不同pH 和離子強度對蕎麥蛋白功能特性的影響

張雪冰，王曉聞，盧亞東，張志衡，陳振家

（山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷 030801）

蕎麥屬禾谷類作物，在世界各地廣泛種植，耐寒，在土地貧瘠的地方依然可以良好的生長，其主要有甜蕎和苦蕎2 種栽培品種[1-3]。蕎麥營養(yǎng)成分豐富，蕎麥蛋白含量為15%～17%。蕎麥蛋白是一種天然活性成分，其賴氨酸含量較高，在降血糖、降血脂、提高人體免疫力方面發(fā)揮著重要作用[4-6]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥的蛋白質含量豐富，比禾谷類含量高[7]。蕎麥蛋白和大豆蛋白相似，具有良好的起泡性、乳化性、持水性等特性。蕎麥蛋白的人體必需氨基酸配比合理，種類齊全，是一種全價蛋白，營養(yǎng)價值高[8]，具有生物保健功能[9]。蕎麥蛋白有降低血液中膽固醇、抑制脂肪積蓄、改善便秘、抗衰老以及抑制有害物質的吸收等生理作用[10]。目前，蕎麥加工制品主要是利用傳統(tǒng)加工方式制成的產品，如蕎麥面、蕎麥粥等，且對蕎麥的利用研究較少[11]。由傳統(tǒng)加工方式制成的蕎麥產品并不能完全發(fā)揮蕎麥的營養(yǎng)價值。

本試驗對蕎麥蛋白功能特性及亞基組分進行研究，充分了解其加工功能特性，為更好地利用蕎麥中的蛋白質提供一定的理論基礎，進一步明確蛋白在食品加工中的適宜性，為開發(fā)滿足消費者需要的新產品提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蕎麥品種為晉蕎2 號，由山西省農業(yè)科學院農產品加工研究所提供。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、濃硫酸、石油醚、無水乙醇、甲醇均為分析純，購買于天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；考馬斯亮藍G250、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、四甲基乙二胺、過硫酸銨、β-巰基乙醇、溴酚藍、氫氧化鉀、甘油、低分子量蛋白質Marker，購買于北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 試驗儀器 DYY-7C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；UV-1200 型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；HSJ 系列恒溫水浴攪拌器（江蘇科析儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-III 循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；TS-2000 多用脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；HC-2064高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；高剪切分散乳化機（德國IKA 公司）；JJ-1 大功率電動攪拌器（常州國華電器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蕎麥蛋白的提取 蕎麥粉碎后與石油醚按1∶5（m/V）混合，攪拌8 h 后抽濾，靜置沉淀，待石油醚揮發(fā)完全后即為蕎麥脫脂粉。采用堿提酸沉法將脫脂蕎麥粉與蒸餾水按1∶10（m/V）混合，pH 值8.5、50 ℃恒溫攪拌2 h，離心除去不溶物，上清液調pH 值至4.0，離心取沉淀，水洗沉淀3 次，回調pH至中性，冷凍干燥備用[12]。

1.3.2 不同pH 和離子強度蛋白溶液的制備 配制1%的蛋白溶液攪拌均勻后，調節(jié)溶液pH 值（2、3、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12）和稱取氯化鈉以配備不同濃度（0.01、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00 mol/L）的鹽離子溶液，室溫攪拌1 h 后，10 000×g 離心10 min 后取上清液。

1.3.3 蕎麥蛋白溶解度的測定 采用考馬斯亮藍法測定不同pH 和離子強度的蛋白溶液濃度[13]。

1.3.4 蕎麥蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定 將不同pH 和離子強度蛋白溶液轉至離心管與5 mL的大豆油混合，再用勻漿機以4 檔位轉速將制得溶液均質2 min，靜置，分別與0、30 min 時在離心管底部取20 μL 乳化液與5 mL 0.1%的SDS 溶液均勻混合，在500 nm 波長下測定吸光度值[14]。根據(jù)公式（1）、（2）計算燕麥蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

式中，A0為0 min 時的吸光度；N 為稀釋倍數(shù)；c 為樣品濃度（g/mL）；Φ 為乳化液中油相的比例（0.25）；L 為比色杯光徑（1 cm）；A1為30 min 時的吸光度；t 為30 min（時間間隔）。

1.3.5 SDS-PAGE 電泳 依照LAEMMLI[15]的方法。濃縮膠濃度和分離膠濃度分別為5%和12%，樣品上樣量為5 μL。恒壓電泳，電流為16 mA，濃縮膠電壓和分離膠電壓分別為100、150 V。電泳結束后，電泳膠片先固定3 h，再染色，脫色結束后成像儀成像。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗采用Excel 2010 和Origin 8.0 進行數(shù)據(jù)處理與制圖。

2 結果與分析

2.1 pH 對蕎麥蛋白溶解度的影響

惠麗娟[16]的研究表明，蕎麥蛋白的溶解性在不同pH 條件下處理制得的曲線基本為“V”字形，即在等電點附近溶解度最低，在堿性和偏酸性條件下溶解度較好。阮景軍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥蛋白的溶解性在pH 值＜3.0 以及pH 值＞5.0 時，其溶解性增加。

由圖1 可知，蕎麥蛋白的溶解度在等電點兩側呈上升趨勢，在等電點附近的溶解性較差。pH 值在2～4 時，蛋白溶解度隨pH 值升高而降低，但在pH值為4.5 時有小幅度增加，pH 值在4.5～12 時，蛋白溶解度隨pH 值升高而升高，pH 值在12 時達到最大。影響蛋白質溶解性的主要因素是分子間的疏水相互作用和氫鍵共同影響的結果[18]。疏水相互作用使蛋白質分子間相互分離，降低了蛋白質溶解度；而離子間相互作用則可以促進蛋白質與溶劑相互作用，使其溶解度提高。在等電點兩側的pH 值環(huán)境下，溶液中靜電荷總量增加，離子間相互作用明顯，蕎麥蛋白的溶解度達到最大值；在弱酸環(huán)境下，蛋白質在溶劑中的疏水相互作用強于離子作用力，蛋白質分子疏水基團在外側，與溶劑中的水分子相互排斥，導致蛋白質的溶解度降低。

2.2 離子強度對蕎麥蛋白溶解度的影響

蛋白質的溶解性質影響其增稠、起泡、乳化和凝膠等功能特性，且蛋白質溶解性會影響其在食品中的應用[19]。從圖2 可以看出，隨著電解質氯化鈉的加入，在鹽離子濃度低于0.4 mol/L 時，蕎麥蛋白的溶解度與鹽離子濃度沒有線性關系，較低濃度的鹽離子不足以改變蕎麥蛋白的溶解度；蕎麥蛋白在鹽離子濃度0.4 mol/L 時溶解度最大，是因為鹽離子與蛋白質分子的親水基團相結合，增強了蛋白質與水分子間的結合，從而使蕎麥蛋白的溶解度增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶；當鹽離子濃度高于0.4 mol/L時，蕎麥蛋白溶解度隨鹽離子濃度增大而逐漸降低，這是因為過高濃度的鹽溶液使得蛋白溶液出現(xiàn)鹽析的現(xiàn)象，并伴隨著蛋白質的析出，降低其溶解度。就整體而言，在鹽離子濃度為0～1.0 mol/L 時，鹽離子濃度對于蕎麥蛋白的溶解度影響不大，其波動范圍只有10%左右[20]。

2.3 pH 對蕎麥蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

陶健等[21]研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥分離蛋白在堿性條件下有比較好的乳化性，在偏酸性條件下有比較好的乳化穩(wěn)定性。BEJOSANO 等[22]研究表明，蕎麥蛋白具有良好的乳化性。

從圖3 可以看出，在pH 值為2 和12 時，蕎麥蛋白有較好的乳化性；在pH 值為2～4.5 時，蕎麥蛋白的乳化性大幅下降；在pH 值為4.5～6 時，蕎麥蛋白的乳化性呈上升趨勢；在pH 值為6～7 時，蕎麥蛋白的乳化性開始下降；在pH 值為8～11 時，蕎麥蛋白的乳化性基本趨于穩(wěn)定；在pH 值為11～12 時，蕎麥蛋白的乳化性上升到最大值。由于蛋白質的乳化能力首先取決于溶解度，溶解度越大，蛋白質與油相產生的乳化作用越明顯，其乳化能力也就越大，所以，出現(xiàn)這種趨勢的原因可能是因為pH 對蕎麥蛋白溶解度的趨勢也呈現(xiàn)這樣的變化[23]。試驗結果表明，蕎麥蛋白的乳化穩(wěn)定性隨著其乳化活性的變化而變化，乳化活性越大，乳化穩(wěn)定性越好。

2.4 離子強度對蕎麥蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

從圖4 可以看出，蕎麥蛋白的乳化活性在離子強度0.01～0.1 mol/L 時增加，在0.1～0.4 mol/L 時降低，在0.4～0.6 mol/L 時增加，在鹽離子濃度高于0.6 mol/L 時，蕎麥蛋白的乳化活性呈降低趨勢；蕎麥蛋白的乳化穩(wěn)定性的變化趨勢與溶解度變化相一致，離子強度在0.3 mol/L 時表現(xiàn)的乳化穩(wěn)定性最好?？傮w看來，鹽離子濃度對蕎麥蛋白的乳化穩(wěn)定性的影響相對較小。

2.5 不同pH 條件下蕎麥蛋白SDS-PAGE 分析

由圖5 可知，非還原電泳圖譜的濃縮膠和分離膠頂端出現(xiàn)的亞基條帶和分布在43～66.2 ku 范圍內的亞基，在還原電泳圖譜中消失，說明這些亞基是部分小分子量亞基通過二硫鍵所形成。還原電泳圖譜中，在31～43 ku 范圍內亞基條帶的增加和14.4～22 ku 范圍內亞基條帶顏色的加深，說明它們通過分子間或分子內二硫鍵形成了分子量較大的可溶性聚集體。無論是非還原電泳還是還原電泳，圖譜中22～31 ku 范圍的亞基條帶在pH 值6～12范圍內，隨pH 值增加而逐漸加深，結合溶解度曲線（圖1），說明這些亞基在堿性環(huán)境中溶解性更好。而還原電泳圖譜中43～66.2 ku 范圍內的亞基在酸性條件下顏色很淺，說明其在酸性環(huán)境中的溶解度低。由此，說明蕎麥蛋白中的部分亞基含有二硫鍵，而且不同pH 環(huán)境中亞基的組成分布有較大差異，這是由亞基溶解度差異導致的。

2.6 不同離子強度條件下蕎麥蛋白SDS-PAGE分析

從圖6 可以看出，隨著離子強度的增加，非還原電泳圖譜中濃縮膠和分離膠頂部亞基條帶逐漸消失，說明這部分亞基在高離子強度環(huán)境中溶解度較低。而在還原和非還原電泳圖譜中22～31 ku 范圍的亞基條帶顏色逐漸加深，說明這部分亞基在高離子強度環(huán)境中溶解度呈上升趨勢。由此，說明不同離子強度環(huán)境中亞基的組成分布有較大差異，但結合溶解度曲線可知，亞基分布也造成溶解度的差異。

3 結論與討論

蕎麥蛋白同其他谷物蛋白相似，均是由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和少量雜蛋白組成。但蕎麥蛋白中清蛋白、球蛋白的含量較多，而醇溶蛋白和谷蛋白含量較少，這使得蕎麥蛋白的組成與豆類蛋白相似。本研究通過堿提酸沉法所得的蕎麥蛋白主要是由清蛋白和球蛋白組成。由試驗結果可知，蕎麥蛋白的溶解特性和功能特性與豆類蛋白相似，其等電點在pH 值4～5 范圍內，但蕎麥蛋白在高離子強度下的溶解度較好；由電泳分析結果可知，蕎麥蛋白在不同pH 條件下的亞基分布相似，說明亞基溶解特性無差異性，而離子強度條件下亞基分布略有不同，這說明蕎麥蛋白的高鹽溶性是部分亞基造成的。

本研究結果表明，蕎麥蛋白溶解度在等電點兩側呈上升趨勢，當鹽離子濃度為0.4 mol/L 時溶解度最大，且隨著鹽離子濃度的逐漸增大，其溶解度略有降低，整體而言，離子強度對于蕎麥蛋白的溶解度影響不大；堿性條件下蕎麥蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性優(yōu)于酸性條件。SDS-PAGE 結果表明，蕎麥蛋白的亞基主要分布在14.4～97.4 ku 范圍內，且部分亞基含有二硫鍵；不同pH 和離子強度條件下蕎麥蛋白亞基的組成有較大差異。