Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化大黃素/小檗堿-殼聚糖雙載藥納米粒的處方工藝研究

謝青璇，李小芳，謝 龍，王 嫻，曹 怡，梁由單

Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化大黃素/小檗堿-殼聚糖雙載藥納米粒的處方工藝研究

謝青璇，李小芳*，謝 龍，王 嫻，曹 怡，梁由單

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

優(yōu)化大黃素（Emo）與小檗堿（Ber）殼聚糖雙載藥納米粒的制備工藝和處方，并考察其穩(wěn)定性及溶出度。以殼聚糖（CS）為載體，三聚磷酸鈉（TPP）為交聯(lián)劑，采用離子交聯(lián)法包載大黃素/羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）和小檗堿，得到載藥納米粒（Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs），以粒徑和多分散指數(shù)（PDI）為自變量，運(yùn)用總評(píng)歸一值（OD）法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化處方并進(jìn)行驗(yàn)證。最后對(duì)納米粒的最佳凍干條件進(jìn)行篩選，考察保護(hù)劑種類和用量。并對(duì)制劑進(jìn)行表征和溶出度考察。優(yōu)化得到的最佳制備工藝為殼聚糖與TPP質(zhì)量比為3∶1，小檗堿與載體質(zhì)量比為0.166∶1，Emo/HP-β-CD與載體質(zhì)量比為0.2∶1。測(cè)得Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs的平均粒徑為（178.0±2.0）nm，PDI為0.187±0.006，平均OD值為0.953 6，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近。大黃素和小檗堿的載藥量分別為0.34%和0.95%。穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，納米粒膠體溶液在9 d內(nèi)以4 ℃儲(chǔ)存物理性質(zhì)穩(wěn)定，以6%葡萄糖為保護(hù)劑制得的凍干制劑效果較好，復(fù)溶迅速，再分散后的平均粒徑為（161.8±4.8）nm，PDI為0.263±0.047。體外釋放研究表明載藥納米粒凍干粉溶解度和溶出度顯著提高。Box-Behnken效應(yīng)面法所建立的模型能較好的用于Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs制劑的處方優(yōu)化，精度高，預(yù)測(cè)效果較好，且Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs制備工藝穩(wěn)定可行。

大黃素；羥丙基-β-環(huán)糊精；小檗堿；殼聚糖；納米粒；Box-Behnken效應(yīng)面法；總評(píng)歸一值法；離子交聯(lián)法

大黃-黃連藥對(duì)為中藥清熱瀉火解毒的代表藥味配伍之一，其源于張仲景《傷寒論》大黃黃連瀉心湯，二者常相須配伍使用[1]。以大黃-黃連藥對(duì)為基礎(chǔ)的制劑療效顯著，因此二者在臨床應(yīng)用上有廣闊的前景[2]。大黃素（emodin，Emo）是傳統(tǒng)中藥大黃和虎杖的天然蒽醌類成分，現(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)大黃素在保肝[1]、抗炎[2]、抗糖尿病[3]、抗?jié)僛4]、免疫抑制[5]，以及腫瘤治療[6]中均有一定療效。然而大黃素的水溶性極差，口服生物利用度低，使其在臨床應(yīng)用中受限。

小檗堿（berberine，Ber）即黃連素，是毛茛科黃連屬植物黃連根和皮中提取的異喹啉類生物堿，具備多種藥理活性，如清熱解毒、抗菌、抗痢、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)血脂等功能[7-12]。然而小檗堿具有較大的極性，口服易被胃腸道中的黏蛋白吸附而降低其吸收率，im和靜脈滴注給藥又易引起藥疹、過(guò)敏性休克等較強(qiáng)的不良反應(yīng)，而制劑味苦增加了兒童服藥的困難[13]。因此，設(shè)計(jì)大黃素-小檗堿給藥系統(tǒng)，以增加兩者的溶解度，改善其生物利用度，是亟待解決的問(wèn)題之一。

大黃素和小檗堿分別是大黃和黃連藥對(duì)的主要有效成分，小檗堿與大黃素相須為用，《本草綱目》認(rèn)為“相須”即“同類不可離也”，相須二藥之間存在特殊的協(xié)同增效關(guān)系，彼此相須而不可離。研究表明二者聯(lián)用可協(xié)同增效從而限制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，并誘導(dǎo)其凋亡[14]。然而大黃素與小檗堿的共同包載的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

環(huán)糊精是一類重要的高分子材料，通過(guò)與藥物形成包合物結(jié)構(gòu)而實(shí)現(xiàn)提高難溶性藥物溶解性、增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性、改善藥物生物利用度等目的[15]。經(jīng)改性后的羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）與天然的β-環(huán)糊精相比，HP-β-CD水溶性大幅度提高，并具有更高的安全性[16]。以HP-β-CD包載大黃素，可增加大黃素的溶解度，提高其穩(wěn)定性。殼聚糖（CS）是一種帶正電的天然高分子化合物堿性多糖，來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，具有良好的生物相容性、可降解性、低毒、低致敏性和生物黏附性，可以延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的滯留時(shí)間和釋放時(shí)間，增加機(jī)體對(duì)藥物的吸收，已廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)用材料、靶向給藥等領(lǐng)域[17]。

為了提高大黃素與小檗堿的溶解度，本實(shí)驗(yàn)采用溶劑法制備Emo/HP-β-CD包合物（Emo/HP-β- CD），在此基礎(chǔ)上，以殼聚糖為載體，采用離子交聯(lián)法，與小檗堿和殼聚糖制備成大黃素/小檗堿-殼聚糖雙載藥納米粒（Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs），并對(duì)所制得納米粒進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期為大黃素與小檗堿新制劑的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用提供參考。

1 儀器與試劑

Nicomp 380ZLS型激光粒度分析儀，美國(guó)PSS公司；SJIA-10N-50型冷凍干燥機(jī)，寧波市雙嘉儀器有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Nicolet IS10傅里葉紅外光譜分析儀，美國(guó)熱電公司；JSM-IT300LA掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會(huì)社。

原料藥大黃素（批號(hào)XC20161203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、小檗堿（批號(hào)XC20170112，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%），西安小草植物科技有限責(zé)任公司；殼聚糖，浙江金殼有限公司；三聚磷酸鈉（TPP）、HP-β-CD，成都市科龍?jiān)噭┗S；對(duì)照品大黃素（批號(hào)MUST- 16110712，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.48%）、小檗堿（批號(hào)MUST- 16111115，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.95%），成都曼思特生物科技有限公司；85-2A數(shù)顯恒溫測(cè)速磁力攪拌器，金壇市白塔新寶儀器廠；甲醇，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；乙醇，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 Emo/HP-β-CD的制備

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果得知，將大黃素包載于HP-β-CD中，可提高大黃素的溶解性及穩(wěn)定性，再將其與小檗堿共同包載于殼聚糖中，從而增加載藥納米粒的體系穩(wěn)定性，有利于后續(xù)制劑制備。采用溶劑法進(jìn)行制備，稱取13.5 mg的大黃素溶解于一定量的乙醇溶液中，再將1.618 g的HP-β-CD溶于去離子水中，將大黃素溶液緩慢滴加進(jìn)HP-β-CD溶液中，磁力攪拌一定時(shí)間，然后自然揮干乙醇，之后將揮干后的溶液采用冷凍干燥的方法凍干成Emo/HP-β-CD凍干粉。

2.2 大黃素與小檗堿的含量測(cè)定

精密稱取大黃素對(duì)照品1.77 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋配制成質(zhì)量濃度為70.8 μg/mL的對(duì)照品溶液。

色譜條件[18]：色譜柱為Agilent EP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

取0.708、7.080、14.160、21.240、35.400、70.800 μg/mL大黃素對(duì)照品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，以大黃素對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝36.154－22.599，＝0.999 6，線性范圍0.708～70.800 μg/mL。

精密稱取小檗堿對(duì)照品20.260 mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成101.300 μg/mL的對(duì)照品溶液。根據(jù)文獻(xiàn)方法[19]調(diào)整色譜條件，色譜柱為Agilent EP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸水溶液（以三乙胺調(diào)pH至3）（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。取小檗堿對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程＝36.351＋10.989，＝0.999 5，線性范圍2.026～101.300 μg/mL。

2.3 殼聚糖納米粒（CS NPs）的制備

將100 mg的殼聚糖溶于100 mL 1%醋酸溶液中，配制成殼聚糖溶液；再將TPP溶于去離子水配制成TPP溶液；將TPP溶液逐滴滴加到不斷攪拌的殼聚糖溶液中，直至產(chǎn)生乳光，得到混懸液，即為CS NPs。

2.4 單因素考察CS NPs處方比例及工藝參數(shù)

2.4.1 CS NPs的平均粒徑及多分散系數(shù)（PDI）的測(cè)定 取上述制備的混懸液1 mL，采用納米激光粒度儀測(cè)定其粒徑及PDI，平行測(cè)定3次，取平均值。

2.4.2 殼聚糖與TPP質(zhì)量比對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響 將適量的殼聚糖溶于1%醋酸溶液中，配制成1 mg/mL的殼聚糖溶液；配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的TPP溶液；分別以殼聚糖與TPP質(zhì)量比為6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1，將TPP溶液逐滴滴加到不斷攪拌的殼聚糖溶液中，室溫下以600 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10 min，對(duì)殼聚糖與TPP質(zhì)量比進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表1。隨著TPP用量的增加，CS NPs平均粒徑和PDI均為先減小后增大，當(dāng)殼聚糖與TPP質(zhì)量比為3∶1時(shí)，平均粒徑和PDI最小，這可能是因?yàn)閹д姾傻臍ぞ厶桥c帶負(fù)電荷的TPP交聯(lián)，當(dāng)TPP用量過(guò)高時(shí)，使殼聚糖分子間交聯(lián)機(jī)率增大，從而使平均粒徑增加，因此，初步選擇殼聚糖與TPP質(zhì)量比為3∶1。

表1 不同殼聚糖和TPP質(zhì)量比下CS NPs平均粒徑和PDI比較 (, n = 3)

2.4.3 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響 在確定殼聚糖和TPP質(zhì)量比的基礎(chǔ)上，按“2.4.2”項(xiàng)下方法將適量的殼聚糖溶于1%醋酸溶液中，分別配制成質(zhì)量濃度為5、4、3、2、1 mg/mL的殼聚糖溶液；對(duì)殼聚糖質(zhì)量濃度進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表2。隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，平均粒徑不斷增大，而PDI先增大后減小，可能是當(dāng)殼聚糖質(zhì)量濃度較高時(shí)，較強(qiáng)的分子鏈間氫鍵結(jié)合力造成分子鏈間纏繞增加，使得交聯(lián)時(shí)較多的分子鏈參與單一粒子的形成而得到微米級(jí)粒子。因此，選擇質(zhì)量濃度為1 mg/mL的殼聚糖溶液。

表2 不同殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.4.4 攪拌速度對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響 取上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件以3∶1（殼聚糖∶TPP）的比例將TPP溶液逐滴滴加到不斷攪拌的殼聚糖溶液中，室溫下分別以200、300、400、500、600 r/min的轉(zhuǎn)速攪拌10 min，對(duì)攪拌速度進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表3。隨著攪拌速度的增大，平均粒徑逐漸減小，而PDI先減小后增大，攪拌速度在600 r/min時(shí)粒徑最小，此時(shí)體系中殼聚糖與TPP能夠充分交聯(lián)，因而選擇攪拌速度為600 r/min。

2.4.5 攪拌時(shí)間對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響 取上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，室溫下以600 r/min的速度分別攪拌2、5、10、15、20 min，對(duì)攪拌時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表4。隨著攪拌時(shí)間的增加，CS NPs平均粒徑和PDI均為先增大再減小再增大，而攪拌時(shí)間太短則不能使整個(gè)體系反應(yīng)充分，攪拌時(shí)間太長(zhǎng)則不利于體系的整體穩(wěn)定。因此，攪拌時(shí)間選擇10 min。

2.4.6 滴加速度對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響 取上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，將TPP溶液逐滴滴加到不斷攪拌的殼聚糖溶液中，滴加速度分別為15、30、60、120、240 s/mL，室溫下以600 r/min的速度分別攪拌10 min，對(duì)滴加速度進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)表5。隨著滴加時(shí)間的增加，平均粒徑先減小再增大，再減小后增大，而PDI先減小再增大再減小，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的穩(wěn)定性及平均粒徑的變化情況來(lái)看，當(dāng)?shù)渭铀俣葹?0 s/mL時(shí)，整個(gè)體系的穩(wěn)定性最佳，因而選擇滴加速度為60 s/mL。

表3 不同攪拌速度對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

表4 不同攪拌時(shí)間對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

表5 不同滴加速度對(duì)CS NPs平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.5 小檗堿-殼聚糖納米粒（Ber-CS NPs）的制備

選擇上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，將小檗堿配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，再分別以小檗堿與載體質(zhì)量比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8制備Ber-CS NPs，平行實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)定Ber-CS NPs平均粒徑和PDI，結(jié)果見(jiàn)表6。隨著小檗堿用量的增大，平均粒徑逐漸增大，相較于空白組，平均粒徑都略有增長(zhǎng)，說(shuō)明小檗堿進(jìn)入了載體中，而載藥比例將進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化。

表6 不同小檗堿與載體比例對(duì)Ber-CS NPs平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.6 Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs的制備

在上述Ber-CS NPs的基礎(chǔ)上，加入EMO/HP- β-CD溶液，分別以藥載比為1∶6、2∶6、3∶6的比例制備Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs，平行實(shí)驗(yàn)3次。測(cè)定其平均粒徑和PDI，結(jié)果見(jiàn)表7，隨著大黃素包合物用量的增加，平均粒徑也逐漸增大，相較于空白組，平均粒徑略有增大，說(shuō)明大黃素包合物被載體包載，為確定合適的藥載比，后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化其比例。

表7 不同大黃素包合物與載體比例對(duì)Emo/HP-β-CD-Ber- CS NPs平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.7 Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs制備工藝優(yōu)化

2.7.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) 為得到最佳的制備工藝，在結(jié)合文獻(xiàn)和前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇TPP與殼聚糖質(zhì)量比（A）、小檗堿與載體質(zhì)量比（B）以及Emo/HP-β-CD與載體質(zhì)量比（C）為考察因素，以Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化其工藝參數(shù)，因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8。以平均粒徑（1）和PDI（2）的總評(píng)歸一值（overall desirability，OD）為考察指標(biāo)，1和22個(gè)指標(biāo)取值均為越小越好，因此，選用d＝(max－Y)/(max－min)和OD＝(1×2…×d)1/k進(jìn)行計(jì)算，得到OD＝1.149 79－0.422 62 A－8.578 04 B＋7.862 53 C＋14.185 08 AB＋21.741 36 AC＋35.954 23 BC－13.458 54 A2－11.699 15 B2－48.071 86 C2，2＝0.828 5，＝0.047 4＜0.05。擬合方程具有相關(guān)性和顯著性。

表8 EMO/HP-β-CD-Ber-CS NPs制備工藝Box-Behnkn實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken效應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果（圖2），得到優(yōu)化后的最優(yōu)處方為T(mén)PP與殼聚糖質(zhì)量比為0.25，小檗堿與載體質(zhì)量比為0.17，Emo/HP-β-CD與載體質(zhì)量比為0.21，為了便于稱量和計(jì)算，修正處方為小檗堿與載體質(zhì)量比為0.166，Emo/HP-β-CD與載體質(zhì)量比為0.2。

圖2 A、B、C對(duì)OD值影響的效應(yīng)曲面圖

2.7.2 處方驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述修正的最優(yōu)處方，平行制備3批EMO/HP-β-CD-Ber-CS NPs，結(jié)果見(jiàn)圖3。測(cè)得平均粒徑為（178.0±2.0）nm，PDI為0.187±0.006，平均OD值為0.953 6，預(yù)測(cè)OD值為0.974 6，Zeta電位為（11.02±0.03）mV，各實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明采用OD法得到的回歸方程預(yù)測(cè)性良好，處方的優(yōu)化較為理想。

2.8 載藥納米粒穩(wěn)定性考察

將制備的Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs混懸液分別保存于4 ℃冰箱與室溫（溫度為18～25 ℃）條件下，分別在0、1～7、9 d定時(shí)取樣測(cè)定其平均粒徑及PDI大小變化，考察其穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)表9。經(jīng)過(guò)考察發(fā)現(xiàn)，保存于4 ℃冰箱和室溫中的納米粒外觀沒(méi)有太大變化，仍是淡藍(lán)色乳光的膠體溶液。由表10可知，冰箱中Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs測(cè)得的平均粒徑和PDI各項(xiàng)指標(biāo)變化不大，說(shuō)明Emo/ HP-β-CD-Ber-CS NPs在9 d內(nèi)4 ℃條件下穩(wěn)定性良好。但室溫下測(cè)得的Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs的平均粒徑和PDI發(fā)生明顯變化，且總體上呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)。所以納米粒膠體溶液應(yīng)保存于低溫條件下，低溫條件下，載藥納米粒具有一定的穩(wěn)定性。但后續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的物理穩(wěn)定效果仍需進(jìn)一步考察。

圖3 采用最佳制備工藝制備的Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs的粒徑

表9 4 ℃和室溫下納米粒的穩(wěn)定性(n = 3)

2.9 Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs凍干粉的制備

2.9.1 凍干保護(hù)劑種類的考察 按最優(yōu)處方制備納米粒，分別加入6%的常用凍干保護(hù)劑山梨醇、甘露醇、乳糖、葡萄糖制備凍干粉，并設(shè)置空白對(duì)照組，然后全部置于凍干容器中，置?55 ℃冷凍干燥機(jī)中預(yù)凍12 h，再減壓冷凍干燥48 h，即得Emo/ HP-β-CD-Ber-CS NPs凍干粉。將所得凍干制劑加適量去離子水復(fù)溶，測(cè)試其平均粒徑和PDI，考察不同種類凍干保護(hù)劑對(duì)納米粒的保護(hù)作用。通過(guò)表10可以看出，未加凍干保護(hù)劑的空白組凍干粉質(zhì)地相對(duì)粗糙，復(fù)溶后粒徑增大最為明顯。以葡萄糖作為凍干保護(hù)劑時(shí)，凍干粉外觀形狀良好，稍有黏性，復(fù)溶迅速。因此考慮選擇葡萄糖作為凍干保護(hù)劑，再進(jìn)行后續(xù)用量考察。

表10 凍干保護(hù)劑種類對(duì)凍干粉外觀及平均粒徑和PDI的影響 (, n = 3)

2.9.2 凍干保護(hù)劑葡萄糖用量的考察 按最優(yōu)處方制備納米粒，分別加入2%、4%、6%、8%的葡萄糖，空白組不加凍干保護(hù)劑。通過(guò)冷凍干燥法制備凍干制劑，考察各組制劑的凍干效果。將所得凍干制劑加適量去離子水復(fù)溶，測(cè)試其平均粒徑和PDI，考察不同用量葡萄糖對(duì)納米粒的保護(hù)作用。通過(guò)表11可以看出，當(dāng)加入6%的葡萄糖，凍干粉表面較為均勻，無(wú)坍塌稍有黏性，加入去離子水后能迅速?gòu)?fù)溶。綜合考慮，選用6%的葡萄糖作為凍干保護(hù)劑，可用于制劑的后續(xù)研究。

表11 不同葡萄糖用量對(duì)Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs平均粒徑和PDI的影響(, n = 3)

2.10 Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs凍干粉的表征

2.10.1 SEM觀察形態(tài) 分別取適量大黃素和小檗堿原料藥以及Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs凍干粉，黏附于樣品池上，表層減壓噴金處理以增加其電導(dǎo)率，于SEM下觀察其形態(tài)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，大黃素原料藥為大小不均勻的塊狀，雜亂無(wú)章；小檗堿原料藥大小不一，表面粗糙；而Emo/HP-β- CD-Ber-CS NPs凍干粉為大小較均勻的棒狀，表面較為光滑。

2.10.2 紅外光譜（FT-IR）檢測(cè) 取大黃素原料藥、小檗堿原料藥、物理混合物和Emo/HP-β-CD-Ber-CSNPs凍干粉作為樣品，與KBr混合壓片，分別在4000～400 cm?1掃描，進(jìn)行FT-IR分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。小檗堿原料藥在1 567.91、1 504.26 cm?1具有明顯的特征峰，而大黃素原料藥在1 473.27、1 272.85 cm?1處顯示特征峰，物理混合物和Emo/HP-β-CD- Ber-CS NPs凍干粉均保留了大黃素和小檗堿的特征峰，且未出現(xiàn)新的吸收峰，表明大黃素和小檗堿在納米粒中化學(xué)結(jié)構(gòu)并未改變。

圖4 大黃素原料藥、小檗堿原料藥和Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs凍干粉

圖5 小檗堿原料藥(a)、大黃素原料藥(b)、小檗堿和大黃素物理混合物(c)、Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs凍干粉(d) 的FT-IR

2.11 體外溶出度的測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2020年版四部項(xiàng)下第二法（槳法）進(jìn)行溶出度測(cè)定，稱取等量Emo/HP-β-CD-Ber- CS NPs凍干粉與大黃素、小檗堿原料藥，以900 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）為介質(zhì)，控制實(shí)驗(yàn)溫度為（37.0±0.5）℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，分別于5、20、40、60、120 min取樣5 mL（補(bǔ)足同溫等量介質(zhì)），經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，照HPLC法分別測(cè)定其峰面積，計(jì)算藥物溶出度，并繪制溶出曲線，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖可知，凍干粉中，大黃素和小檗堿在120 min時(shí)的溶出率分別達(dá)到了72.12%和82.55%，而大黃素和小檗堿原料藥的溶出率不超過(guò)25%，具有顯著差異性，說(shuō)明大黃素和小檗堿制成凍干粉能提高其體外溶出度。

圖6 Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs凍干粉和大黃素、小檗堿原料藥的溶出曲線

2.12 載藥量及溶解度的測(cè)定

取適量納米粒凍干粉，甲醇超聲溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算載藥量（載藥量＝藥/總，其中藥為大黃素或小檗堿的實(shí)際測(cè)得量，總為凍干粉總質(zhì)量），根據(jù)測(cè)得值計(jì)算得出，小檗堿和大黃素的載藥量分別為0.95%和0.34%。取過(guò)量大黃素、小檗堿原料藥及納米粒凍干粉，pH 6.8緩沖液溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算溶解度。根據(jù)測(cè)得值計(jì)算得出，大黃素和小檗堿原料藥的溶解度分別為9.21 μg/mL和153.05 μg/mL，而納米粒凍干粉中大黃素和小檗堿的溶解度分別為23.95 μg/mL和167.87 μg/mL，較其原料藥，二者溶解度均有一定的增大。

3 討論

口服緩釋納米粒是新一代亞微粒給藥系統(tǒng)，殼聚糖是陽(yáng)離子聚合物，因其具有生物可降解性、生物相容性及靶向性等特點(diǎn)，已成為納米藥物載體的研究熱點(diǎn)[20-21]，TPP是一種在水溶液中帶負(fù)電荷的小分子陰離子化合物，殼聚糖中帶正電的基團(tuán)與TPP中帶負(fù)電的基團(tuán)通過(guò)靜電作用相互吸引，殼聚糖長(zhǎng)鏈就團(tuán)聚形成納米粒，所以殼聚糖與TPP的比例是形成納米粒的關(guān)鍵之一。當(dāng)殼聚糖量較大時(shí)，TPP相對(duì)不足，不能交聯(lián)成球；而殼聚糖量的減小，黏度降低，分散的長(zhǎng)鏈和適當(dāng)?shù)腡PP含量有利于殼聚糖分子交聯(lián)成球；當(dāng)殼聚糖量較小，而TPP相對(duì)含量較高時(shí)，殼聚糖表面游離氨基數(shù)目減少，電荷逐漸接近于零，整個(gè)體系失去靜電排斥作用而團(tuán)聚進(jìn)而發(fā)生沉淀[22-23]。小檗堿帶正電荷，與殼聚糖及TPP以靜電吸附的方式而結(jié)合，大黃素被HP-β-CD包合形成包合物后，以空間作用與空白納米粒結(jié)合，從而形成雙載藥納米粒。攪拌速度適當(dāng)時(shí)，制得納米粒粒徑分布較窄，而過(guò)于激烈時(shí)，較強(qiáng)的剪切力會(huì)破壞粒子間的靜電斥力及水化層阻隔而造成粒子間聚集[22]，本實(shí)驗(yàn)因未進(jìn)行更大轉(zhuǎn)速的考察而存在不足之處，后續(xù)應(yīng)改進(jìn)。

離子交聯(lián)法作用時(shí)間短、條件較溫和，未使用有機(jī)溶劑，未經(jīng)歷高溫高壓，對(duì)于所包載藥物的生物性質(zhì)影響較小，且易于得到較為穩(wěn)定、均一的納米粒。本研究以納米粒的粒徑和PDI為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出影響較大的3個(gè)因素，并通過(guò)3因素3水平的Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化得到最終處方。處方驗(yàn)證試驗(yàn)證實(shí)，該最優(yōu)處方使納米粒粒徑和PDI均較小，且增加了大黃素與小檗堿的溶解度。以6%葡萄糖為保護(hù)劑所得到的凍干粉表面較為平整，質(zhì)地均一。

載藥納米粒中小檗堿與大黃素的載藥量的比例約為3∶1，這與張仲景所著《金匱要略》的大瀉心湯中的黃連-大黃3∶1的用藥比例相吻合，基本符合經(jīng)方中記載的用藥比例，相較于目前的上市產(chǎn)品一清膠囊中大黃-黃連3∶1的用量，納米粒與其用量有一定的差異。然而大黃黃連臨床使用廣泛，常以不同的劑量和炮制品相須配伍使用[24]，因此二者用藥比例不盡相同。

綜上，本研究較好的解決了大黃素與小檗堿難溶性的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了二者的共同載藥，制得的凍干粉增加了其納米粒的穩(wěn)定性并提高其溶出度，復(fù)溶效果較好，為后續(xù)相關(guān)制劑的研究奠定了基礎(chǔ)，但對(duì)其生物利用度能否提高仍需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Lin C C, Chang C H, Yang J J,. Hepatoprotective effects of emodin from[J]., 1996, 52(2): 107-111.

[2] Chang C H, Lin C C, Yang J J,. Anti-inflammatory effects of emodin from[J]., 1996, 24(2): 139-142.

[3] Feng Y, Huang S L, Dou W,. Emodin, a natural product, selectively inhibits 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and ameliorates metabolic disorder in diet-induced obese mice [J]., 2010, 161(1): 113-126.

[4] Goel R K, Das Gupta G, Ram S N,. Antiulcerogenic and anti-inflammatory effects of emodin, isolated fromWall [J]., 1991, 29(3): 230-232.

[5] Kuo Y C, Meng H C, Tsai W J. Regulation of cell proliferation, inflammatory cytokine production and calcium mobilization in primary human T lymphocytes by emodin fromOhwi [J]., 2001, 50(2): 73-82.

[6] Garg A K, Buchholz T A, Aggarwal B B. Chemosensitization and radiosensitization of tumors by plant polyphenols [J]., 2005, 7(11/12): 1630-1647.

[7] 馬林, 劉小翠, 鄧斌. 小檗堿通過(guò)影響糖原結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)肝糖代謝研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(16): 4259-4265.

[8] 劉昊, 周志斌. 小檗堿調(diào)脂的研究進(jìn)展 [J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2019, 42(8): 1676-1679.

[9] 曹力凡, 周綱, 楊建設(shè), 等. 鹽析法制備小檗堿殼聚糖納米載藥微球 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2014, 20(1): 5-8.

[10] 孟治平, 路曼琪, 蘇文強(qiáng), 等. 鹽酸小檗堿粉霧劑的制備及其對(duì)金黃色葡萄球菌肺炎的作用研究 [J]. 中草藥, 2020, 50(2): 348-355.

[11] 郭江紅, 任剛, 蔣建東. 小檗堿通過(guò)改善代謝水平抗肝細(xì)胞癌的研究進(jìn)展 [J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2018, 33(3): 703-708.

[12] 孫強(qiáng), 何曼, 張夢(mèng), 等. 小檗堿抗腫瘤作用機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(2): 603-612.

[13] 林愛(ài)華, 李鴻燕, 劉奕明, 等. 小檗堿殼聚糖納米粒的制備及其體外釋藥特性研究 [J]. 中國(guó)藥房, 2007, 18(10): 755-757.

[14] Ponnusamy L, Kothandan G, Manoharan R. Berberine and emodin abrogates breast cancer growth and facilitates apoptosis through inactivation of SIK3-induced mTOR and Akt signaling pathway [J]., 2020, 1866(11): doi: 10.1016/j.bbadis.2020.165897.

[15] Harata K. The structure of the cyclodextrin complex. IV. the crystal structure of α-cyclodextrin-sodium 1-propanesulfonate nonahydrate [J]., 1977, 50(5): 1259-1266.

[16] Manka J S, Lawrence D S. Template-driven self-assembly of a porphyrin-containing supramolecular complex [J]., 1990, 112(6): 2440-2442.

[17] Zhang J, Chen X G, Sun G Z,. Effect of molecular weight on the oleoyl-chitosan nanoparticles as carriers for doxorubicin [J]., 2010, 77(2): 125-130.

[18] 馬祖兵, 李小芳, 謝龍, 等. 大黃素自微乳-微丸的制備及其體外評(píng)價(jià) [J]. 中藥材, 2019, 42(1): 144-149.

[19] 田雁鈺. HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒肺熱平膠囊中兩組分含量 [J]. 中國(guó)藥師, 2010, 13(9): 1350-1351.

[20] Fan W, Yan W, Xu Z S,. Formation mechanism of monodisperse, low molecular weight chitosan nanoparticles by ionic gelation technique [J]., 2012, 90: 21-27.

[21] 陳田娥, 王鴿, 陳敏婷, 等. TPGS-殼聚糖載紫杉醇膠束的制備及大鼠在體腸吸收研究 [J]. 中草藥, 2018, 49(24): 5780-5786.

[22] Wang X M, Chi N, Tang X. Preparation of estradiol chitosan nanoparticles for improving nasal absorption and brain targeting [J]., 2008, 70(3): 735-740.

[23] Vila A, Sánchez A, Janes K,. Low molecular weight chitosan nanoparticles as new carriers for nasal vaccine delivery in mice [J]., 2004, 57(1):123-131.

[24] 張薛光. 談?wù)剬?duì)《金匱要略》瀉心湯出處、方名的理解 [J]. 中醫(yī)文獻(xiàn)雜志, 2007, 25(3): 9-12.

Optimization of prescription process of emodin/berberine chitosan dual drug-loaded nanoparticles by Box-Behnken response surface method

XIE Qing-xuan, LI Xiao-fang, XIE Long, WANG Xian, CAO Yi, LIANG You-dan

Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Sichuan Key Laboratory of Research and Utilization of Chinese Medicine Resources, Key Laboratory Breeding Base of Co-founded by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology, College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137, China

To optimize the preparation process and formulation of emodin (Emo) and berberine (Ber) chitosan (CS) dual drug-loaded nanoparticles, and investigate its stability and dissolution.Using CS as the carrier and sodium tripolyphosphate (TPP) as the cross-linking agent, emodin/hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) and Ber were encapsulated by ion cross-linking method to obtain drug-loaded nanoparticles (Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs). Then, with particle size and polydispersity index (PDI) as independent variables, data processing was performed using the overall desirability value method, and the Box-Behnken effect surface method was used to optimize the prescription and verify it. Finally, a preliminary screening of the optimal freeze-drying conditions of the nanoparticles was carried out，and the type and dosage of lyoprotectants was investigated.The optimized preparation process was as follows: mass ratio of TPP to CS was 3:1, Ber to carrier was 0.166:1, and Emo/HP-β-CD to carrier was 0.2:1. The measured average particle size was (178.0 ± 2.0) nm, PDI was 0.187 ± 0.006, and the average OD value was 0.953 6. The measured value was close to the predicted value. The drug loading of Emo and Ber were 0.34% and 0.95, respectively. Stability investigation showed that the nanoparticles colloidal solution was physically stable when stored at 4 ℃ within 9 d. And the freeze-dried formulation prepared with 6% glucose as the protective agent had better effect and rapid reconstitution. The average particle size after redispersion was (161.8 ± 4.8) nm，and PDI was 0.263 ± 0.047.release studies have shown that the solubility and dissolution of drug-loaded nanoparticle freeze-dried powder were significantly improved.The model established by the Box-Behnken response surface method can be used to optimize the formulation of Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs with high accuracy and good prediction effect. And the preparation process of Emo/HP-β-CD-Ber-CS NPs is stable and feasible.

emodin; hydroxypropyl-β-cyclodextrin; berberine; chitosan; nanoparticles; Box-Behnken response surface method; overall desirability value; ion cross-linking method

R283.6

A

0253 - 2670(2021)06 - 1614 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.06.009

2020-10-10

四川省科技廳項(xiàng)目（2019YFS0113）；國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2018YZ03002）；四川省科技廳苗子工程委員會(huì)（2020095）

謝青璇（1996—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿⑿聞┬?、新技術(shù)。Tel: 18375760856 E-mail: 635544103@qq.com

李小芳（1964—），女，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮聞┬?、新制劑、新技術(shù)。Tel: 13808195110 E-mail: lixiaofang@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]