和高效性。

2.1 蛋白質(zhì)功能材料的結(jié)構(gòu)特性

研究發(fā)現(xiàn)這些具有獨特材料特性的蛋白質(zhì)都具有特定氨基酸含量高、片段高度重復(fù)等特性（表1），例如蛛絲蛋白主要由重復(fù)的poly-Ala、Gly-Gly-X 和Gly-Pro-Gly-Gln-Gln 組成，重復(fù)序列決定了蛛絲蛋白的纖維性能［17］。天然膠原蛋白是結(jié)締組織中最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，典型結(jié)構(gòu)是三條多肽鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)，每個肽鏈中都含有多達(dá)300 個以上的“Gly-X-Y”重復(fù)氨基酸序列，X通常是脯氨酸，Y 通常是羥脯氨酸或者羥賴氨酸，形成300 nm 左右的三股螺旋結(jié)構(gòu)［18］。絲蛋白中的蠶絲蛋白主要由Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser 的重復(fù)序列組成［19］。彈性蛋白是彈性纖維的主要成分，賦予組織和器官可逆的收縮變形能力，主要是由五肽的重復(fù)序列Val-Pro-Gly-X-Gly 組成［20］。對于不同的蛋白質(zhì)，通過蛋白質(zhì)結(jié)晶、冷凍電鏡以及同源建模等不同手段確定其蛋白結(jié)構(gòu)，并利用高精度動態(tài)模擬獲得其動態(tài)構(gòu)象。針對較易獲得的晶體蛋白，采用結(jié)晶和X 射線衍射確定蛋白結(jié)構(gòu)；針對結(jié)晶困難的目標(biāo)蛋白，采用冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)；而對于實驗無法獲得結(jié)構(gòu)的蛋白，通過序列比對、同源建模、動力學(xué)模擬等方式獲得最接近蛋白真實狀態(tài)的構(gòu)象，為后續(xù)蛋白的設(shè)計和改造奠定基礎(chǔ)。

表1 材料蛋白的重復(fù)單元Tab.1 The repetitive units of material proteins

基因核心序列的高度重復(fù)導(dǎo)致全長基因獲取難度加大，高重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)也為后續(xù)的蛋白表達(dá)帶來非常大的挑戰(zhàn)［21-22］。以蛛絲蛋白為例，目前已經(jīng)表征了蛛絲蛋白在合成過程中蜘蛛腺體環(huán)境的變化，在此基礎(chǔ)上提出了成絲機理的假設(shè)模型，為蛛絲蛋白的人工合成奠定了理論基礎(chǔ)［23-24］。研究發(fā)現(xiàn)，富含丙氨酸的［An/（GA）n］的重復(fù)序列主要形成β-折疊片層，作為蜘蛛絲結(jié)晶區(qū)的一部分，為蜘蛛絲提供足夠的強度［25］。富含GPGXX（X 通常代表Gln）的五肽基序可形成β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，類似于彈簧，賦予蜘蛛絲足夠的彈性［26］。GGX基序和Spacer基序的重復(fù)序列也為蜘蛛絲提供了一定的彈性性能［27-28］。N 端和C 端的非重復(fù)序列也高度保守，涉及蛛絲蛋白的組裝和加工，如C端形成的α-螺旋結(jié)構(gòu)在絲纖維的組裝過程中發(fā)揮重要作用［29-30］。這些序列結(jié)構(gòu)和功能之間的聯(lián)系是人工合成蛛絲蛋白的重要依據(jù)。Prince 等［31］設(shè)計合成了來源于Nephila clavipes蜘蛛的主壺腹腺絲蛋白1（MaSp1）中典型的富含丙氨酸的［SGRGGLGGQGAGAAAAAAAAAAGGAGQGGYGG LGSQGT］（SPI）序列，以及主壺腹腺絲蛋白2（MaSp2）中的［SGPGGYGPGQQT］（SPII）序列，這些序列在大腸桿菌中加倍或組合表達(dá)，產(chǎn)生的一系列不同分子量聚合物均含有β-折疊結(jié)構(gòu)。Kaplan 等［32］通過對蛛絲蛋白序列的修飾，控制其產(chǎn)物自組裝能力，提高蛋白的可溶性。在蛛絲蛋白形成β-折疊結(jié)構(gòu)的區(qū)域兩側(cè)加入蛋氨酸，形成類似氧化還原觸發(fā)器的裝置，根據(jù)蛋氨酸被氧化還原程度改變β-結(jié)構(gòu)和增加蛋白的溶解度。另外，雖然蜘蛛絲的拉伸強度和韌性與其分子量保持著正相關(guān)，但是目前最大的挑戰(zhàn)仍是如何制造出足夠大的蛋白質(zhì)。Bowen 等［33］向絲DNA中添加了一個短的基因序列，該基因序列促進產(chǎn)生蛋白質(zhì)之間的化學(xué)反應(yīng)，將它們?nèi)诤显谝黄鸷铣梢粋€556kDa 的蛛絲蛋白，首次實現(xiàn)了這種絲在拉伸強度、韌性等方面可比擬天然蜘蛛絲的性能。

2.2 蛋白質(zhì)功能材料的設(shè)計與改造

蛋白質(zhì)功能材料不僅需要提供結(jié)構(gòu)支持作用，也需要考慮應(yīng)用環(huán)境的溫度、pH、黏附、增殖、降解等因素。類彈性蛋白多肽（elastin-like polypeptide，ELP）是由五肽重復(fù)序列Val-Pro-Gly-X-Gly 組成的具有顯著彈性和自組裝特性的一類功能性材料，并且具有獨特的低溫臨界溶液溫度，在一定溫度范圍內(nèi)可以表現(xiàn)可逆相轉(zhuǎn)變特性，因此具有重要的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)ELPs的臨界溫度參數(shù)受到氨基酸序列、鏈長、緩沖液濃度和多肽濃度等影響［34］。Chilkoti等［35］利用重組DNA技術(shù)改變氨基酸殘基和鏈長，精確地調(diào)整了ELP臨界溫度，并且提出的模型能夠在一定分子量和鏈長范圍內(nèi)預(yù)測ELP的臨界溫度?；贓LP的溫敏特性，只需通過調(diào)節(jié)其氨基酸序列和重復(fù)單元，便能夠精確控制其對不同環(huán)境條件的響應(yīng)敏感性，以實現(xiàn)可逆的溶解轉(zhuǎn)變。Conticello 等［36］已開發(fā)出不同類型的基于BAB彈性蛋白的三嵌段蛋白聚合物，其中B嵌段為疏水的五肽序列［（V/I）PAVG］，控制著ELP臨界溫度，A 嵌段為親水五肽序列［VPXYG］，研究發(fā)現(xiàn)X和Y分別為甘氨酸和谷氨酸時，該聚合物表現(xiàn)出更低的臨界溶液溫度，而當(dāng)X位置的甘氨酸被丙氨酸替換時，該聚合物的機械性能可以從彈性變?yōu)樗苄浴＿@種熱塑性水凝膠的獨特性使其在組織工程、藥物傳遞系統(tǒng)等方面應(yīng)用潛力巨大。

蛋白質(zhì)材料的功能特性也可以在分子水平上通過設(shè)計功能肽與目標(biāo)蛋白的融合來實現(xiàn)。自組裝多肽RADA-16（RADARADARADARADA）能夠迅速自組裝成網(wǎng)狀納米纖維屏障，起到快速止血的效果，李宏民等［37］將多肽RADA-16與類彈性蛋白序列融合并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，最終獲得的融合蛋白具有良好的止血效果。RGD（Arg-Gly-Asp）肽是許多細(xì)胞表面整合素的特異性配體，也是應(yīng)用非常廣泛和有效的一種促黏附多肽［38］。Du 等［39］在設(shè)計類人膠原蛋白時引入較多親水性氨基酸并將來源于T4 噬菌體纖維蛋白的foldon 區(qū)域和RGD 序列整合到該類人膠原蛋白序列中，獲得的重組蛋白具有親水性、熱穩(wěn)定性以及對促小鼠的成纖維細(xì)胞生長的作用。Li 等［40］將類彈性蛋白分別與RGD、MMP（金屬蛋白酶敏感域）和HBD（肝素結(jié)合域）片段融合，為以類彈性蛋白為基礎(chǔ)材料的水凝膠提供更加豐富的生物性能。來源于化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的一類高產(chǎn)Scl2 膠原蛋白也得到了廣泛的關(guān)注，基于不同的功能應(yīng)用，通過人工設(shè)計與改造實現(xiàn)了特定的生物學(xué)功能。例如Seo 等［41］將整聯(lián)蛋白結(jié)合序列（GFPGER）插入到重組Scl2 膠原蛋白中，該改性膠原蛋白具有促進成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞黏附性能。Stoichevska 等［42］通過在Scl2 系列蛋白后面引入酪氨酸（Tyr）和半胱氨酸殘基（Cys），這些殘基可以通過氧化實現(xiàn)交聯(lián)，以獲得更穩(wěn)定的膠原聚合體。金玲玲［43］將不同數(shù)量的RGD 序列和整聯(lián)蛋白結(jié)合序列（GFPGER）引入Scl2 膠原蛋白骨架上，改造后的Scl2 的蛋白能夠促進小鼠成纖維細(xì)胞的貼壁生長。

隨著對序列-結(jié)構(gòu)的深入挖掘和理解，我們逐步探討了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能之間的內(nèi)在關(guān)系，這將促進人工設(shè)計越來越接近于自然功能的生物大分子，為研發(fā)制造更多基于蛋白質(zhì)的多功能新型材料奠定基礎(chǔ)，也是我國高端制造業(yè)的戰(zhàn)略需要。

3 蛋白質(zhì)功能材料細(xì)胞工廠構(gòu)建與適配調(diào)控

蛋白質(zhì)的表達(dá)是一個復(fù)雜而精密的動態(tài)過程，任何環(huán)節(jié)的差錯都會對底盤細(xì)胞的自身代謝產(chǎn)生干擾，造成能量、物質(zhì)的不平衡，從而影響目標(biāo)蛋白的高效表達(dá)。隨著基因編輯技術(shù)和合成生物學(xué)的快速發(fā)展，對蛋白質(zhì)功能材料的合成途徑與底盤細(xì)胞之間的適配性進行優(yōu)化，完善基因表達(dá)、蛋白質(zhì)分泌和胞外自組裝過程，將會改善材料表達(dá)率低、適配性差、結(jié)構(gòu)及功效不穩(wěn)定等問題，從而大幅提高蛋白質(zhì)功能材料的合成效率（圖1）。

圖1 材料蛋白的高效表達(dá)策略Fig.1 High-efficiency expression strategy of material proteins

3.1 目的蛋白的表達(dá)與修飾

針對功能材料蛋白表達(dá)元件的設(shè)計，結(jié)合材料蛋白結(jié)構(gòu)的不同，可構(gòu)建高效的生物元件庫，確?；蛟谵D(zhuǎn)錄和翻譯過程中的穩(wěn)定和高效。Fahnestock 等［44］發(fā)現(xiàn)重組蛛絲蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，蛋白產(chǎn)率隨其分子量的增加而降低，通過密碼子優(yōu)化可以改善重組蛋白的產(chǎn)量和均一性。Tian 等［45］利用融合標(biāo)簽技術(shù)，以谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）為標(biāo)簽有效提高了蠶絲蛋白重鏈在大腸桿菌中的表達(dá)量。Bowen 等［46］通過優(yōu)化5′ UTR、RBS、終止子等表達(dá)元件，并設(shè)計斷裂蛋白質(zhì)內(nèi)含子（SI）序列構(gòu)建了SI-Bricks 系統(tǒng)，可以觸發(fā)蛋白質(zhì)之間融合形成更大的蛋白質(zhì)，最終成功表達(dá)出556 kDa 的絲蛋白鏈，分子質(zhì)量幾乎是天然絲蛋白的兩倍。其他促進轉(zhuǎn)錄、翻譯、折疊和分泌等過程中基因穩(wěn)定和高效表達(dá)的元件庫也可以為功能材料蛋白的高效表達(dá)提供借鑒意義。

針對功能材料蛋白中特定氨基酸的表達(dá)，例如蛛絲蛋白和膠原蛋白中的Gly、蠶絲蛋白中Gly和Ala，這些特定氨基酸含量很高，而影響蛋白的正常表達(dá)，通過調(diào)控蛋白翻譯過程中相關(guān)氨基酸t(yī)RNA 供應(yīng)狀況，為目標(biāo)蛋白翻譯提供充足原料。Xiao 等［47］基于重組蛛絲蛋白編碼基因的特點，通過擴增關(guān)鍵氨基酸t(yī)RNA 池的方法，優(yōu)化大腸桿菌代謝途徑，最終成功得到284.9 kDa 的蛛絲蛋白重復(fù)單元嵌合體。這些功能材料中還有特定氨基酸需要特殊修飾，例如將膠原蛋白的脯氨酸催化為羥基脯氨酸的脯氨酸-4-羥化酶對膠原蛋白三螺旋的形成與穩(wěn)定起重要作用，是膠原蛋白合成過程中的關(guān)鍵酶。本文作者團隊將來源于人脯氨酸-4-羥化酶與天然膠原蛋白α1 鏈在畢赤酵母和大腸桿菌中進行共表達(dá)，可以成功實現(xiàn)膠原蛋白的羥基化［48-49］，經(jīng)大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)，膠原蛋白表達(dá)量最高可達(dá)4.71g/L 的濃度［49-50］。Cha等［51］在大腸桿菌中利用非天然氨基酸摻入策略，使酪氨酸殘基的取代率達(dá)到90%以上，實現(xiàn)了貽貝蛋白中多巴胺的摻入，使重組貽貝黏附蛋白性能接近天然貽貝蛋白，表現(xiàn)出優(yōu)異的表面黏附性和耐水性。

3.2 發(fā)酵過程的調(diào)控與分離純化

針對功能材料蛋白在翻譯和發(fā)酵調(diào)控中的優(yōu)化，Jia等利用伴侶蛋白GroEL-GroES 和TF來促進類人膠原蛋白的表達(dá)［52-53］。Sun 等［54］開發(fā)了膠原蛋白-mRNA平臺，用于蛋白質(zhì)的可控生產(chǎn)。通過設(shè)計膠原蛋白基因?qū)腚装彼嵝蛄胁迦氲侥z原蛋白鏈中，使其具有有效的核糖體翻譯活性。Xue等［55］采用二氧化碳脈沖法首次研究了重組E.coli不同生長階段二氧化碳濃度對重組蛋白生產(chǎn)的影響。針對高密度發(fā)酵時乙酸持續(xù)積累引起目標(biāo)蛋白表達(dá)受阻，利用脈沖補料方式控制細(xì)胞處于一定的饑餓階段，使細(xì)胞在葡萄糖存在的情況下利用乙酸作為碳源，減小乙酸對細(xì)胞的毒性［56］；Chi等［57］采用遺傳算法及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型，建立了重組膠原高密度發(fā)酵的溫度誘導(dǎo)調(diào)控策略；Guo 等［58］利用代謝流分析研究了C/N 比對Escherichia coliBL21高效表達(dá)類人膠原蛋白II的影響，從而確立了類人膠原蛋白高效表達(dá)的合理C/N比。

針對功能材料蛋白的分離純化問題，由于蛋白質(zhì)氨基酸序列高度重復(fù)的特征，表達(dá)的蛋白質(zhì)中存在不同截短形式多肽，這些多肽的性質(zhì)與全長蛋白的化學(xué)性質(zhì)非常相似，很難從全長蛋白中分離出來，因此蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)的設(shè)計也需要改進，例如用修飾的腸沙門氏菌的III 型分泌系統(tǒng)表達(dá)這些特殊的蛋白質(zhì)，上調(diào)腸鏈球菌中III 型分泌相關(guān)基因提高幾種重組生物聚合物形成蛋白的分泌和純度，全長形式蛋白（包括節(jié)肢彈性蛋白、彈性蛋白和絲蛋白等）均一性顯著增強，改造之后的細(xì)胞分泌系統(tǒng)，不分泌截短的蛋白質(zhì)，因此在培養(yǎng)物收獲過程中沒有發(fā)現(xiàn)，這也為全長形式的生物大分子的純化提供了極大便利［59］。

3.3 細(xì)胞工廠的重構(gòu)與優(yōu)化

針對底盤細(xì)胞的構(gòu)建與優(yōu)化，近年來研究者們通過系統(tǒng)生物學(xué)方法，在基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建基因組規(guī)模代謝模型（genome-scale metabolic model，GSMM）［60-62］，可以全局化、系統(tǒng)性地掌握底盤細(xì)胞的代謝及生理特性，預(yù)測底盤細(xì)胞在特定環(huán)境中的表型，從而合理設(shè)計代謝途徑，大大提高蛋白合成效率。華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室Ye 等［63］對已有畢赤酵母GSMM 模型進行改進，得到包含2407 個反應(yīng)和1094 個代謝物的iRY1243 模型，探討了細(xì)胞生長參數(shù)、以葡萄糖為唯一碳源的代謝通量分布等對畢赤酵母表達(dá)重組蛋白的影響。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)Pan 等［64］通過融合PCR將Cre/lox 系統(tǒng)、篩選標(biāo)記Zeocin 以及同源臂成功拼接，建立了酵母基因組快速編輯方法，并且無需引入選擇標(biāo)記。中國科學(xué)院微生物研究所Zhang等［65-66］建立了一個新的谷氨酸棒桿菌的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型iCW773，在這一GSMM 模型的指導(dǎo)下，通過敲除sucCD基因編碼的琥珀酰輔酶A合成酶（SUCOAS），在不影響谷氨酸棒桿菌生長速率的條件下將反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)率提高了60%。為了使外源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量最大化，Zhao等［67］建立了一個包括9 株枯草芽孢桿菌突變株的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，以改善枯草芽孢桿菌中外源蛋白的分泌。隨著基因編輯技術(shù)和合成生物學(xué)的快速發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)被應(yīng)用在蛋白細(xì)胞工廠的構(gòu)建當(dāng)中，實現(xiàn)了高效、精準(zhǔn)的基因編輯，避免了基因編輯對底盤細(xì)胞自身代謝造成干擾［68］。美國猶他州立大學(xué)和蘇州大學(xué)合作利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功將蜘蛛絲基因（長達(dá)10 kb）定點導(dǎo)入家蠶基因組并進行編輯，在家蠶絲腺中表達(dá)蛛絲蛋白，該蛛絲蛋白具有與天然蜘蛛絲幾乎相同的機械性能［69］。此外，日本神戶大學(xué)的Nishida 等［70］將CRISPER/Cas9 與激活誘導(dǎo)胞苷脫氨酶（AID）結(jié)合，有效降低CRISPER/Cas9 技術(shù)造成的對啤酒酵母的細(xì)胞毒性，提高了這一技術(shù)在重組蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力。

4 蛋白材料裝配加工及應(yīng)用

蛋白質(zhì)功能材料的后加工是實現(xiàn)其在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域?qū)嶋H應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。近年來研究者們將光刻、3D 打印等微納制造技術(shù)應(yīng)用在了蛋白質(zhì)功能材料的后加工中，制備出具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的組織工程支架、微光學(xué)器件等功能性生物材料。上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所［71-72］采用電子束和聚焦離子束復(fù)合光刻的方法，構(gòu)建了形貌和功能可調(diào)的重組蛛絲蛋白積木，這種蛋白積木可以用于組裝更為復(fù)雜的三維生物結(jié)構(gòu)。與天然蛛絲蛋白相比，重組蛛絲對蛋白質(zhì)序列和分子量的精確控制賦予了蛋白積木前所未有的光刻分辨率、清晰度和生物功能。德國維爾茨堡大學(xué)的Schacht等［73］將重組蛛絲蛋白制成“生物墨水”，通過3D打印的方式構(gòu)建了具有高深寬比微納結(jié)構(gòu)的多孔生物支架，由于重組蛛絲蛋白的剪切稀釋性和通過β-折疊結(jié)構(gòu)、疏水作用等形成的自成膠性，打印后無需額外添加交聯(lián)劑即可形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，此過程條件溫和，可將活細(xì)胞與蛛絲蛋白混合打印，形成三維層次微組織結(jié)構(gòu)。

4.1 貽貝蛋白的加工及應(yīng)用

貽貝蛋白具有超強的黏性、柔韌性、防水性、生物降解和生物安全性，能夠在濕性條件下黏附于各種材料表面［74］。重組貽貝蛋白能夠通過旋涂、浸涂等方法在醫(yī)用材料表面形成涂層，改善細(xì)胞的黏附、增殖和分化等行為，還能作為介質(zhì)材料將生物分子如細(xì)胞微環(huán)境因子、核酸、治療藥物、無機納米粒子等固定在靶表面上［75］。多項研究顯示，整合貽貝蛋白和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸細(xì)胞黏附三肽（RGD）的重組蛋白（rMAP-RGD）表面修飾能夠改善鈦植入材料及PLGA/PCL、PCL 聚合物組織工程支架表面的細(xì)胞黏附、細(xì)胞分化及組織形成［76-78］。Jo 等［79］通過基因工程方法制備出貽貝蛋白-二氧化硅沉淀R5 肽（R5-MAP）融合蛋白，可在溫和條件下通過多層組裝的方式將二氧化硅納米微球修飾在醫(yī)用鈦植入材料表面調(diào)控其粗糙程度，有效促進了顱骨缺損部位的骨組織生長，同時提高了醫(yī)用植入設(shè)備的穩(wěn)定性和使用壽命。此外，天津大學(xué)Qi等［12-13］在大腸桿菌中成功構(gòu)建了貽貝蛋白-兩性離子多肽融合蛋白，開發(fā)出一種通用的生物惰性表面涂層，該涂層可牢固地錨定在金屬、塑料和礦物表面，具有高防污性能。

4.2 彈性蛋白的加工及應(yīng)用

受到天然彈性蛋白結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，研究者們利用重組蛋白技術(shù)制備了具有溫度響應(yīng)特性的彈性蛋白樣多肽（elastin-like polypeptide，ELP），在臨界溫度（Tt）以下，高分子鏈以無序、隨機的水合形式存在；當(dāng)溫度升高至Tt以上時，聚（GVGVP）序列產(chǎn)生疏水性折疊，形成β-螺旋結(jié)構(gòu)從而引起相分離。這種“逆溫度轉(zhuǎn)變”（inverse temperature transition，ITT）使得ELP 能夠在水溶液中發(fā)生自組裝，形成水凝膠或者納米凝膠，實現(xiàn)藥物遞送［80］。Wang等［81］針對淚蛋白在治療干眼癥時易被眼淚清除的問題，制備了淚蛋白-ELP融合蛋白，在體研究顯示，這一融合蛋白能夠在淚腺中自組裝形成“藥品倉庫”，將藥品在患處的滯留時間提高了6 倍。此外，重組蛋白技術(shù)制備的兩親ELP 和含有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的ELP融合蛋白，能夠在水中自組裝形成微球、囊泡等結(jié)構(gòu)，還可以進一步通過富含谷氨酸的亮氨酸拉鏈（ZE）和富含精氨酸的亮氨酸拉鏈（ZR）之間的相互作用，形成超分子結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)藥物遞送中具有較高的應(yīng)用價值［82-83］。

4.3 膠原蛋白的加工及應(yīng)用

本文作者團隊［84］將重組膠原蛋白與殼聚糖、透明質(zhì)酸通過分子間自組裝形成新型可注射pH/溫度敏感型的水凝膠，用于皮下填充及疤痕修復(fù)，能夠快速促進疤痕修復(fù)，將重組膠原蛋白與不同分子量的普魯蘭多糖交聯(lián)，獲得抗降解能力的水凝膠，用于皮膚組織、軟骨修復(fù)，使水凝膠的降解速度與組織的生成速度相匹配［85］；Song等［86］以谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶作為交聯(lián)劑，牛血清白蛋白和氯化鈉作為致孔劑，通過生物交聯(lián)和熱致相分離/冷凍干燥致孔技術(shù)，將重組膠原加工制備成具有三維多孔結(jié)構(gòu)、用于軟骨缺損修復(fù)和再生的水凝膠支架，能夠快速促進軟骨修復(fù)；Pan等［87］利用重組膠原蛋白與聚乙烯醇、羧甲基殼聚糖等多糖通過非共價相互作用，獲得保水性良好、透氣、阻菌、止血的多孔水凝膠皮膚敷料，促進皮膚傷口快速愈合；Zhu等［88-90］利用重組膠原共混多糖類大分子及靜電紡絲技術(shù)制備出生物相容性及力學(xué)性能良好的順序多層血管支架。血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于血管支架，15天就可以在材料表面形成致密的單層細(xì)胞，該血管支架材料生物學(xué)相容性優(yōu)良；范代娣等［91］以重組膠原為基礎(chǔ)原料，通過添加不同比例的小分子殼聚糖獲得了具有不同降解速度的植入型系列止血材料。與目前臨床使用的植入型止血材料相比，該止血材料止血迅速且生物相容性好。

5 總結(jié)和展望

隨著現(xiàn)代工程技術(shù)的快速發(fā)展，人們對功能材料提出了更高的要求，也推動了蛋白質(zhì)功能材料向高性能化、功能化和生物化方向的發(fā)展。蛋白質(zhì)經(jīng)過自然界進化，物種已經(jīng)發(fā)展出將這些序列保存在基因組中的方法，但是當(dāng)研究人員嘗試將這類DNA序列放入其他生物體時，基因表現(xiàn)非常不穩(wěn)定，經(jīng)常被宿主細(xì)胞機械剪斷或改變，導(dǎo)致其生產(chǎn)能力和產(chǎn)品質(zhì)量遠(yuǎn)不能滿足市場需求，因此國內(nèi)外成功產(chǎn)業(yè)化的案例極少。合成生物學(xué)具有可利用再生資源、低污染、易控制、可對生物大分子進行定向設(shè)計的優(yōu)點，伴隨著蛋白質(zhì)功能材料的功能原理及新穎設(shè)計理念被逐步挖掘和解析，已經(jīng)發(fā)展出在特定條件下性能優(yōu)異的替代材料，已有報道證實了這類蛋白質(zhì)功能材料在癌癥診斷與治療［92-93］、再生醫(yī)學(xué)［94-96］、基因傳遞系統(tǒng)［97-98］、數(shù)據(jù)存儲［99-100］等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用價值。

雖然基于特定需求開發(fā)出了許多具有多功能的蛋白質(zhì)功能材料，拓寬了蛋白質(zhì)功能材料的潛在應(yīng)用范圍，但是這些材料大多還處于實驗階段，尚未投入到真正的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中。為解決這一挑戰(zhàn)，需要我們從生物學(xué)和材料學(xué)等不同角度入手開展研究。一方面，生物系統(tǒng)是經(jīng)過億萬年自然選擇壓力下形成的高度動態(tài)、靈活控制、非線性的復(fù)雜天然生物，通過設(shè)計、構(gòu)建和調(diào)試優(yōu)化突破自然進化的限制，使細(xì)胞工廠功能日益強大，實現(xiàn)人工設(shè)計指導(dǎo)下材料蛋白的定量可控表達(dá)與規(guī)?；a(chǎn)。另一方面，針對人類需求的多元化，功能材料的發(fā)展也朝著動態(tài)可調(diào)控、高效多功能的方向發(fā)展，通過對材料性能機理的深入研究與解析，指導(dǎo)設(shè)計具有優(yōu)異性能的蛋白質(zhì)功能材料，為其成功邁入應(yīng)用的大門提供可能。在充分認(rèn)識合成生物學(xué)在蛋白質(zhì)功能材料領(lǐng)域中的重要作用的同時，我們還需要考慮如何充分結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)，為蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于生物醫(yī)藥、能源環(huán)境、國防軍事等領(lǐng)域提供全新的發(fā)展思路。