從藥物多肽到蛋白質(zhì)全合成：酶促拼接的方法原理與前沿應(yīng)用

楊新宇，朱彤，李瑞峰，吳邊

（1 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，中國(guó)科學(xué)院微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，微生物資源前期開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101；2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100049）

自20 世紀(jì)20 年代人類(lèi)發(fā)現(xiàn)胰島素以來(lái)，蛋白多肽類(lèi)藥物在體液調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎、抗病毒及抗腫瘤等臨床應(yīng)用方面的重要性愈加顯著［1-3］。截至2017年，全世界已有60多種多肽類(lèi)藥物獲批上市，并以平均每年1種的速度持續(xù)增長(zhǎng)［4-5］。雖然以重組表達(dá)為代表的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能夠高效生產(chǎn)重組蛋白且可摻入個(gè)別非天然氨基酸，但難以合成含有多種非天然氨基酸的人工設(shè)計(jì)多肽與蛋白質(zhì)［6-7］。目前多肽固相合成法仍是便捷獲取非天然多肽的主要途徑，然而該方法能夠合成的多肽長(zhǎng)度一般限于30～50個(gè)氨基酸殘基，研究人員需要將多個(gè)多肽片段順次拼接從而獲得完整目標(biāo)蛋白［8-9］。除此之外，許多待研究的多肽或蛋白質(zhì)分子需要在特定位點(diǎn)連接寡糖鏈、脂類(lèi)分子、核酸、熒光分子或另一個(gè)蛋白質(zhì)分子等多樣的功能基團(tuán)。為了降低這些蛋白質(zhì)的合成難度與成本，研究者采取了半合成策略，即利用化學(xué)方法合成一段帶有功能基團(tuán)的短肽，再將該片段與重組表達(dá)的蛋白質(zhì)連為一體［10-11］。兩段合成多肽的拼接以及蛋白質(zhì)半合成均極具挑戰(zhàn)，其難點(diǎn)在于需要保證酰胺縮合反應(yīng)的區(qū)域選擇性，同時(shí)必須抑制末端氨基酸殘基的外消旋化副反應(yīng)［12］。因此，探索具有嚴(yán)格區(qū)域選擇性且盡可能避免外消旋的多肽拼接方法成為了蛋白質(zhì)化學(xué)合成與修飾領(lǐng)域近年來(lái)的研究焦點(diǎn)。

現(xiàn)有的多肽拼接方法分為化學(xué)法與酶促法兩大類(lèi)?；瘜W(xué)法包括自然化學(xué)連接（native chemical ligation，NCL）［13］、無(wú)痕施陶丁格連接（traceless Staudinger ligation）［14］、酮酸-羥胺連接（ketoacidhydroxylamine ligation，KAHA）［15］、絲氨酸/蘇氨酸連接（serine/threonine ligation，STL）［16］以及二硒醚-硒酯連接（diselenide-selenoester ligation，DSL）［17］等（圖1）。這些化學(xué)方法均采取了相似的策略，即兩條多肽片段的末端化學(xué)基團(tuán)發(fā)生選擇性反應(yīng)形成共價(jià)鍵，之后通過(guò)分子內(nèi)重排形成肽鍵［12］。由Kent團(tuán)隊(duì)提出的NCL 是目前應(yīng)用最為廣泛的一種方法，該方法的原理為將一條多肽的C端活化為硫酯形式，而另一條多肽的N 端第一個(gè)殘基固定為Cys，二者經(jīng)過(guò)硫醇-硫酯交換與分子內(nèi)重排兩步反應(yīng)形成肽鍵［18］。多肽硫酯可通過(guò)Boc 固相合成法（保護(hù)基為叔丁氧羰基）直接合成，也可通過(guò)Fmoc 固相合成法（保護(hù)基為9-芴甲氧羰基）制備多肽酰肼，再經(jīng)過(guò)一步反應(yīng)生成疊氮［19］或吡唑［20］中間產(chǎn)物，加入硫醇得到對(duì)應(yīng)的多肽硫酯。若待連接片段為重組蛋白，則需要通過(guò)分子生物學(xué)方法在蛋白N 端添加Cys殘基，或是將蛋白質(zhì)C端活化為硫酯形式。目前最常用的EPL策略需在蛋白質(zhì)C 端融合表達(dá)內(nèi)含肽（Intein），之后在反應(yīng)體系中加入苯硫酚以進(jìn)攻內(nèi)含肽與目標(biāo)蛋白的結(jié)合處，從而形成硫酯［21］。NCL 方法的主要缺陷在于Cys是天然蛋白質(zhì)中豐度最低的氨基酸種類(lèi)之一，這嚴(yán)重限制了拼接位點(diǎn)的選擇范圍，盡管連接后可通過(guò)脫硫處理將Cys 變?yōu)锳la，但如果存在其他非連接位點(diǎn)的Cys殘基，又需要增加保護(hù)與脫保護(hù)操作，這些步驟都會(huì)降低最終產(chǎn)物的收率［22］。此外EPL 策略最初使用的內(nèi)含肽長(zhǎng)約140 個(gè)氨基酸殘基，雖然后續(xù)研究縮短了融合表達(dá)內(nèi)含肽片段的長(zhǎng)度［23］，仍可能對(duì)重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)生較大影響。

與化學(xué)法的原理不同，酶促法反應(yīng)的區(qū)域選擇性與立體選擇性來(lái)源于酶活性中心的空間位阻以及基團(tuán)間的非共價(jià)作用，滿(mǎn)足多肽拼接在區(qū)域選擇性及抑制外消旋方面的基本要求。目前研究較深的酶促多肽拼接策略主要有三種，分別使用Sortase A 轉(zhuǎn)肽酶、Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶以及Subtilisin人工連接酶，這些方法在拼接位點(diǎn)限制、蛋白質(zhì)表達(dá)難度、酶活性等方面凸顯出不同的優(yōu)勢(shì)，但在各個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域又分別有各自的限制，下文將系統(tǒng)闡述與比較。

1 多肽連接酶性質(zhì)及其應(yīng)用

1.1 Sortase A轉(zhuǎn)肽酶

圖1 主要化學(xué)連接方法［13-17］Fig.1 Chemical ligation methods［13-17］

SortaseA（SrtA）是源自革蘭氏陽(yáng)性菌的一種轉(zhuǎn)肽酶，其中來(lái)源于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的SrtA 轉(zhuǎn)肽酶應(yīng)用最為廣泛，該酶識(shí)別蛋白的LPXTG 序列（X 為任意氨基酸殘基），切斷蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的肽鍵并形成酶-底物中間體，隨后位于肽聚糖的寡聚甘氨酸肽橋進(jìn)攻中間體，與目標(biāo)蛋白C端之間形成新的肽鍵從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞壁表面的錨定［24］。此外還存在識(shí)別LPXTA 序列的SrtA 轉(zhuǎn)肽酶，這種來(lái)自化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的轉(zhuǎn)肽酶常出現(xiàn)在與金黃色葡萄球菌來(lái)源的SrtA 轉(zhuǎn)肽酶聯(lián)合使用的場(chǎng)合，兩種酶對(duì)拼接位點(diǎn)的序列識(shí)別具有正交性［25］。SrtA 轉(zhuǎn)肽酶可通過(guò)重組表達(dá)來(lái)大量制備，現(xiàn)已實(shí)現(xiàn)商品化，這讓不同領(lǐng)域的研究者均能?chē)L試以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)新型生物技術(shù)［26］。與內(nèi)含肽介導(dǎo)的EPL 策略相比，使用SrtA 轉(zhuǎn)肽酶催化蛋白質(zhì)拼接時(shí)，僅需在目標(biāo)蛋白末端融合表達(dá)長(zhǎng)度僅有幾個(gè)氨基酸殘基的標(biāo)簽序列，雖然最終會(huì)留下一段“疤痕序列”［圖2（a）］，但與融合表達(dá)內(nèi)含肽的策略相比，已大幅降低了蛋白質(zhì)表達(dá)與折疊可能受到的影響，并且底物末端無(wú)需活化，獲取底物的難度與成本較低。

2004 年，Mao［27］等首次利用SrtA 轉(zhuǎn)肽酶進(jìn)行蛋白修飾，在綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的C 端融合表達(dá)LPETG（H）6標(biāo)簽，再通過(guò)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)將葉酸等小分子化合物或另一個(gè)GFP 分子連接至目標(biāo)蛋白C 端［圖2（b）］，此后SrtA 轉(zhuǎn)肽酶蛋白拼接技術(shù)很快被應(yīng)用于多個(gè)生物學(xué)研究方向。細(xì)胞表面蛋白參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、識(shí)別等眾多生物學(xué)過(guò)程，一直作為重要的藥物靶點(diǎn)受到廣泛關(guān)注，Tanaka 等［28］將LPETGG 序列添加至重組破骨細(xì)胞分化因子C 端并運(yùn)用SrtA轉(zhuǎn)肽酶方法進(jìn)行修飾［圖2（c）］，為細(xì)胞表面蛋白的時(shí)空動(dòng)力學(xué)表征提供了新的研究思路，同樣的方法亦可用于細(xì)胞表面蛋白的N 端修飾［29］。噬菌體表面展示技術(shù)是當(dāng)下建立抗原抗體庫(kù)、篩選藥物等研究的常用手段，Hess 等［30］提出了組合應(yīng)用衣殼蛋白的策略，通過(guò)在M13噬菌體衣殼蛋白pIII與pVIII 的N 末端分別添加寡聚Gly 和寡聚Ala（G5-pIII-A2-pVIII），先利用化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）來(lái)源的SrtA 轉(zhuǎn)肽酶［Sortase A（strep）］將四甲基羅丹明（tetramethylrhodamine，TAMRA）修飾的七肽（KLPETAA）選擇性連接至pVIII，再利用金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）來(lái)源的SrtA 轉(zhuǎn)肽酶［Sortase A（staph）］將帶有五肽標(biāo)簽（LPETG）的駱駝科重鏈抗體7（camelid heavy-chain antibody 7，VHH7）選擇性連接至pIII，拓寬了噬菌體表面展示技術(shù)的功能范圍［圖2（d）］。與蛋白修飾相比，SrtA 轉(zhuǎn)肽酶在環(huán)肽合成方面的成果較少，主要原因是連接后留下的“疤痕”較長(zhǎng)，另外待環(huán)化多肽的長(zhǎng)度一般需要超過(guò)19 個(gè)氨基酸殘基，否則將傾向于肽段寡聚［31］。目前SrtA 轉(zhuǎn)肽酶方法合成環(huán)蛋白的代表案例包括人唾液肽組蛋白Hst1［圖2（e）］［32］、重組胱氨酸結(jié)環(huán)肽rMCoTI-II［33］以及向日葵胰蛋白酶抑制劑SFTI-1［34］等，環(huán)化后蛋白的熱穩(wěn)定性以及抗蛋白酶水解能力均有不同程度的提升。

圖2 SrtA轉(zhuǎn)肽酶的催化過(guò)程及應(yīng)用示意圖［26-28，30，32］Fig.2 The catalysis process of Sortase A and its applications［26-28，30，32］

SrtA 轉(zhuǎn)肽酶的主要不足之處在于其催化的連接反應(yīng)是可逆的，因而需要較高的多肽底物濃度以保證連接效率，此外酶的催化速率偏慢，酶用量一般為蛋白底物物質(zhì)的量的0.1～1倍［10，35-36］。當(dāng)下研究者的一種優(yōu)化思路是將SrtA 轉(zhuǎn)肽酶與其他化學(xué)或酶學(xué)方法結(jié)合以取長(zhǎng)補(bǔ)短，例如Muir 團(tuán)隊(duì)提出了基于內(nèi)含肽自剪切技術(shù)與SrtA 轉(zhuǎn)肽酶轉(zhuǎn)肽反應(yīng)的TAIL 策略，該策略可用于細(xì)胞核等復(fù)雜生物環(huán)境下的蛋白質(zhì)末端不可逆連接，“疤痕”序列僅含一個(gè)Cys 殘基［37］。清華大學(xué)劉磊團(tuán)隊(duì)［38］則用肼或肼衍生物替代寡聚甘氨酸底物進(jìn)攻SrtA 轉(zhuǎn)肽酶-底物中間體，產(chǎn)物變?yōu)椴辉俦籗rtA 轉(zhuǎn)肽酶識(shí)別的蛋白質(zhì)酰肼，由此可制備N(xiāo)CL 方法所需的蛋白質(zhì)硫酯，或是在蛋白質(zhì)末端引入炔基、疊氮等功能基團(tuán)，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（click reaction）完成二次修飾。SrtA 轉(zhuǎn)肽酶的技術(shù)擴(kuò)展案例為蛋白質(zhì)合成與修飾領(lǐng)域指出了一個(gè)潛在的發(fā)展方向，即搭配使用現(xiàn)有的化學(xué)與酶促方法，建立充分發(fā)揮多種方法優(yōu)勢(shì)的多肽連接策略。

1.2 Butelase 1轉(zhuǎn)肽酶

Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶是熱帶藥用植物蝶豆（Clitoria ternatea）合成環(huán)肽的過(guò)程中催化多肽環(huán)化的連接酶，識(shí)別多肽C 端的N/D-HV 序列并切斷N/D 的C 端肽鍵形成酶-底物中間體，之后底物N 端進(jìn)攻中間體從而完成多肽的環(huán)化［39-40］。Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶的連接位點(diǎn)最終僅留下一個(gè)氨基酸殘基（Asn或Asp）的“疤痕”［圖3（a）］，底物N 端的序列限制也比SrtA 轉(zhuǎn)肽酶低得多，因此Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶在環(huán)肽合成方面更具優(yōu)勢(shì)［40-41］。Tam 團(tuán)隊(duì)［42］利用Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶合成了多種環(huán)蛋白，例如環(huán)狀細(xì)菌素AS-48［圖3（b）］、Uberolysin和Garvicin ML，其中AS-48 對(duì)包括李斯特菌（Listeria monocytogenes）在內(nèi)的多種致病細(xì)菌具有優(yōu)秀的抑制效果，其最小抑菌濃度低至0.1 μmol/L 數(shù)量級(jí)，為開(kāi)發(fā)針對(duì)“超級(jí)細(xì)菌”的特效藥物指明了新方向?？杀籅utelase 1 轉(zhuǎn)肽酶環(huán)化的多肽長(zhǎng)短不一，大到含有約250個(gè)氨基酸殘基的GFP（環(huán)化速率約為SrtA轉(zhuǎn)肽酶的20 000 倍），小到九肽，更短的多肽片段則一般會(huì)先寡聚后成環(huán)［43］。

實(shí)驗(yàn)表明，Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶催化的多肽首尾環(huán)化反應(yīng)不可逆，但兩條多肽間的拼接反應(yīng)是可逆的，釋放的HV 二肽同樣可以作為親核試劑進(jìn)攻酶-底物中間體，這導(dǎo)致Butelase 1轉(zhuǎn)肽酶和SrtA轉(zhuǎn)肽酶類(lèi)似，需要較高的底物濃度來(lái)保證多肽拼接效率［44］。為了解決這一問(wèn)題，Tam 團(tuán)隊(duì)［44］合成了C端序列為N-（thioglycolic）-V的多肽底物，此序列依舊能被Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶識(shí)別，但釋放的硫代二肽無(wú)法進(jìn)攻酶-底物中間體，改進(jìn)后的方法用于泛素N 端修飾時(shí)取得了高達(dá)95%的連接率［44］。不過(guò)在對(duì)連接率要求不是特別高的情況下，普通的底物已經(jīng)能滿(mǎn)足大部分需求，例如在大腸桿菌表面的OmpA 蛋白C 端添加NHV 序列，利用Butelase 1轉(zhuǎn)肽酶即可將帶有甘-異亮（GI）二肽的分子探針連接至OmpA 蛋白上，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌活體標(biāo)記［圖3（c）］［45］。當(dāng)被修飾的蛋白質(zhì)分子是一個(gè)以L(fǎng)ys為節(jié)點(diǎn)的多肽分支骨架時(shí)，就可以在這個(gè)“樹(shù)干”上連接“枝葉”，將八條具有抗菌作用的四肽（RLYR）連接至這種骨架上［圖3（d）］，形成的樹(shù)狀多肽大分子的廣譜抑菌活性相比單體有大幅提升，最小抑菌濃度降低了2 個(gè)數(shù)量級(jí)［46］。此外Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶亦可用于蛋白硫酯的制備，目標(biāo)蛋白C 端僅需額外表達(dá)NHV 三個(gè)氨基酸殘基，再通過(guò)轉(zhuǎn)肽反應(yīng)連接多肽硫酯，無(wú)需內(nèi)含肽的參與［圖3（e）］［47］。

Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶的活性比SrtA 轉(zhuǎn)肽酶高出2～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，用酶量低至底物物質(zhì)的量的百分之一，然而B(niǎo)utelase 1 轉(zhuǎn)肽酶一直是從植物材料中提取，目前仍無(wú)法重組表達(dá)［10，48-49］。Tam 團(tuán)隊(duì)后續(xù)又發(fā)現(xiàn)了催化過(guò)程基本一致的OaAEP1轉(zhuǎn)肽酶，該酶可在大腸桿菌中重組表達(dá)，但產(chǎn)量依舊較低（約2 mg/L），且kcat/Km值比Butelase 1轉(zhuǎn)肽酶低2個(gè)數(shù)量級(jí)，經(jīng)過(guò)酶工程改造后也僅能達(dá)到后者的三分之一［50］。獲取困難成為了當(dāng)下Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶以及同家族連接酶推廣過(guò)程的最大障礙，繼續(xù)挖掘同家族的新酶是現(xiàn)階段的一個(gè)重要研究方向。

1.3 Subtilisin 人工連接酶

圖3 Butelase 1轉(zhuǎn)肽酶的催化過(guò)程及應(yīng)用示意圖［26，42，45-47］Fig.3 The catalysis process of Butelase 1 and its applications［26，42，45-47］

Subtilisin 是來(lái)自解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的絲氨酸蛋白酶，具有六個(gè)廣譜的氨基酸殘基識(shí)別口袋，最初作為一種具有廣泛切割位點(diǎn)的蛋白水解酶而受到關(guān)注。早在20 世紀(jì)60 年代，Bender 團(tuán)隊(duì)［51］即使用化學(xué)方法將Subtilisin 的關(guān)鍵活性基團(tuán)從Ser 轉(zhuǎn)變?yōu)镃ys（S221C），得到的人工連接酶Thiolsubtilisin 在50% DMF 溶液中展現(xiàn)出了多肽連接酶的活性，但在水溶液中效率極為低下［52］。隨著定點(diǎn)突變技術(shù)的發(fā)展，Wells團(tuán)隊(duì)［53］獲得了重組表達(dá)的多肽連接酶Subtiligase，在S221C 之外還引入了P225A 突變來(lái)降低活性中心的空間位阻，將該酶的連接活性提高了1 個(gè)數(shù)量級(jí)且水解活性降低了2 個(gè)數(shù)量級(jí)，從此奠定了Subtilisin 人工連接酶的基本形態(tài)。之后Wells 團(tuán)隊(duì)［54］開(kāi)展了一系列酶工程研究，先是額外引入5 個(gè)突變位點(diǎn)（M50F/N76D/N109S/K213R/N218S）以提高連接酶的穩(wěn)定性，使得連接酶在4 mol/L 鹽酸胍的環(huán)境中依舊能保留50%的活性；后續(xù)又在噬菌體表面展示技術(shù)［55］以及蛋白質(zhì)組技術(shù)［56］的輔助下，改造得到一系列具有不同序列識(shí)別偏好的Subtiligase 突變體，從而擴(kuò)展P1'與P2'口袋的底物譜。

相比SrtA 轉(zhuǎn)肽酶和Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶，Subtilisin 人工連接酶對(duì)連接位點(diǎn)的序列限制更少，不會(huì)出現(xiàn)“疤痕”序列［圖4（a）］，因此具有更廣闊的應(yīng)用范圍。早在1994 年，Wells 團(tuán)隊(duì)［57］便利用Subtiligase 將6 個(gè)多肽片段（每段長(zhǎng)度在11～31個(gè)殘基）拼接為含有124個(gè)氨基酸殘基的核糖核酸酶A，酰基供體多肽N 端被異煙堿（isonicotinyl，iNOC）基團(tuán)保護(hù)以防止重復(fù)拼接，每輪連接反應(yīng)后去除保護(hù)基來(lái)進(jìn)行下一輪的連接［圖4（b）］，這比NCL 方法更早地實(shí)現(xiàn)了將多個(gè)多肽片段拼接為完整蛋白質(zhì)［57］。Subtiligase還被用于環(huán)化長(zhǎng)度在12～31 個(gè)氨基酸殘基的多肽［圖4（c）］［58］，在內(nèi)含肽的輔助下可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)C 端的無(wú)痕拼接，例如Cole 等［59］利用Subtiligase催化重組表達(dá)的泛素硫酯與合成的十肽-生物素（GLSGRGKGGK-Biotin）的連接，解除了酰基受體肽N 端必須為半胱氨酸殘基的限制［圖4（d）］。不過(guò)Subtiligase目前最主要的應(yīng)用方向仍是蛋白質(zhì)N端修飾，Wells團(tuán)隊(duì)［60］建立了一個(gè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水解酶研究平臺(tái)，首先用Subtiligase 將帶有生物素標(biāo)簽的多肽連接在混合蛋白樣品的N 端［圖4（e）］，再用待研究的蛋白水解酶處理樣品，酶切后用親和素富集帶有生物素標(biāo)簽的樣品N 端片段，最后進(jìn)行HPLC-MS/MS 分析［60］。生物素標(biāo)記與親和素富集的操作實(shí)現(xiàn)了酶解多肽片段的正向篩選，該平臺(tái)可以幫助研究人員發(fā)現(xiàn)特定蛋白水解酶在細(xì)胞中的潛在靶標(biāo)蛋白與切割位點(diǎn)。

除Subtiligase 之外，該家族的另一成員的研究也在近年獲得突破。荷蘭帝斯曼集團(tuán)與格羅寧根大學(xué)合作，篩選了來(lái)自八十余種古菌和細(xì)菌的上百種Subtilisin 家族蛋白酶，確定了一個(gè)不依賴(lài)鈣離子且高度穩(wěn)定的模板蛋白，并對(duì)其活性中心進(jìn)行改造設(shè)計(jì)，創(chuàng)制了一種新型多肽連接酶Peptiligase［4，61］。與Subtiligase 相比，Peptiligase 的折疊不依賴(lài)前體肽，表達(dá)量大幅提高且連接活性更高（酶用量可低至多肽底物物質(zhì)的量的萬(wàn)分之三），還具有適用于工業(yè)生產(chǎn)的極高穩(wěn)定性，足以耐受60 ℃的高溫、高濃度DMF 與鹽酸胍。后續(xù)帝斯曼集團(tuán)將該部分業(yè)務(wù)獨(dú)立，組建了全世界第一家應(yīng)用生物法合成多肽與蛋白質(zhì)的商業(yè)公司——Enzypep公司。通過(guò)對(duì)Peptiligase 的深入研究與改造，Enzypep公司推出了新一代廣譜連接酶Omniligase-1，為低序列限制的通用多肽拼接策略提供了優(yōu)秀的工具酶［62］。在多肽藥物Exenatide 百克級(jí)合成過(guò)程中［圖4（f）］，Omniligase-1 催化下的兩段多肽拼接效率達(dá)到88%，總產(chǎn)率是原先固相合成法單次合成完整多肽的兩倍，展現(xiàn)了該酶極為突出的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值［63］。Omniligase-1 亦可與二硫鍵構(gòu)筑［64］、點(diǎn)擊化學(xué)［65］、肟連接（oxime ligation）［66］等方法聯(lián)用以合成具有多環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)肽。不只是廣譜連接酶，Enzypep 公司還推出了針對(duì)特定藥物多肽序列的連接酶，例如專(zhuān)門(mén)用于生產(chǎn)Thymosin-α1的Thymoligase，該酶在P1 位特異識(shí)別帶正電氨基酸，在P1'位特異識(shí)別帶負(fù)電氨基酸，兩段多肽底物的拼接效率高達(dá)94%，最終產(chǎn)率相比原有生產(chǎn)工藝提升了兩倍［67］。Peptiligase 系列連接酶在連接/水解比、反應(yīng)活性、底物序列限制等多個(gè)方面突破了工業(yè)化瓶頸，使多種藥物多肽的生產(chǎn)成本下降了60%～80%，顯著的工業(yè)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)讓Peptiligase 系統(tǒng)被視為目前酶促多肽拼接領(lǐng)域最受矚目的技術(shù)平臺(tái)［68］，針對(duì)不同應(yīng)用方向來(lái)改造獲得滿(mǎn)足不同序列需求的突變體依舊是其未來(lái)的主要發(fā)展方向。

2 總結(jié)與展望

圖4 Subtiligase/Peptiligase的催化過(guò)程及應(yīng)用示意圖［7，26，57-60，63］Fig.4 The catalysis process of Subtiligase/Peptiligase and its applications［7，26，57-60，63］

蛋白質(zhì)重組表達(dá)與多肽固相合成技術(shù)在摻入非天然氨基酸、蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)適用性與多肽合成長(zhǎng)度等方面都存在一定的限制，多肽連接技術(shù)可以將多個(gè)短肽連接成較長(zhǎng)的肽段，同時(shí)解決了非天然氨基酸修飾與蛋白質(zhì)合成長(zhǎng)度的問(wèn)題，而其中酶促多肽連接法由于其獨(dú)特的區(qū)域選擇性與立體選擇性在蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域發(fā)揮著愈加重要的作用。近年來(lái)三種酶促多肽拼接策略經(jīng)過(guò)優(yōu)化與發(fā)展，各自具有其適合的應(yīng)用場(chǎng)合（表1）。SrtA轉(zhuǎn)肽酶可通過(guò)重組表達(dá)獲得，也可以通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)，在蛋白質(zhì)末端修飾方面便于使用，是目前應(yīng)用案例最多的多肽連接酶，但在連接產(chǎn)物中會(huì)保留數(shù)個(gè)氨基酸殘基的連接“疤痕”，不適合用于特定序列多肽或蛋白質(zhì)的合成。Butelase 1 轉(zhuǎn)肽酶活性較高，拼接位點(diǎn)的序列限制比SrtA 轉(zhuǎn)肽酶少，連接后殘留的“疤痕”較短，適合催化多肽與蛋白質(zhì)的環(huán)化。然而該酶目前還無(wú)法通過(guò)重組表達(dá)制備，研究所用的酶需要從植物中獲得，每千克的植物材料約能提取出5 mg 酶，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，這成為該酶應(yīng)用的主要限制因素。Subtilisin 人工連接酶則在拼接位點(diǎn)序列限制方面優(yōu)于前兩種酶，只需要底物C末端活化為氧酯或硫酯而無(wú)需具備特定的氨基酸序列，雖然該酶的6個(gè)氨基酸殘基識(shí)別口袋具有不同的氨基酸偏好性，但經(jīng)過(guò)多年的研究?jī)?yōu)化，該系列酶已經(jīng)產(chǎn)生了較多廣譜突變體，并能整合具有互補(bǔ)選擇性的連接酶突變體，建立的酶工具箱用于不同領(lǐng)域，功能最為全面［61］。并且Peptiligase系列商品酶是當(dāng)下唯一能在工業(yè)級(jí)合成中使用的酶，不過(guò)這些商品酶大多價(jià)格高昂且序列保密，尚未普遍推廣。三類(lèi)酶促多肽拼接策略依舊具有較大的優(yōu)化空間，研究者不僅可以聯(lián)用化學(xué)和酶促方法來(lái)實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，建立不同的生物合成技術(shù)路線(xiàn)，還可以通過(guò)酶工程改造來(lái)提升連接酶的性能，過(guò)去三十年在這一方向已出現(xiàn)大量的理性設(shè)計(jì)與定向進(jìn)化成果。而隨著運(yùn)算能力大幅提升以及先進(jìn)算法不斷涌現(xiàn)，近年來(lái)蛋白質(zhì)計(jì)算設(shè)計(jì)得到了極大的發(fā)展，蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)的時(shí)代已經(jīng)到來(lái)［69］。在蛋白質(zhì)人工合成與蛋白質(zhì)計(jì)算設(shè)計(jì)這兩個(gè)領(lǐng)域相逢之際，計(jì)算機(jī)輔助手段既可以指導(dǎo)新型連接酶的設(shè)計(jì)與改造，提升連接/水解比，又能夠幫助設(shè)計(jì)具有特殊修飾的非天然蛋白質(zhì)［70］，為酶促多肽拼接策略開(kāi)拓嶄新的應(yīng)用場(chǎng)景。無(wú)論是化學(xué)方法與酶促策略的結(jié)合，還是人工合成與計(jì)算設(shè)計(jì)的相遇，均是不同領(lǐng)域的碰撞而閃現(xiàn)出的火花，深刻體現(xiàn)了學(xué)科交叉的意義與價(jià)值。相信在越來(lái)越多潛在相關(guān)領(lǐng)域的研究人員參與后，未來(lái)酶促多肽拼接策略的技術(shù)方法能再上一層臺(tái)階，應(yīng)用于更多的多肽環(huán)化、蛋白質(zhì)修飾乃至蛋白質(zhì)全合成研究項(xiàng)目。

表1 三類(lèi)酶促連接策略以及NCL方法的比較Tab.1 Comparison between NCL method and three enzymatic strategies