美洲大蠊提取物抗氧化活性研究

和 英，顧 婷，楊永壽，肖培云

（大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

蜚蠊入藥有悠久的歷史，初見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其味咸、性寒，治血瘀，能破積聚〔1〕?，F(xiàn)代供藥用的蜚蠊為人工養(yǎng)殖的美洲大蠊（Periplaneta americana），為自然界中分布極廣的節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲(chóng)綱蜚蠊目昆蟲(chóng)，其他常見(jiàn)的種類還包括澳洲大蠊、日本姬蠊、德國(guó)小蠊、斑蠊等。美洲大蠊含有多糖、肽類和生物堿等活性成分，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗氧化、抗肝纖維化、保肝和抗腫瘤等作用〔2-3〕。美洲大蠊多糖具有較強(qiáng)的羥基自由基清除能力，在1 mg∕mL 的質(zhì)量濃度下能增加損傷細(xì)胞的存活率，對(duì)過(guò)氧化氫（H2O2）損傷細(xì)胞具有保護(hù)作用〔4〕。張濤等〔5〕對(duì)美洲大蠊蟲(chóng)體95%乙醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從其乙酸乙酯部位分離得到14 個(gè)化合物，對(duì)已分離的14 個(gè)化合物進(jìn)行體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示化合物原兒茶酸、3，4-二羥基苯乙醇、1，2-二去氫-N-乙酰多巴胺具有顯著清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）自由基的能力。李嫻等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)美洲大蠊油脂對(duì)H2O2所致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用。美洲大蠊醇提物能夠增加大鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量，降低一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）的含量，說(shuō)明美洲大蠊醇提物對(duì)大鼠機(jī)體具有一定的抗氧化應(yīng)激功能〔7〕。目前，已有關(guān)于美洲大蠊醇提物、多糖和油脂的抗氧化研究，未見(jiàn)美洲大蠊不同極性溶劑提取物抗氧化活性的報(bào)道。本研究采用體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，對(duì)美洲大蠊水提取物（PAW）、乙醇提取物（PAEE）、正丁醇提取物（PABA）、乙酸乙酯提取物（PAEA）和石油醚提取物（PAPE）的抗氧化活性進(jìn)行比較研究。

抗氧化劑是指能夠延緩和阻止氧化反應(yīng)，具有自由基清除能力和還原性的一類物質(zhì)〔8〕。隨著對(duì)合成抗氧化劑安全性疑慮的增加，人們更傾向于選用較為安全高效的天然抗氧化劑。近年來(lái)研究表明，任何一種單一的評(píng)價(jià)方法均無(wú)法充分地評(píng)價(jià)樣品的抗氧化活性〔9〕，因此，需要使用不同方法從不同角度對(duì)物質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行研究。本研究利用6 種方法即清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、ABTS 自由基、DPPH 自由基能力，總還原能力和亞鐵離子（Fe2+）的螯合能力來(lái)評(píng)價(jià)美洲大蠊提取物的抗氧化活性，為美洲大蠊資源的后續(xù)開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 美洲大蠊不同溶劑提取物的制備美洲大蠊干燥蟲(chóng)粉碎，過(guò)2 號(hào)篩。按照極性大小，依次用水、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯和石油醚，料液比（g∕mL）為1：5，60 ℃回流提取3 次，每次為2.5 h，抽濾，合并濾液，于60 ℃下減壓濃縮，冷凍干燥。

1.2 試劑DPPH（東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：217-591-8）；抗壞血酸（Vc，上海化學(xué)試劑分裝廠，批號(hào)：840110）；ABTS（索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：1109I032）；菲洛嗪（索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：1204L031）；鄰苯三酚（甌海化工試劑廠，批號(hào)：930608）；其他試劑均為分析純。

1.3 儀器TU-1901 雙光束紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器責(zé)任有限公司）；雷磁PHS-3C 型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SK3200LH 超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；AL240-IC分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；HYQ-3110渦旋混勻器（美國(guó)精騏有限公司）；HWS12恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 DPPH 自由基清除能力的測(cè)定清除DPPH 自由基活性實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)〔10〕，略有改動(dòng)。用蒸餾水將美洲大蠊不同溶劑提取物配制成不同濃度梯度（0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg∕mL）的溶液。取2 mL的1 mmol∕L DPPH（無(wú)水乙醇配置）溶液，加2 mL樣品溶液，混合均勻，常溫避光放置30 min，于517 nm處進(jìn)行測(cè)定，以Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。清除率用以下公式計(jì)算：

式中，A1：待測(cè)樣+DPPH 溶液的吸光度；A2：待測(cè)樣+無(wú)水乙醇的吸光度；A0：蒸餾水+DPPH 溶液的吸光度。

2.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定測(cè)定方法參考文獻(xiàn)〔11〕，并略作改動(dòng)。將等體積2.6 mmol∕L 的過(guò)硫酸鉀溶液和7.4 mmol∕L 的ABTS 溶液混合，避光，靜置12 h，制成ABTS 儲(chǔ)備液，用蒸餾水稀釋，使其在734 nm 處的吸光度在0.9 左右，制成ABTS 工作液。將美洲大蠊不同溶劑提取物用蒸餾水配制成0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg∕mL的溶液。取待測(cè)樣1 mL，加入ABTS 工作液6 mL，混合均勻，室溫下反應(yīng)10 min，在734 nm 處測(cè)定吸光度，以Vc 為陽(yáng)性對(duì)照。樣品對(duì)ABTS自由基清除率用以下公式計(jì)算：

式中，A1：1 mL 待測(cè)樣+6 mL ABTS 工作液的吸光度；A2：1 mL待測(cè)樣+6 mL蒸餾水的吸光度；A0：1 mL蒸餾水+6 mL ABTS工作液的吸光度。

2.3 羥基自由基清除能力的測(cè)定測(cè)定方法參考文獻(xiàn)〔12〕，并略作改動(dòng)。將美洲大蠊不同溶劑提取物配制成0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mg∕mL 的溶液，分別取1 mL 溶液于比色管中，各管均加入5 mmol∕L水楊酸（無(wú)水乙醇配制）溶液1 mL、5 mmol∕L的硫酸亞鐵（FeSO4）溶液1 mL，搖勻后加入0.07% H2O2溶液1 mL，振蕩混勻，37 ℃水浴30 min，以Vc 作陽(yáng)性對(duì)照，于510 nm處測(cè)定吸光度。樣品對(duì)羥基自由基清除率用以下公式計(jì)算：

式中，A1：1 mL待測(cè)樣+1 mL水楊酸溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL H2O2的吸光度；A2；1 mL 待測(cè)樣+1 mL水楊酸溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL蒸餾水的吸光度；A0：1 mL蒸餾水+1 mL水楊酸溶液+1 mL FeSO4溶液+1 mL H2O2的吸光度。

2.4 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定測(cè)定方法參考文獻(xiàn)〔13〕，并略作改動(dòng)。將美洲大蠊不同溶劑提取物配制成0.20、1.00、1.80、2.60、3.40 mg∕mL 的溶液，分別取1 mL 置于10 mL 試管中，再加入4 mL 0.1 mol∕L（pH=8.2）Tris-HCl 緩沖液混勻，用去離子水補(bǔ)充至9 mL，25 ℃水浴10 min，取出，立即加入1 mL 用10 mmol∕L HCl 溶液配制的3 mmol∕L 鄰苯三酚溶液（25 ℃預(yù)熱），快速搖勻后于320 nm處測(cè)定吸光度，間隔30 s測(cè)定一次，共計(jì)8次。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，320 nm 處的吸光度為縱坐標(biāo)，利用Elisa 軟件進(jìn)行線性回歸得其斜率，斜率即為Vt。樣品對(duì)超氧陰離子自由基清除率用以下公式計(jì)算：

式中，V0：鄰苯三酚的自氧化速率；V1：加樣后鄰苯三酚的自氧化速率。

2.5 還原能力的測(cè)定測(cè)定方法參考文獻(xiàn)〔14〕，并略作改動(dòng)。將美洲大蠊不同溶劑提取物配制成不同濃度梯度0.20、0.50、0.80、1.10、1.40、1.70 mg∕mL 的溶液，分別取2 mL 于10 mL 離心管中，分別加入0.025 mol∕L（pH=6.8）的磷酸鹽緩沖液2 mL、1%鐵氰化鉀2 mL，混勻后于50 ℃水浴反應(yīng)20 min。冷卻后加入10%三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)，3 000 r∕min離心10 min。取上清液2 mL，加入0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL 和蒸餾水2 mL，靜置15 min，在700 nm 處測(cè)定吸光度，Vc作為陽(yáng)性對(duì)照。吸光度與樣品的還原能力有關(guān)，吸光度越大則還原能力越大。用以下公式計(jì)算還原能力：

式中，A1：反應(yīng)后樣品吸光度；A2：樣品的本底吸光度。

2.6 對(duì)Fe2+螯合能力的測(cè)定測(cè)定方法參考文獻(xiàn)〔15〕，并略作改動(dòng)。將美洲大蠊不同溶劑提取物配制成不同濃度梯度（0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mg∕mL）的溶 液，分 別 取2.5 mL 溶液，依次加入2 mmol∕L 的FeSO4溶液0.1 mL、2 mmol∕L 的菲洛嗪溶液0.2 mL，避光靜置10 min，于562 nm 處測(cè)吸光度，乙二胺四乙酸（EDTA）為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)Fe2+的螯合率計(jì)算公式如下：

式中，A1：2.5 mL 待測(cè)液+0.1 mL FeSO4溶液+0.2 mL菲洛嗪溶液的吸光度；A2：2.5 mL 待測(cè)液+0.1 mL 蒸餾水+0.2 mL 菲洛嗪溶液的吸光度；A0：2.5 mL 蒸餾水+0.1 mL FeSO4溶液+0.2 mL菲洛嗪溶液的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)DPPH 自由基的清除能力美洲大蠊不同溶劑提取物均具有DPPH自由基清除活性，清除能力隨著樣品濃度的升高而有不同程度的升高。相同濃度下，PABA 和PAEA 對(duì)DPPH 自由基的清除能力明顯高于其他3種提取物。在高濃度下，兩者之間清除能力相當(dāng)，半抑制濃度（IC50）分別為0.16 mg∕mL 和0.18 mg∕mL，當(dāng)濃度達(dá)到0.40 mg∕mL 時(shí)，清除能力趨于平緩，清除率超過(guò)80%，清除能力稍低于Vc。其余3 種提取物對(duì)DPPH 自由基的清除能力相對(duì)較弱，隨著濃度的增大，其清除率上升緩慢。美洲大蠊不同溶劑提取物對(duì)DPPH 自由基清除能力大小依次為PABA＞PAEA＞PAEE＞PAW＞PAPE。見(jiàn)圖1。

圖1 美洲大蠊提取物對(duì)DPPH自由基的清除活性

3.2 對(duì)ABTS 自由基的清除能力美洲大蠊不同溶劑提取物濃度與ABTS自由基的清除率存在明顯的量效關(guān)系，清除率隨濃度升高而有不同程度的升高。當(dāng)濃度為0.50 mg∕mL，PABA和PAEA的清除率分別為78%和74%，其IC50分別為0.18 mg∕mL和0.25 mg∕mL，清除ABTS 自由基活性明顯低于Vc；PAPE 對(duì)ABTS自由基的清除能力最弱，當(dāng)樣品濃度為0.50 mg∕mL時(shí)，其清除率僅為0.49%。美洲大蠊不同溶劑提取物對(duì)ABTS 自由基的清除能力大小依次為PABA＞PAEA＞PAEE＞PAW＞PAPE。見(jiàn)圖2。

圖2 美洲大蠊提取物對(duì)ABTS自由基的清除活性

3.3 對(duì)羥基自由基的清除能力5種美洲大蠊提取物對(duì)羥基自由基的清除能力均隨濃度增加而升高，其中，清除羥基自由基效果最佳的是PAW，IC50為1.25 mg∕mL，當(dāng)濃度達(dá)到3.00 mg∕mL 時(shí)，清除率達(dá)87%，清除能力略低于Vc，且其清除率隨濃度增加呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。此外，PAEE 也具有較好的清除羥基自由基能力，IC50為1.41 mg∕mL，當(dāng)濃度達(dá)到3.00 mg∕mL時(shí)，清除率達(dá)82%。PAPE 對(duì)羥基自由基清除能力略低于PAEE，IC50為1.74 mg∕mL，在0.00～2.00 mg∕mL 濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，清除率迅速升高，清除能力高于PAEA 和PABA，當(dāng)濃度達(dá)到2.00 mg∕mL時(shí)，清除能力就趨于平緩，清除率超過(guò)50%。PAEA和PABA對(duì)羥基自由基的清除活性相對(duì)較低，IC50分 別 為8.06 mg∕mL 和8.49 mg∕mL，當(dāng)濃度達(dá)到3.00 mg∕mL，清除率達(dá)到37%左右。美洲大蠊不同溶劑提取物對(duì)羥基自由基的清除能力大小依次為PAW＞PAEE＞PAPE＞PAEA＞PABA。見(jiàn)圖3。

圖3 美洲大蠊提取物對(duì)羥基自由基的清除活性

3.4 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力根據(jù)結(jié)果分析可得，PAEE 和PAW 對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力明顯高于其他3 種提取物，隨著濃度增加而顯著升高，當(dāng)樣品濃度達(dá)到3.40 mg∕mL 時(shí)，清除率分別達(dá)到46%和49%，但都遠(yuǎn)低于Vc 對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性。PAEA 和PABA 隨著濃度增加，清除率上升緩慢。PAPE 濃度與超氧陰離子自由基的清除率量效關(guān)系不明顯，清除率保持在20%左右。美洲大蠊不同溶劑提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力大小依次為PAEE＞PAW＞PAEA＞PABA＞PAPE。見(jiàn)圖4。

圖4 美洲大蠊提取物對(duì)超氧陰離子自由基的清除活性

3.5 總還原能力的測(cè)定在0.00～1.70 mg∕mL 的范圍內(nèi)，美洲大蠊不同溶劑提取物的還原能力與濃度具有一定的量效關(guān)系，還原能力隨濃度增加而升高。美洲大蠊不同提取物中總還原能力最強(qiáng)的是PABA，當(dāng)濃度達(dá)到1.70 mg∕mL 時(shí)，其還原能力達(dá)到1.19。PAEA 次之，還原力達(dá)1.09。美洲大蠊不同溶劑提取物還原能力均低于Vc，但也具有一定的抗氧化活性。美洲大蠊不同溶劑提取物總還原 能 力 大 小 依 次 為PABA＞PAEA＞PAW＞PAEE＞PAPE。見(jiàn)圖5。

圖5 美洲大蠊提取物的總還原能力

3.6 對(duì)Fe2+螯合能力在反應(yīng)體系的濃度范圍內(nèi)，美洲大蠊不同溶劑提取物對(duì)Fe2+離子的螯合率均低于EDTA，隨著濃度的增加，不同提取物對(duì)Fe2+螯合率上升，呈明顯的量效關(guān)系。在0.00～2.50 mg∕mL的濃度范圍內(nèi)，PABA 對(duì)Fe2+離子的螯合率始終高于其余4種提取物，IC50為1.56 mg∕mL，其在2.50 mg∕mL時(shí)對(duì)Fe2+螯合率達(dá)到73%。在0.00～0.50 mg∕mL的濃度范圍內(nèi)，PAEE 對(duì)Fe2+螯合率低于其他提取物，但在0.50～2.50 mg∕mL 的濃度范圍內(nèi)，PAEE 對(duì)Fe2+螯合率迅速上升，高于PAW、PAPE 和PAEA，IC50為2.36 mg∕mL。在0.00～2.00 mg∕mL 的濃 度范圍內(nèi)，PAPE 對(duì)Fe2+螯合率低于PAW 和PAEA，當(dāng)濃度達(dá)到2.50 mg∕mL 時(shí)，對(duì)Fe2+離子的螯合率迅速升高，達(dá)到31%，甚至高于PAEA。美洲大蠊不同溶劑提取物對(duì)Fe2+螯合能力大小依次為PABA＞PAEE＞PAEA＞PAPE＞PAW。見(jiàn)圖6。

圖6 美洲大蠊提取物對(duì)Fe2+螯合能力

4 討論

本研究結(jié)合6 種不同方法對(duì)美洲大蠊5 種不同極性溶劑提取物體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于各種方法的原理和靈敏度不同，濃度影響方法的正確評(píng)價(jià)，所以每種方法的檢測(cè)濃度均不同。5 種美洲大蠊提取物均具有一定的抗氧化活性，但存在明顯差異，且各提取物的抗氧化能力大小隨評(píng)價(jià)方法的不同存在一定差異。

體外抗氧化活性評(píng)價(jià)方法有多種類型，其實(shí)驗(yàn)原理亦存在一定差異，DPPH、ABTS 自由基清除法和總還原能力法屬于基于電子轉(zhuǎn)移（SET）的方法，羥基自由基與超氧陰離子自由基清除法屬于活性氧自由基清除能力法，F(xiàn)e2+螯合能力法屬于螯合過(guò)渡金屬防止產(chǎn)生自由基的方法〔16〕，抗氧化活性分析是一個(gè)需采用多種方法進(jìn)行全面評(píng)價(jià)的系統(tǒng)體系。本研究采用的DPPH 和ABTS 自由基清除法對(duì)5 種美洲大蠊提取物抗氧化活性測(cè)定的結(jié)果完全一致，而總還原能力法測(cè)定的結(jié)果與前兩種方法測(cè)定結(jié)果的吻合度最高，這可能與DPPH、ABTS 自由基清除法和總還原能力法均屬于SET 方法有關(guān)。羥基自由基與超氧陰離子自由基清除法結(jié)果顯示PAW和PAEE 的抗氧化活性優(yōu)于其他3 種提取物，該結(jié)果提示羥基自由基與超氧陰離子自由基清除法可能具有相關(guān)性。王穎等〔17〕關(guān)于白蘇葉乙醇提取物體外抗氧化活性的研究表明，這兩種方法測(cè)定的結(jié)果具有較高的相關(guān)性。

美洲大蠊不同溶劑提取物采用相同方法進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，抗氧化能力各有不同，可能是由于不同溶劑提取物中活性成分存在差異，活性成分之間存在相互作用，從而影響了提取物的抗氧化能力。相同提取物采用不同方法進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)，活性不相同，可能是不同方法的抗氧化機(jī)制不同。6 種評(píng)價(jià)方法均證實(shí)5 種美洲大蠊提取物在一定濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出不同程度的抗氧化活性，且呈濃度依賴性。綜上所述，美洲大蠊提取物有望成為天然抗氧化劑來(lái)源，但其物質(zhì)基礎(chǔ)和體內(nèi)外抗氧化機(jī)制需進(jìn)一步研究。