逍遙散治療盜汗的網(wǎng)絡藥理學作用機制探討*

張 鵬，于靖澤，龍婷婷，李江洪，莫 易，劉 浪，李勇昊

(1 重慶科技學院化學化工學院，重慶 401331；2 工業(yè)發(fā)酵微生物重慶市重點實驗室(重慶科技學院)，重慶 401331)

盜汗，因僅表現(xiàn)為熟睡時汗液大量排出，故常常被人忽視。然而近年大量研究報道顯示盜汗與各類病癥都均有聯(lián)系，作為常見并發(fā)癥，部分糖尿病患者，會伴以盜汗，半夜出汗量大，汗液粘稠，醒后伴有強烈的口干舌燥感，四肢乏力，心情煩悶[1]。乙型肝炎部分患者伴有盜汗現(xiàn)象，加重患者身體疲乏感[2]。以上臨床案例的舉隅均顯示關于盜汗治療的機制研究應被重視，故本實驗探究逍遙散治療盜汗的分子作用機制在當下顯得更為必要。

逍遙散在宋朝即有記載，療效明確，臨床應用十分廣泛，可治療的疾病達167種，涵蓋婦科、精神科、內分泌科、兒科等學科[3]。盜汗乃陰虛的體現(xiàn)，而“汗乃心液”，若長期盜汗，則使心陰耗損十分嚴重[4]，體質變虛弱，機體免疫力下降，長此以往，將對機體器官造成不可逆的影響。因此，對治療盜汗作用機制的研究有十分重要的意義。

以往藥物學發(fā)展中，總是依據(jù)“一個藥物，一個靶點對應一種疾病”進行藥物機制探索[5]，而中醫(yī)特點在于各種化合物和靶點的聯(lián)合作用，故以往對中藥作用機制的探索受限[6]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學挖掘逍遙散活性化合物及作用靶基因從而建立成分-靶點網(wǎng)絡，基于盜汗疾病靶點找到核心基因，構建PPI蛋白互作網(wǎng)絡，并對核心基因進行GO富集和KEGG代謝通路分析，探究逍遙散治療盜汗的分子作用機制，為后續(xù)研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 有效成分的篩選

逍遙散共有白術、白芍、當歸、甘草、茯苓和柴胡六味中藥，在TCMSP[7](https://tcmspw.com/tcmsp.php)分別檢索中藥含有的活性化合物，并以生物口服利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(Drug likeness，DL)≥0.18以及細胞單層模型的吸收(Caco-2)≥-0.4為篩選條件，獲取逍遙散有效成分。

1.2 有效成分靶點的預測及基因注釋

結合TCMSP、Pub Chem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)和Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch)數(shù)據(jù)庫得到成分相關靶基因，并對靶點注釋為基因名。

1.3 疾病靶點的預測

利用Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)檢索關鍵詞“Night sweat”收集盜汗相關基因，并以相關性得分(Relavance score)≥10為條件對盜汗相關基因進行篩選。

1.4 獲取藥物作用疾病核心靶基因

在Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)和Draw Venny (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)中對盜汗相關基因和逍遙散靶點基因相互映射，得到盜汗相關靶點-逍遙散作用靶點韋恩圖，從而得到逍遙散治療盜汗的核心基因。

1.5 有效成分-靶點網(wǎng)絡的構建及分析

將有效成分名稱和化合物對應靶點匯總后整理，分別建立Network表格和Type表格，導入Cytoscape軟件，構建逍遙散有效成分-靶點網(wǎng)絡圖，根據(jù)連線數(shù)目繪制柱狀圖，獲取核心基因。

1.6 逍遙散與盜汗相關靶點蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡的構建

將“1.4”所得，核心靶基因導入STRING(https://string-db.org)，選擇人類(Homo sapiens) 為研究物種，獲取蛋白相互作用網(wǎng)絡。利用Cytoscape軟件將網(wǎng)絡可視化處理，導出核心基因子網(wǎng)絡，獲取核心基因關鍵作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡。

1.7 GO富集和KEGG通路分析

運用R語言中的RSQLite、BiocManager、colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler和pathview安裝包對核心靶基因進行GO和KEGG通路分析，以pvalue<0.05為篩選條件，得到靶點蛋白主要涉及的生物學功能和主要作用通路，以圓圈圖和柱狀圖的形式顯示最后結果，根據(jù)關鍵基因在通路中的富集情況，以及通路的P值大小，獲得逍遙散治療盜汗的關鍵作用通路。

2 結 果

2.1 逍遙散有效成分的篩選

以OB≥30%、DL≥0.18和Caco-2≥-0.4為條件進行ADME篩選，共得獲得137個有效化合物，其中柴胡16個、白芍9個、白術7個、當歸2個、甘草88個以及茯苓15個；除去無人類靶基因的化合物及重復值，共106個逍遙散活性化合物納入研究，主要有效成分，見表1。

表1 逍遙散有效成分信息

2.2 構建“逍遙散有效成分-靶點”網(wǎng)絡并分析

結合TCMSP、Pub Chem以及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫，預測逍遙散有效成分靶基因。利用Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因名注釋，得到逍遙散有效成分靶點1009個。利用Cytoscape軟件，構建逍遙散有效成分-靶點網(wǎng)絡，結果如圖1A所示。

分析網(wǎng)絡拓撲結構性質顯示圖中共包含節(jié)點1121個，邊5077條。其中成份106個，靶蛋白4963個；靶點度值越高，與有效成分之間連線數(shù)目越多，則該基因是核心靶點的可能性越大對網(wǎng)絡圖中主要成分和基因進行可視化，結果分別如圖1B和1C所示。由圖1可知山萘(kaempferol)、谷甾醇(sitosterol)、丁子香萜(Mairin)和香樹脂醇(α-Amyrin)有效化合物的Degree值最高，是逍遙散作為藥物治療疾病過程中的主要活性化合物。

2.3 盜汗疾病靶點及遙散治療盜汗核心靶點的預測

在Gene Carts平臺檢索關鍵詞“Night sweat”收集盜汗疾病相關靶點，并以相關性得分(Relavance score)>10為篩選條件，最終獲得盜汗相關疾病靶基因183個。

利用Venny 2.1和Draw Venny軟件將逍遙散有效成分預測靶點與盜汗疾病相關靶點相互映射，繪制出逍遙散作用靶點與盜汗疾病相關靶點韋恩圖，如圖2所示，交集得到59個逍遙散治療盜汗的“關鍵靶點”，分別占逍遙散對應靶基因的5.9%和盜汗靶基因的32.2%。主要靶基因有IL-6、STAT3、PIK3CA、VEGFA、PTPN11等。

圖2 逍遙散作用靶點與盜汗相關靶點的交集

2.4 構建蛋白質網(wǎng)絡互作網(wǎng)絡(PPI)

通過STRING平臺分析59個逍遙散治療盜汗核心靶基因蛋白互作網(wǎng)絡，隱藏共表達連線(Co-expression)和單獨的節(jié)點(Simplifications)得到繪制PPI網(wǎng)絡。共包含54個節(jié)點，242條線。

圖3 逍遙散對盜汗靶點蛋白的相互作用網(wǎng)絡(PPI)

圖3A為STAT3蛋白互作網(wǎng)絡，有29個節(jié)點和168條線且紅色越深表示該蛋白重要性越大。STAT3、STAT6、JUN、EGFR、EGF和SRC在細胞中對信號傳遞、啟動基因轉錄、細胞增殖、凋亡以及遷移有關鍵作用[8-9]，分析可以對盜汗治療起一定的藥理作用。

IL-6蛋白在盜汗疾病相關靶點中相關性得分較高，在PPI網(wǎng)絡中度值較大，故構建該蛋白互作網(wǎng)絡，結果如圖3C所示。IL-6、IL-2、IL-1B、IL-4和IL-10均是炎性細胞因子，可通過抑制該基因，從而抑制炎癥反應；同時也是免疫細胞調節(jié)因子，有調節(jié)免疫的生物學功能[10]。

2.5 GO分析以及KEGG通路分析

利用Rstudio軟件中的RSQLite、BiocManager、colorspace、stringi、enrichplot、ggplot2、DOSE、clusterProfiler和pathview安裝包，以P<0.05為篩選條件，繪制GO功能富集圓圈圖(圖4)。逍遙散涉及的基因功能主要集中于5類，分別是激活蛋白激酶活性(activation of protein kinase activity)、肽基酪氨酸的改性(peptidyl-tyrosine modification)、肽基酪氨酸磷酸化(peptidyl-tyrosine phosphorylation)、MAP激酶活性的正調控(positive regulation of MAP kinase activity)以及絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調控(positive regulation of protein serine/threpnine kinase activity)。

圖4 GO功能富集圓圈圖

KEGG通路富集分析篩選到20條主要信號通路，如圖5所示。圖5中矩形顏色越紅，P值越小，顯著性越大；矩形越長，在該條通路富集的基因數(shù)目越多。靶點主要富集在以下通路絲裂原活化蛋白激酶(MAPK signaling pathway)、PI3K-AKT(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT (JAK-STAT signaling pathway)和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)?？芍羞b散可以通過以上多條通路作用于盜汗，直觀反映出了逍遙散治療盜汗的多通路特征。

圖5 KEGG通路富集分析柱狀圖

KEGG分析中EGFR信號通路為逍遙散影響的主要通路，如圖5所示。逍遙散有效成分作用該通路多達18個基因。分析逍遙散主要通過作用該信號通路起到治療盜汗的目的作用，同時相關研究顯示若ECFR通路持續(xù)活化，將對腫瘤細胞連續(xù)傳遞增殖、抗凋亡的信號，在癌癥和腫瘤的表達中都具有重要意義[11]。

3 結 論

構建“逍遙散-核心化合物-靶點基因”網(wǎng)絡，分析了逍遙散治療盜汗的主要有效成分。并挖掘逍遙散對應核心靶點STAT3、PIK3CA、JUN、VEGFA、SRC、PTPN11、IL-6和AKT1，不同有效成分可作用于相似靶點，從而發(fā)揮共性效應[12]。

根據(jù)韋恩圖中交集部分基因，找到逍遙散治療盜汗的關鍵靶點，篩選出盜汗疾病相關性得分較高的基因。其中STAT3在細胞中對信號傳遞和啟動基因轉錄有關鍵作用，近年來大量研究表明，當STAT3信號顯示異常時，細胞不斷增殖，誘發(fā)炎癥，破壞機體免疫系統(tǒng)[13]；IL-6作為血清炎癥因子，免疫細胞調節(jié)因子，它可以通過調節(jié)細胞的免疫功能從而控制炎癥的發(fā)展狀況和機體的防御功能，如若機體炎癥不得以控制，將引起不同程度的組織損傷[14]。據(jù)此探究出逍遙散治療盜汗疾病在于提升機體細胞的免疫功能以及控制機體炎癥，若不及時治療將對人體帶來不可逆的傷害。

在KEGG通路分析中表明逍遙散主要通過五條通路對盜汗起治療作用，因EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance通路中富集關鍵基因數(shù)目最多，且P值在前五條通路中顯示最低，故篩選出EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance作為關鍵通路。EGFR作為受體型酪氨酸激酶之一，通過刺激細胞分裂，完成組織修復。EGFR過度活化，將加劇炎癥反應，對中樞神經系統(tǒng)產生不可逆的損傷。研究表明藥物可以通過抑制EGFR以達到提升患者免疫功能，延長存活時間的目的[15]。由此可知EGFR信號通路在細胞免疫以及炎癥反應中均有重要作用?？膳卸⊿TAT3，VEGFA，IL-6，PIK3CA，SRC，AKT1等關鍵基因，通過 EGFR信號通路，對細胞炎癥和機體免疫系統(tǒng)調節(jié)等生物學功能做出調控，從而達到治療盜汗的目的。

本次研究基于網(wǎng)絡藥理學篩選得到逍遙散治療盜汗的潛在靶基因，以上靶基因可能通過EGFR信號通路調控細胞免疫以及炎癥反應而達到治愈盜汗的效果。本次實驗對分子作用機制做出了初步探索，為進一步深入研究其機制提供了一定科學依據(jù)。