轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶改性大豆分離蛋白的溶解性研究

張志衡，王升楠，盧亞東，李玉娥，陳振家

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西太谷 030801）

大豆不僅是一種優(yōu)良的油料作物，更是一種理想的食用蛋白質(zhì)資源，隨著社會(huì)的進(jìn)步與經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們?cè)絹碓綇?qiáng)的健康意識(shí)促進(jìn)了大豆相關(guān)食品市場(chǎng)的活躍，其中大豆分離蛋白（SPI）是大豆蛋白產(chǎn)品中極為重要的產(chǎn)品之一，大豆分離蛋白作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)，蛋白濃度極高，營(yíng)養(yǎng)成分均衡，富含人體必需的氨基酸，在機(jī)體內(nèi)的消化利用率高，適當(dāng)?shù)靥砑涌商岣呤称返牡鞍坠πП戎怠４蠖狗蛛x蛋白亦具有良好的溶解性、起泡性、乳化性等功能特性，這些特性在食品加工中起著決定性作用[1]。因而對(duì)SPI 的深入研究至關(guān)重要。

由于當(dāng)前SPI 在食品加工中某些功能特性的兼容性較差，且很難同時(shí)兼具多種功能，而生產(chǎn)上需求的卻是專項(xiàng)最佳功能或兼具幾種功能平衡的產(chǎn)品。因此，需對(duì)其進(jìn)行改性處理。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（簡(jiǎn)稱TG）是一種催化轉(zhuǎn)酰基酶，它能催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε-氨基與谷氨酸上γ-羥酰胺基之間發(fā)生聯(lián)合反應(yīng)，聚合蛋白多肽形成共價(jià)聚合物。而TG 酶交聯(lián)能改變SPI 的溶解性、凝膠特性、疏水性等性質(zhì)，利用TG 酶交聯(lián)改性大豆分離蛋白，使SPI 的空間結(jié)構(gòu)和功能特性得以改變，能夠滿足人們的生產(chǎn)要求[2]。如改性后蛋白產(chǎn)物中小分子肽組分含量高，比氨基酸蛋白質(zhì)更易于被人體消化吸收；改性后的大豆蛋白具有更高的應(yīng)用價(jià)值，可以拓寬SPI 在食品工業(yè)中作為配料應(yīng)用的范圍。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)TG 酶交聯(lián)改性SPI 的功能特性已有一定的研究，但溫度、pH、鹽離子濃度對(duì)改性SPI 溶解性影響的研究卻寥寥無幾，再者，溶解性作為食品的主要功能特性，具有很重要的研究?jī)r(jià)值。本研究以脫脂豆粕為原料制備SPI 和MSPI，研究它們分別在不同溫度、pH 和鹽離子濃度下改性前后大豆分離蛋白的溶解性，并使用SDS-PAGE 電泳技術(shù)對(duì)改性后的大豆分離蛋白組分進(jìn)行了亞基分析，探究改性前后大豆分離蛋白聚集特性的變化，旨在為改性大豆分離蛋白在食品中的應(yīng)用提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 大豆脫脂豆粕（購于金源糧油工業(yè)有限責(zé)任公司，蛋白質(zhì)＞51%）；轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、NaCl、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、無水乙醇、巰基乙醇、丙烯酰胺、甲雙叉丙烯酰胺、SDS、溴酚藍(lán)、過硫酸銨、低分子量Marker（14.4～97.4 ku）、四甲基乙二胺、Tris（分析純）。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 DYY-7C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；可見分光光度計(jì)（上海菁華科技有限儀器公司）；HH 系列數(shù)顯恒溫水浴鍋、磁力加熱攪拌器（金壇市科析儀器有限公司）；HC-2064 高速離心機(jī)、大容量低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；高剪切分散機(jī)（德國(guó)IKA 公司）；精密增力電動(dòng)攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019 年12 月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院糧油實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 大豆分離蛋白樣品的制備 將脫脂豆粕與水按1∶10（m∶V）比例混合，調(diào)pH 值至8.5，攪拌2 h 后紗布過濾，過濾液4 000 r/min 離心20 min，上清液調(diào)pH 值至4.5，靜置15 min 后離心，水洗沉淀2 次；沉淀加水復(fù)溶至pH 值7.0 后，冷凍干燥后備用。

1.2.2 TG 酶改性大豆分離蛋白樣品的制備 將脫脂豆粕與水按1∶10（m∶V）比例混合，調(diào)pH 值至8.5，攪拌2 h 后紗布過濾，過濾液4 000 r/min 離心20 min，上清液調(diào)pH 值至4.5，靜置15 min 后離心，水洗沉淀2 次；沉淀加水復(fù)溶至pH 值7.0 后，加入0.5%（m酶∶m溶液）TG 酶，50 ℃水浴反應(yīng)2 h，之后沸水浴5 min 滅酶。調(diào)pH 值至4.5，離心，棄上清液，沉淀水洗2 次，復(fù)溶至中性，冷凍干燥后備用。

1.2.3 溶解性單因素試驗(yàn) 將蛋白樣品分散于蒸餾水中配制質(zhì)量濃度為1%的溶液，在一定的溫度下用恒溫磁力攪拌器攪拌30 min，調(diào)整pH 值，稱取一定質(zhì)量的NaCl，并攪拌10 min 至溶解，取1 mL樣品離心（10 000 r，10 min），適當(dāng)稀釋一定倍數(shù)，取100 μL 樣品與5 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液混合[3]，用分光光度計(jì)在595 nm 下測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的含量。溫度分別設(shè)為50、60、70、80、90、100 ℃共6 個(gè)水平，pH 值分別設(shè)為2、3、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12 共12 個(gè)水平，鹽離子濃度分別設(shè)為0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L 共13 個(gè)水平。

1.2.4 大豆分離蛋白組分SDS-PAGE 電泳 溶解度測(cè)定完成后，分別取上述不同處理蛋白樣品中的上清液和底部沉淀制備電泳樣品，上清液和沉淀的添加量不超過1 mg/mL（m蛋白：m電泳液），本試驗(yàn)要分析二硫鍵的變化規(guī)律，因此，需添加2%β 巰基乙醇作還原處理進(jìn)行對(duì)比。SDS -PAGE 電泳采用LAEMMLI[4]的方法，制得的分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，上樣量5 μL，恒壓電泳，電流為40 mA，濃縮膠電壓為100 V，分離膠電壓為150 V。電泳完畢，固定3 h 并染色，染色2.5 h 后脫色，然后用掃描儀進(jìn)行掃描，并分析圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Orign 8.0 軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下MSPI 和SPI 溶解性的比較

由圖1 可知，經(jīng)TG 酶改性后的MSPI 溶解性明顯下降。改性前后SPI 的溶解性在50～70 ℃內(nèi)均增大，在70～100 ℃內(nèi)隨溫度升高而下降。有研究表明[5]，蛋白質(zhì)進(jìn)行適當(dāng)?shù)臒崽幚頃?huì)出現(xiàn)離解和開鏈現(xiàn)象，增強(qiáng)了水合能力，溶解度增大。但是當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃以上時(shí)，肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，大量疏水性基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)表面并且蛋白質(zhì)分子間互相纏繞，促進(jìn)了蛋白質(zhì)分子的聚集和沉淀，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度下降，因此，在70 ℃時(shí)蛋白含量達(dá)到峰值。同時(shí)，因?yàn)樵诖蠖狗蛛x蛋白交聯(lián)過程中分子間或分子內(nèi)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，使小分子物質(zhì)聚集成大分子物質(zhì)，形成了以G-L 鍵連接的更加穩(wěn)定的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不易與水結(jié)合，因此，MSPI 的溶解性較SPI 低。

2.2 不同pH 值梯度下MSPI 和SPI 溶解性的比較

由圖2 可知，在不同pH 條件下的MSPI 的溶解性明顯低于SPI。SPI 和MSPI 曲線雖均呈先下降后上升趨勢(shì)，但MSPI 的溶解性對(duì)pH 的敏感度較SPI 低。2＜pH＜4.5 時(shí)，溶解性均逐漸下降；4.5＜pH＜12 時(shí)，溶解性均逐漸上升，在等電點(diǎn)（pH 值4.5）附近時(shí)，SPI 和MSPI 的溶解性最差，究其原因是，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)，溶液正負(fù)電荷達(dá)到平衡，蛋白質(zhì)分子間的排斥力很小，更容易形成大的不溶性聚集體，因此，溶解度最低；當(dāng)遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，平衡被打破，在較酸或較堿環(huán)境下，蛋白質(zhì)溶液帶正電荷或負(fù)電荷，蛋白質(zhì)分子間的排斥力增大，體系分散性越好，則溶解性越好。MSPI 溶解性明顯低于SPI，原因是經(jīng)過TG 酶改性后，大豆蛋白分子內(nèi)或分子間形成了以共價(jià)鍵（G-L 鍵）連接的共聚物，使其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這與張海均[6]等的研究結(jié)果一致。

2.3 不同鹽離子濃度下MSPI 和SPI 溶解性的比較

由圖3 可知，在不同鹽離子濃度下MSPI 的溶解性明顯低于SPI；MSPI 和SPI 的溶解性隨鹽離子濃度的變化趨勢(shì)相似，均呈先升高后降低的趨勢(shì)，在鹽離子濃度為0.05 mol/L 時(shí)，SPI 和MSPI 的溶解性最大。鹽離子濃度大于0.05 mol/L 后，MSPI 和SPI 的溶解性逐漸降低，究其原因是，隨著鹽離子濃度的增加，鹽離子大量中和蛋白質(zhì)顆粒上的電荷，降低了蛋白分子間排斥力，從而使蛋白質(zhì)顆粒更容易聚集形成沉淀析出，即鹽析效應(yīng)[7-8]。

2.4 不同溫度下MSPI 上清與沉淀的電泳圖譜

從圖4 可以看出，在非還原電泳圖譜中，MSPI上清液中的亞基主要分布在相對(duì)分子質(zhì)量14.4～97.4 ku 之間，在此區(qū)間的亞基條帶顏色隨溫度升高越來越淺，這與MSPI 在不同溫度下溶解度的變化趨勢(shì)相符。在還原電泳圖譜中，上清液中的亞基主要分布在14.4～97.4 ku和大于97.4 ku，各泳道濃縮膠消失，AB-11S 亞基完全消失，說明這些亞基是通過二硫鍵連接形成的；各亞基條帶的顏色隨溫度的升高逐漸加深，推測(cè)是由于AB-11S 亞基的斷裂形成了這些新的亞基。

在非還原電泳圖譜中，MSPI 沉淀中的亞基主要分布在66.2～97.4 ku和大于97.4 ku的區(qū)間。各泳道的濃縮膠和14.4～97.4 ku的亞基條帶顏色隨溫度的增加逐漸變淺。在14.4～22、31～43 ku的亞基條帶顏色非常淺。在還原電泳圖譜中，大于97.4 ku的亞基條帶顏色變淺，各泳道的濃縮膠消失，AB-11S亞基完全消失；各泳道亞基條帶顏色隨溫度升高逐漸變淺，這對(duì)應(yīng)了上清中的亞基變化規(guī)律；在31～43、14.4～22 ku的亞基顏色明顯變深，推測(cè)是AB-11S 亞基斷裂形成了這些新的亞基[9]。

2.5 不同pH 下MSPI 上清與沉淀電泳圖譜

由圖5 可知，3、4、5 泳道的亞基條帶顏色很淺，說明在此區(qū)間蛋白溶解度很低，這與MSPI 在等電點(diǎn)附近的溶解性一致。在非還原電泳圖譜中，MSPI上清中的蛋白亞基主要分布在43～97.4 ku和大于97.4 ku的區(qū)間。MSPI 的亞基條帶對(duì)于pH 變化較為敏感，pH 值為3 時(shí)顏色較淺，pH 值2、11、12 時(shí)亞基條帶顏色較深，pH 值在6～10 時(shí)，亞基條帶的顏色隨pH 值的升高逐漸加深。在還原電泳圖譜中，相對(duì)分子質(zhì)量在66.2～97.4 ku及大于97.4 ku的亞基條帶顏色明顯變淺，在14.4 及31 ku附近的亞基消失，在52～68 ku的AB-11S 亞基消失，說明這些亞基主要是通過二硫鍵形成；在31～43 ku的A-11S亞基和14.4～22 ku的B-11S 亞基顏色加深，推測(cè)是由于AB-11S 亞基斷裂形成，這與DING 等[10]研究結(jié)果相符。

從圖6 可以看出，無論是在非還原還是還原條件下，3、4、5 三條泳道的顏色最深，說明等電點(diǎn)附近沉淀中的蛋白含量最高，對(duì)應(yīng)了圖5 上清中蛋白溶解度，再次印證了等電點(diǎn)附近溶解度變化規(guī)律。在非還原電泳圖譜中，MSPI 沉淀的亞基主要分布在43～97.4 ku，pH 值為3 時(shí)亞基條帶顏色最淺，pH 值4 時(shí)顏色最深，pH 值在4～10 時(shí)，各亞基條帶顏色隨pH 增加越來越淺；與圖5 相比，A-11S 亞基和B-11S 亞基的顏色在圖5 中較深，在圖6 中較淺，說明A-11S 亞基和B-11S 亞基主要存在于上清中，為可溶性單體。在還原電泳圖譜中，AB-11S亞基和大于97.4 ku的亞基顏色明顯變淺，說明這些亞基主要是通過二硫鍵連接形成；同樣，pH 值在4～10 的亞基條帶隨pH 增加顏色逐漸變淺，在14.4～22 ku出現(xiàn)新的亞基，這可能是11S 蛋白亞基斷裂形成的，與部分學(xué)者得出的結(jié)果一致[11]。

2.6 不同鹽離子濃度下MSPI 上清和沉淀的電泳圖譜

從圖7 可以看出，在非還原電泳圖譜中，MSPI的上清蛋白亞基主要分布在43～97.4 ku。隨著鹽離子濃度的增加，條帶顏色逐漸變淺，說明隨著鹽離子濃度的增加，MSPI 的溶解度逐漸降低，這與圖3 中MSPI 的溶解性變化曲線相符；不同鹽離子濃度條件下，上清液中的蛋白亞基種類沒有發(fā)生改變，說明鹽離子濃度的變化不會(huì)改變MSPI 上清中的亞基分布。在還原電泳圖譜中，各泳道濃縮膠消失，相對(duì)分子質(zhì)量大于97.4 ku及43～97.4 ku的亞基除了α′和α亞基外顏色均變淺，AB-11S 亞基完全消失，說明這些亞基主要是由二硫鍵形成的；在31～43、14.4～22 ku的亞基顏色變深，在14.4 ku 附近出現(xiàn)新的亞基條帶，推測(cè)是由于AB-11S 亞基斷裂形成的，且隨著鹽離子濃度的增加，各濃度亞基條帶的顏色基本一致。

從圖8 可以看出，在非還原電泳圖譜中，鹽離子濃度為0.6 mol/L 時(shí)亞基條帶顏色最淺，其余泳道的亞基條帶顏色基本保持一致。對(duì)比圖7 發(fā)現(xiàn)，在66.2～97.4 ku和大于97.4 ku的亞基在圖8 中顏色加深，說明這些亞基主要是以不溶性聚集體的形式存在。在還原電泳圖譜中，各泳道濃縮膠消失，AB-11S 亞基完全消失，大于97.4 ku的亞基條帶顏色變淺，說明這些亞基主要是由二硫鍵連接形成的。在66.2～97.4、31～43、14.4～22 ku的亞基顏色明顯變深，14.4 ku附近出現(xiàn)新的亞基，推測(cè)是AB-11S亞基斷裂形成了這些新的亞基。同樣是在鹽離子濃度為0.6 mol/L 時(shí)，條帶顏色最淺，其余泳道的條帶顏色基本保持一致，整體比未加入β 巰基乙醇時(shí)的顏色更深。

3 結(jié)論與討論

大豆分離蛋白經(jīng)TG 酶交聯(lián)后形成了以G-L鍵連接的更加穩(wěn)定的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因此，在不同溫度、pH、鹽離子濃度下，MSPI 的溶解性均低于SPI，在食品行業(yè)中可以用以改善因蛋白質(zhì)溶解酸敗而出現(xiàn)的食品問題，具有重要的研究?jī)r(jià)值。隨著溫度的升高，MSPI 的溶解度呈先上升后下降的趨勢(shì)，在70 ℃時(shí)溶解度最高，80～100 ℃溶解度變化不大。MSPI 的溶解度隨pH 值的增加呈先下降后上升的趨勢(shì)且明顯低于SPI，在pH 值4.5 即等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低。MSPI 的溶解度在鹽離子濃度大于0.05 mol/L時(shí)有著小幅度上升，后隨鹽離子濃度的升高而下降。本試驗(yàn)結(jié)果與大多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相似，不足之處在于試驗(yàn)方法單一，還有待進(jìn)一步研究。

從非還原狀態(tài)下的MSPI 電泳圖譜中可以明顯看出，有6 條亞基：α′、α、β、AB、A、B 亞基。相對(duì)分子質(zhì)量在14.4～22 ku 的B-11S 亞基在不同溫度下主要是以可溶性粒子形式存在于上清液中；MSPI在等電點(diǎn)附近時(shí)主要以沉淀形式存在；鹽離子濃度的增加不會(huì)改變MSPI 溶液中的亞基分布。在加入β 巰基乙醇后，AB-11S 亞基的二硫鍵斷裂，生成其他新的亞基。本試驗(yàn)結(jié)果與部分學(xué)者的研究結(jié)果相似，不足之處在于試驗(yàn)存在一定的誤差，可通過多次試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)來改善。