基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和設(shè)計(jì)空間的乳腺康提取工藝研究

劉博文，戴 靜，劉曉鳳，閆博文，鄧 妍，劉 濤, *

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和設(shè)計(jì)空間的乳腺康提取工藝研究

劉博文1，戴 靜1，劉曉鳳2，閆博文1，鄧 妍1，劉 濤1, 2*

1. 成都大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610106 2. 四川天一學(xué)院，四川 德陽(yáng) 618000

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及設(shè)計(jì)空間法對(duì)乳腺康提取工藝參數(shù)進(jìn)行研究。借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)乳腺康潛在的活性成分進(jìn)行篩選，并與酪氨酸激酶進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020年版確定指標(biāo)性成分，采用HPLC法運(yùn)用設(shè)計(jì)空間進(jìn)行乳腺康提取工藝研究。篩選出乳腺康中甘草查爾酮A、川陳皮素、蒲公英甾醇等核心成分與酪氨酸激酶的親和力與臨床推薦用藥相似；設(shè)計(jì)空間得到最佳提取工藝：浸泡時(shí)間為30 min、溶媒量為12倍、提取時(shí)間為45～75 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～80%、提取2～3次。實(shí)驗(yàn)所得到的工藝合理可行，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與理論值預(yù)測(cè)值接近，具有一定的實(shí)用價(jià)值。該研究基于質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）理念的乳腺康提取工藝，穩(wěn)定可靠，為其進(jìn)一步的工藝開(kāi)發(fā)及質(zhì)量控制提供思路。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；乳腺康；酪氨酸激酶；設(shè)計(jì)空間；提取工藝；甘草查爾酮A；川陳皮素；蒲公英甾醇；橙皮苷；甘草酸銨；咖啡酸

全球乳腺癌發(fā)病率逐年增加，在女性患惡性腫瘤的患者中，乳腺癌的病死率高居第1位[1]。目前，乳腺癌的治療仍以手術(shù)、放化療、分子靶向治療等為主。西醫(yī)治療可直接殺死腫瘤細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)損害患者自身正常細(xì)胞及免疫系統(tǒng)，隨著中醫(yī)藥研究的進(jìn)步，各種含有中藥及其有效成分的新型抗乳腺癌藥物的研發(fā)，為乳腺癌新的治療帶來(lái)可能性[2]，如藥物參一膠囊、康萊特注射液[3]、復(fù)方斑蝥膠囊等[4]?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部收載69種中藥用于乳腺癌疾病的治療，但多為提高機(jī)體自身免疫力。青皮甘草散收載于清代醫(yī)書(shū)《醫(yī)宗金鑒》卷四十九，由青皮、甘草組成，主治“乳巖”，乳腺康源于青皮甘草散，經(jīng)加減化裁得到的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由青皮、甘草及蒲公英3味藥材配伍而成，青皮疏肝破氣，用于乳癖、乳癰；甘草解毒，補(bǔ)益氣；蒲公英清熱解毒，消腫散結(jié)，用于乳癰；三藥合用，共湊清熱解毒、活血消腫、化瘀散結(jié)之功。本課題組[5-6]前期已經(jīng)對(duì)乳腺康注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效學(xué)進(jìn)行研究。目前，中藥復(fù)方的提取工藝研究多采用單因素和正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，無(wú)法達(dá)到實(shí)際提取工藝參數(shù)的動(dòng)態(tài)性。設(shè)計(jì)空間[7]已被證明為可以保證質(zhì)量的輸入變量和工藝參數(shù)的多維組合，在此空間里允許工藝參數(shù)的波動(dòng)，即在設(shè)計(jì)空間內(nèi)發(fā)生的工藝參數(shù)改變通常不被視為工藝變更，不會(huì)影響對(duì)結(jié)果的綜合要求，有助于結(jié)合產(chǎn)品質(zhì)量屬性控制目標(biāo)成分，不僅可以有效在誤差方面減少損失，還可以提高工藝參數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)性。

目前，多數(shù)中藥工藝研究過(guò)程中，多以藥材的指標(biāo)性化學(xué)成分作為工藝篩選的指標(biāo)，但這些化學(xué)成分是否與藥物臨床藥效相關(guān)尚未可知，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)[8]對(duì)乳腺康有效活性成分進(jìn)行篩選，得到活性成分群并作為指標(biāo)性成分，采用設(shè)計(jì)空間法對(duì)乳腺康提取工藝進(jìn)行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters-2695型高效液相色譜儀、Photodiode Array Detector型檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司；SQP電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FA2004分析天平，上海良平儀器儀表有限公司；800Y型高速多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；MH-3000型調(diào)溫電熱套，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司；PS-40超聲波清洗器，AC 200～240 V，50 Hz，深圳得康清洗設(shè)備有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 材料

青皮（批號(hào)180718）、甘草（批號(hào)200703）、蒲公英（批號(hào)190208）均購(gòu)自成都市荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都大學(xué)藥學(xué)院劉濤教授鑒定，分別為蕓香科柑橘屬植物橘Blanco的果皮、豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根及菊科蒲公英屬植物蒲公英Hand. -Mazz.的干燥全草；對(duì)照品橙皮苷（批號(hào)wkq18040203）、川陳皮素（批號(hào)wkq20031701）、甘草查爾酮A（批號(hào)wkq20022102）、咖啡酸（批號(hào)140107）、甘草酸銨（批號(hào)140227），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 乳腺康網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 乳腺康成分搜集 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中藥分子機(jī)制生物信息學(xué)分析工具（bio-informatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM，http://bionet. ncpsb.org/batman-tcm），結(jié)合中國(guó)天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫(kù)，檢索獲得乳腺康所含的化學(xué)成分，表1為篩選出的主要活性成分。

表1 乳腺康主要活性成分的基本信息

采用中國(guó)天然產(chǎn)物化學(xué)成分庫(kù)對(duì)蒲公英成分進(jìn)行了篩選，確定成分后在TCMSP中也未查到相關(guān)成分的口服生物利用度（OB）及類(lèi)藥性（DL）值

The dandelion components were screened using the Chinese Natural Product Chemical Components Library. After the components being determined, the OB and DL values of the relevant components were not found in TCMSP

2.1.2 活性化合物及靶標(biāo)蛋白的篩選 口服生物利用度（OB）是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）中最重要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一，參考文獻(xiàn)方法[9]在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中用OB≥30%和DL≥0.18篩選乳腺康的活性成分，并利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)功能收集乳腺康中化學(xué)成分的靶標(biāo)蛋白，借助UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/），通過(guò)導(dǎo)入蛋白名稱(chēng)并設(shè)定物種為人，將檢索得到的所有的蛋白靶標(biāo)校正為UniProtID，并得到靶標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的基因名PTGS1、SCN5A、HSP90AB1、F2、F10 ACHE等共計(jì)382個(gè)。

2.1.3 篩選疾病基因靶點(diǎn)及韋恩圖構(gòu)建 利用比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（comparative toxicogenomics database，CTD，http://ctd.mdibl.org/），以關(guān)鍵詞“乳腺癌”及“breast cancer”進(jìn)行搜集，得到10萬(wàn)余個(gè)基因靶點(diǎn)，根據(jù)“Inference score”，選取數(shù)據(jù)庫(kù)中前500個(gè)基因靶點(diǎn)。將乳腺康得到的382個(gè)成分基因靶標(biāo)與利用比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出乳腺癌的前500個(gè)疾病基因靶標(biāo)進(jìn)行韋恩圖構(gòu)建，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 乳腺康成分基因與乳腺癌基因韋恩圖

2.1.4 成分-靶標(biāo)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 先將化合物基因?qū)氲鞍踪|(zhì)相互作用分析平臺(tái)STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl），獲取蛋白相互作用的關(guān)系，再將成分、靶標(biāo)、通路導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.2軟件構(gòu)建成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)。設(shè)置節(jié)點(diǎn)度（degree）值大于所有節(jié)點(diǎn)連接2倍中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，確定關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，探究乳腺康的作用機(jī)制。

成分-靶標(biāo)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)總共包括165個(gè)節(jié)點(diǎn)（71個(gè)成分節(jié)點(diǎn)、74個(gè)靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)、20個(gè)通路節(jié)點(diǎn)）和1367條邊，如圖2所示，其中圓形代表基因靶點(diǎn)，菱形代表成分，三角形代表通路。一個(gè)節(jié)點(diǎn)的度值表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連的節(jié)點(diǎn)的數(shù)量，相互作用構(gòu)成成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)篩選出來(lái)的中心度值、親中心度值、等級(jí)值較大的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，越能連接化合物或者靶點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中越能發(fā)揮樞紐作用，在該網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)成分平均與13.51個(gè)靶點(diǎn)相互作用，每個(gè)靶點(diǎn)平均與12.96個(gè)成分相互作用；每個(gè)靶點(diǎn)平均與9.41個(gè)通路相互作用，每個(gè)通路平均與34.80個(gè)靶點(diǎn)作用，因此在乳腺康中存在一個(gè)成分與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，也存在一個(gè)靶點(diǎn)與多個(gè)成分相互作用；存在一個(gè)靶點(diǎn)與多個(gè)通路相互作用，也存在一個(gè)通路與多個(gè)靶點(diǎn)作用。這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點(diǎn)、多通路相互作用的整體性與聯(lián)系性。

2.1.5 靶點(diǎn)通路分析 為進(jìn)一步觀(guān)察作用靶標(biāo)的生物學(xué)功能，將所有化合物靶點(diǎn)基因?qū)氲紻AVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）[10]中對(duì)其進(jìn)行通路富集分析。在DAVID的基因列表通用管理面板中復(fù)制粘貼基因列表，選擇“OFFICIAL GENE SYMBOL”，List Type設(shè)置為“Gene List”，提交的基因列表選擇對(duì)應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，選擇基因本體功能（Gene Ontology，GO）生物學(xué)過(guò)程富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析，點(diǎn)擊“Functional Annotation Chart”獲得通路富集結(jié)果。使用Omicshare數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// www.omicshare.com/）繪制成氣泡圖，用GraphPad Prism軟件繪制柱狀圖[11]。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID進(jìn)行的GO功能富集分析得到GO條目175個(gè)（＜0.05），其中生物過(guò)程（BP）條目94個(gè)，細(xì)胞組成（CC）條目35個(gè)，分子功能（MF）條目46個(gè)，分別占54%、20%、26%，結(jié)果如圖3所示。

KEGG通路富集分析篩選得到113條（＜0.05）信號(hào)通路，涉及乙型肺炎、胰腺癌、前列腺癌等，其中乙型肺炎通路涉及、、等基因；胰腺癌通路涉及、、等基因；前列腺癌通路涉及、、、等基因，乙型肺炎、前列腺癌等均含有基因，文獻(xiàn)表明[28]基因?yàn)槿橄侔┳饔玫闹匾蛑?。選值最小的20個(gè)通路進(jìn)行可視化，結(jié)果如圖4所示。

2.1.6 成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接分析 先從RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rscb.org/）下載酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK，PDB ID：2B4S）的3D結(jié)構(gòu)的pdb格式文件，運(yùn)用Discovery Studio 2020 Client軟件移除靶蛋白中的非蛋白分子和配體再保存為pdb后綴的文件[12]。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載關(guān)鍵成分2D結(jié)構(gòu)的sdf格式文件。利用PyRx軟件先上傳去水加氫后的蛋白質(zhì)文件，將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，再上傳化合物文件使其能量最小化，并將其轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，最后運(yùn)用vina進(jìn)行對(duì)接[13]。結(jié)合能＜0說(shuō)明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，研究選取結(jié)合能≤?5 kJ/mol[14]的活性成分作為乳腺康的篩選依據(jù)。一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定時(shí)能量越低，發(fā)生作用的可能性越大。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示，與酪氨酸激酶結(jié)合能量較低的化合物分別是蒲公英賽醇（結(jié)合能為?36.40 kJ/mol）等，以結(jié)合能≤?5 kJ/mol為篩選標(biāo)準(zhǔn)，可知，乳腺康中主要活性成分與酪氨酸激酶結(jié)合能遠(yuǎn)小于?5 kJ/mol，如表2所示。由此可見(jiàn)，乳腺康中核心成分與酪氨酸激酶形成構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性高。根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[21-23]及依據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版一部中對(duì)藥材指標(biāo)性成分規(guī)定，最終確定川陳皮素、甘草查爾酮A、橙皮苷、甘草酸銨、咖啡酸為乳腺康質(zhì)量控制的活性成分群。

圖2 乳腺康成分-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)

圖3 乳腺康的成分作用靶點(diǎn)GO功能分析

圖4 乳腺康作用靶點(diǎn)KEGG通路富集分析的20條通路氣泡圖

2.2 活性成分群含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品甘草查爾酮A 2.82 mg、川陳皮素2.58 mg、橙皮苷5.31 mg、甘草酸銨7.63 mg、咖啡酸3.07 mg分別置于25、50、50、50、25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度線(xiàn)，制成質(zhì)量濃度分別為甘草查爾酮A 112.8 μg/mL、川陳皮素51.6 μg/mL、橙皮苷106.2 μg/mL、甘草酸銨152.6 μg/mL、咖啡酸122.8 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取“1.2”項(xiàng)下3味中藥飲片適量，加10～15倍溶媒，浸泡30～60 min，提取1～3次，每次提取30～90 min，濾過(guò)，合并濾液，冷卻至室溫，量取總體積，精密移取500 μL提取液加溶媒定容至10 mL量瓶中，搖勻，作為供試品溶液。

表2 乳腺康中活性成分及目前臨床報(bào)道有效化學(xué)藥與酪氨酸激酶的結(jié)合能

2.2.3 色譜條件 采用Supersil ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：先在全波長(zhǎng)200～400 nm下測(cè)定，后根據(jù)各對(duì)照品最大吸收波長(zhǎng)切換檢測(cè)波長(zhǎng)；以乙腈-0.5%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫[15]（0～20 min，10%～32%乙腈；20～50 min，32%～70%乙腈；50～60 min，70%～10%乙腈）檢測(cè)甘草酸銨（237 nm）、橙皮苷（284 nm）、川陳皮素（330 nm）、甘草查爾酮A（361 nm）；以甲醇-0.15%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫[15]（0～20 min，20%甲醇；20～40 min，20%～30%甲醇；40～50 min，30%～20%甲醇）檢測(cè)咖啡酸（323 nm）。

2.2.4 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密移取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，供試品溶液在對(duì)照品相同保留時(shí)間的出峰位置處分別與對(duì)照品色譜峰對(duì)應(yīng)一致。色譜圖見(jiàn)圖5。

2.2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密移取甘草查爾酮A、川陳皮素、橙皮苷、甘草酸銨、咖啡酸對(duì)照品溶液2 mL，分別采用二倍稀釋法，制得6個(gè)樣品[16]，采用“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程分別為甘草查爾酮A＝45 536＋8624，＝0.995 1；川陳皮素＝46 332－18 169，＝0.998 9；橙皮苷＝20 421－9715，＝0.998 0；甘草酸銨＝10 828－22 550，＝0.997 1；咖啡酸＝138 662－ 199 822，＝0.999 3；結(jié)果表明，甘草查爾酮A在3.5～112.8 μg/mL、川陳皮素在1.6～51.6 μg/mL、橙皮苷在3.3～106.2 μg/mL、甘草酸銨在4.8～152.6 μg/mL、咖啡酸在3.8～122.8 μg/mL與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

1-橙皮苷 2-川陳皮素 3-甘草查爾A 4-甘草酸銨 5-咖啡酸

2.2.6 精密度試驗(yàn) 量取對(duì)照品溶液適量，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積[17]。計(jì)算得甘草查爾酮A、川陳皮素、橙皮苷、甘草酸銨、咖啡酸峰面積的RSD分別為1.44%、1.95%、1.08%、1.32%、0.36%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品6份，依法制備供試品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量[18]。結(jié)果甘草查爾酮A、川陳皮素、橙皮苷、甘草酸銨、咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別均小于5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣，按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果甘草查爾酮A、川陳皮素、橙皮苷、甘草酸銨、咖啡酸峰面積的RSD均小于5%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定[19]。

2.2.9 樣品測(cè)定 將“2.2.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液按照“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.3 設(shè)計(jì)空間法優(yōu)化乳腺康提取工藝

2.3.1 關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）和關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）的確定 生產(chǎn)工藝風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估需要保證能夠?qū)ιa(chǎn)工藝中所有的CQA和CPP進(jìn)行充分的控制。

（1）CQA的確定：對(duì)乳腺康提取過(guò)程中干膏率和指標(biāo)性成分含量進(jìn)行CQA確定。結(jié)合乳腺康中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、文獻(xiàn)中藥效活性的研究[29-30]及《中國(guó)藥典》2020年版一部中對(duì)各藥材指標(biāo)性成分的規(guī)定，將干膏得率（1）及甘草查爾酮A、甘草酸銨、川陳皮素、橙皮苷、咖啡酸的提取量（2～6）作為乳腺康制備工藝的CQA。

（2）CPP的確定：對(duì)乳腺康提取工藝過(guò)程中在藥材、溶劑、提取操作、濾過(guò)操作等方面所涉及的潛在CPP［提取時(shí)間（1）、加溶媒量（2）、提取次數(shù)（3）、浸泡時(shí)間（4）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（5）］進(jìn)行篩選及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。利用Minitab 18軟件進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)乳腺康成分含量影響較大的CPP，結(jié)果見(jiàn)表4。

分別以1～6對(duì)1～5進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程：1＝6.36－0.127 31＋0.4472＋5.1583＋0.032 74＋0.021 45，2＝?2.58×10?3＋2.0×10?51＋1.27×10?42＋4.17×10?43＋1.9×10?54＋1×10?65，3＝0.031 9＋1.038×10?31－2.25×10?32＋0.020 5＋5.17×10?44－3.72×10?45，4＝0.037 3－2.57×10?41－1.37×10?42＋4.74×10?33＋3.79×10?44－8.5×10?55，5＝?1.028＋4.8×10?41＋0.066 02＋0.653 33＋2.08×10?34＋5.93×10?35，6＝1.45－0.028 511＋0.2972＋1.4853＋5.7×10?34－0.022 145。

方差分析見(jiàn)表5，由表5可知1、3～6均對(duì)1、3或5顯著；標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的pareto圖見(jiàn)圖6，效應(yīng)值影響較大的工藝參數(shù)分別為1、3、5。結(jié)合方差分析和pareto圖最終篩選出提取時(shí)間1、提取次數(shù)3、乙醇體積分?jǐn)?shù)5作為CPP。

表4 工藝參數(shù)的篩選

表5 方差分析

圖6 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的pareto圖

2.3.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化乳腺康最佳提取工藝參數(shù) 根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以1、3和5為自變量，以1～6為響應(yīng)值，利用軟件Design-Expert 10，設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，中心點(diǎn)5個(gè)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6。

2.3.3 設(shè)計(jì)空間計(jì)算和驗(yàn)證 通過(guò)Monte CarLo法計(jì)算獲得基于達(dá)標(biāo)概率的設(shè)計(jì)空間，將Box- Behnken實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬1萬(wàn)次，計(jì)算步長(zhǎng)為0.02，達(dá)標(biāo)概率為0.9可以獲得較滿(mǎn)意結(jié)果[20]，建立設(shè)計(jì)空間-采用MatLab（2018b）軟件提供的Monte CarLo方法計(jì)算獲得乳腺康提取工藝參數(shù)的設(shè)計(jì)空間圖，見(jiàn)圖7。在最佳提取工藝范圍點(diǎn)內(nèi)A（?0.26，?0.58，?0.54）、點(diǎn)外B（?0.38，0，0.36）分別選擇1個(gè)點(diǎn)平行進(jìn)行2組實(shí)驗(yàn)，測(cè)定，干膏率、甘草查爾酮A、甘草酸銨和橙皮苷最佳工藝點(diǎn)內(nèi)A高于點(diǎn)外B，川陳皮素和咖啡酸含量點(diǎn)外B高于點(diǎn)內(nèi)A，綜合評(píng)分（綜合評(píng)分＝干膏率/最大干膏率×10＋甘草查爾酮A質(zhì)量濃度/最大甘草查爾酮質(zhì)量濃度A×30＋甘草酸銨質(zhì)量濃度/最大甘草酸銨質(zhì)量濃度×10＋川陳皮素質(zhì)量濃度/最大川陳皮素質(zhì)量濃度×30＋橙皮苷質(zhì)量濃度/最大橙皮苷質(zhì)量濃度×10＋咖啡酸質(zhì)量濃度/最大咖啡酸質(zhì)量濃度×10）最佳工藝點(diǎn)內(nèi)A優(yōu)于點(diǎn)外B，見(jiàn)表7。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

4 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)乳腺康組方青皮、蒲公英、甘草的主要活性成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，對(duì)原藥材中的蒲公英甾醇等成分進(jìn)行了含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)其在原藥材中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于萬(wàn)分之一，甚至有的低于檢測(cè)限，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，這也是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選方法的局限性[24]，即只考慮成分“有無(wú)”，對(duì)其“含量高低”考慮不多。目前，多數(shù)中藥工藝研究過(guò)程中，多以藥材的指標(biāo)性化學(xué)成分作為工藝篩選的指標(biāo)，但這些化學(xué)成分是否與藥物臨床藥效相關(guān)尚未可知，本研究以藥物、臨床適應(yīng)癥為指標(biāo)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出乳腺康的潛在活性成分，結(jié)合《中國(guó)藥典》2020年版一部青皮、甘草、蒲公英的指標(biāo)性成分，活性成分群在提取液中的含量，采用綜合評(píng)分法作為工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)其提取工藝進(jìn)行篩選，間接地對(duì)藥物活性進(jìn)行控制，改進(jìn)了目前多數(shù)工藝以藥材中指標(biāo)性成分為指標(biāo)而與藥物臨床相關(guān)性不強(qiáng)的不足。

表7 設(shè)計(jì)空間驗(yàn)證結(jié)果

通過(guò)研究，最終確定川陳皮素、甘草查爾酮A、橙皮苷、甘草酸銨及咖啡酸為乳腺康質(zhì)量控制的活性成分群。并以此為指標(biāo)通過(guò)分析軟件進(jìn)行DOE試驗(yàn)設(shè)計(jì)和設(shè)計(jì)空間對(duì)乳腺康提取工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)并優(yōu)化。結(jié)果表明，提取次數(shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、加溶媒量、提取時(shí)間、浸泡時(shí)間均對(duì)乳腺康的提取工藝具有影響，其中提取次數(shù)、提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響較為顯著。得到乳腺康提取的最佳工藝為浸泡時(shí)間為30 min、溶媒量為12倍、提取時(shí)間45～75 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～80%、提取2～3次。

現(xiàn)有的中藥復(fù)方提取多采用單因素、正交試驗(yàn)，并未完全反映中藥復(fù)方提取的工藝參數(shù)動(dòng)態(tài)化。本研究在掌握CQA與CPP的基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析各影響因素對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量的影響[25]。在Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，在Box-Behnken實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)該嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行，減少因?yàn)榻M數(shù)較多引起的誤差[26]，并對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)Monte CarLo法計(jì)算獲得基于達(dá)標(biāo)概率的設(shè)計(jì)空間，計(jì)算機(jī)模擬1萬(wàn)次，計(jì)算步長(zhǎng)為0.02，達(dá)標(biāo)概率為0.9可以獲得較滿(mǎn)意結(jié)果并參照文獻(xiàn)[27]進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與空間預(yù)測(cè)結(jié)果一致，表明該設(shè)計(jì)空間法運(yùn)用于乳腺康提取工藝穩(wěn)定可行，該方法使提取工藝參數(shù)更加動(dòng)態(tài)化，為實(shí)際大生產(chǎn)中工藝參數(shù)篩選提供一種思路。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)篩選出乳腺康的CQA，采用設(shè)計(jì)空間法對(duì)乳腺康進(jìn)行提取工藝研究，用大數(shù)據(jù)分析和計(jì)算機(jī)模擬與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相結(jié)合，對(duì)乳腺康指標(biāo)性成分篩選到最終提取工藝的初步確定進(jìn)行研究，避免了提取工藝的臨床利用與指標(biāo)性不強(qiáng)的問(wèn)題和提取工藝參數(shù)篩選盲目性，具有一定的創(chuàng)新性。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research on extraction process of Ruxiankang based on network pharmacology and design space

LIU Bo-wen1, DAI Jing1, LIU Xiao-feng2, YAN Bo-wen1, DENG Yan1, LIU Tao1, 2

1. School of Pharmacy, Chengdu University, Chengdu 610106, China 2. Sichuan Tianyi University, Deyang 618000, China

To explore the extraction process parameters of Ruxiankang (乳腺康) through network pharmacology and design space.With the help of network pharmacology, the active ingredients of Ruxiankang were screened, and molecular docking with tyrosine kinase was carried out, combined with “” 2020 edition to determine the index components, and the extraction process of Ruxiankang by high performance liquid chromatography and design space was studied.The core components of Ruxiankang screened, such as licochalcone A, nobiletin, and taraxasterol, had affinity with tyrosine kinases similar to those recommended in the clinic, and the optimal extraction process was obtained in the design space: the immersion time was 30 min, and the solvent volume was 12 times, extraction time was 45—75 min, ethanol concentration was 65%—80%, for 2—3 extraction times.The process obtained in the experiment is reasonable and feasible, the verification experiment is close to the predicted value of the theoretical value, which has certain practical value. The Ruxiankang extraction process is based on the QbD concept, which is stable and reliable, and provides ideas for its further process development and quality control.

network pharmacology; Ruxiankang; tyrosine kinase; design space; extraction process; licochalcone A; nobiletin; taraxasterol; hesperidin; ammonium glycyrrhizinate; caffeic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2021)06 - 1634 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.011

2020-11-03

四川省科技成果轉(zhuǎn)移項(xiàng)目（2020ZHCG0073）；2019年德陽(yáng)市產(chǎn)學(xué)研合作科技研發(fā)類(lèi)項(xiàng)目（2019CK090）；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2020年開(kāi)放課題（GXZYKF202004）；成都大學(xué)CC國(guó)家眾創(chuàng)空間2020年度創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（ccyg202001003）；四川省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202011079112X）

劉博文（1996—），男，在讀研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹W(xué)。Tel: 15708143246 E-mail: 2499677479@qq.com

劉 濤（1976—），男，博士，研究員級(jí)高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師，從事中藥新藥研究及中成藥質(zhì)量再評(píng)價(jià)研究工作。Tel: 13378118375 E-mail: liutao057@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]