基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初探川續(xù)斷皂苷乙的藥理作用

霍艷杰， 何超平， 全文娟， 陳 煜， 庹勤慧

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院，2.醫(yī)學(xué)院，3.科技處，湖南省長(zhǎng)沙市410208)

續(xù)斷(DipsacusasperoidesC.Y.ChengetT.M.Ai)來(lái)源于川續(xù)斷科植物川續(xù)斷的根，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏等功效[1]。近些年來(lái)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為續(xù)斷主要活性成分的研究較為廣泛，其具有促進(jìn)新血管生成[2]、抗炎[3]、抗骨質(zhì)疏松[4]等作用。川續(xù)斷皂苷Ⅵ是一類(lèi)五環(huán)三萜齊墩果烷類(lèi)皂苷化合物[5]，與其基本結(jié)構(gòu)母核相同的是川續(xù)斷皂苷乙(dipsacoside B,DB)，DB來(lái)源于續(xù)斷與山銀花，在山銀花的含量較多，根據(jù)五環(huán)三萜類(lèi)化合物具有抗炎、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物活性的特點(diǎn)[6]，推測(cè)DB具有較好的藥理活性，但其藥理作用鮮有報(bào)道，探究DB藥理作用對(duì)開(kāi)發(fā)山銀花新的藥用價(jià)值具有重大意義。網(wǎng)路藥理學(xué)近些年來(lái)發(fā)展迅速，可以對(duì)中藥藥物重定位，同時(shí)建立“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)分析中藥作用機(jī)制[7]。在中藥單體方面，人參皂苷傳統(tǒng)用于心血管領(lǐng)域，在網(wǎng)絡(luò)藥理應(yīng)用后逐漸向神經(jīng)保護(hù)與抗癌方面發(fā)展[8]。對(duì)于中藥復(fù)方的應(yīng)用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)中藥的多成分與多靶點(diǎn)對(duì)接，符合中醫(yī)對(duì)疾病治療的整體性[9]，在中藥的靶點(diǎn)篩選以及作用方面網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建有較好的效果。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)DB進(jìn)行靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)靶標(biāo)采用分子生物學(xué)方法驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)株(A7R5)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘雅中心實(shí)驗(yàn)室；FBS(P30-3306)胎牛血清購(gòu)自Pan公司；DMEM(12800017)購(gòu)自Gibco公司；姜黃素由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，純度為98%。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)(A9525-1 mg)、胰蛋白酶(T7409)、MTT(M-2128)購(gòu)自Sigma公司，EDU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(C0078S)購(gòu)自碧云天生物公司，DyLight 594紅色熒光二抗(E032410)購(gòu)自Jakson公司，Anti-拓?fù)洚悩?gòu)酶2a(TOP2a)(ab52934)購(gòu)自Abcam公司，GAPDH抗體(10494-1-AP)、山羊抗兔IgG(H+L)(SA00001-2)購(gòu)自Proteintech公司，川續(xù)斷皂苷乙購(gòu)自南京春秋生物有限公司，純度>98%。

1.2 DB靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)

ChemMapper數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)基于分子相似性的靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件[10]，整合多種化合物與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)具有上萬(wàn)種化合物及生物活性、靶標(biāo)注釋?zhuān)瑥V泛用于新穎化合物靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)，通過(guò)具有評(píng)分排序預(yù)測(cè)靶標(biāo)。STRING是一個(gè)探究基因與基因、基因與蛋白、蛋白與蛋白之間相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)融合多種數(shù)據(jù)庫(kù)信息，可應(yīng)用于2 031個(gè)物種，包含960萬(wàn)種蛋白和1 380萬(wàn)種蛋白質(zhì)之間的相互作用，可以構(gòu)建相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，信息挖掘，同時(shí)可以作富集分析，對(duì)一個(gè)蛋白構(gòu)建相關(guān)蛋白的網(wǎng)絡(luò)，廣泛應(yīng)用于預(yù)測(cè)蛋白相互作用。

在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)下載DB的結(jié)構(gòu)式，在ChemMapper數(shù)據(jù)庫(kù)上以相似評(píng)分>0.8，結(jié)合DB生物活性庫(kù)的條件預(yù)測(cè)DB的靶標(biāo)，對(duì)預(yù)測(cè)的靶標(biāo)進(jìn)行下載。應(yīng)用IGEMDOCK分子對(duì)接軟件對(duì)DB與靶標(biāo)進(jìn)行對(duì)接，首先選擇活性對(duì)接位點(diǎn)，輸入化合物進(jìn)行對(duì)接，分析評(píng)分確定后續(xù)研究對(duì)象。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%FBS的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 MTT法檢測(cè)VSMCs活性

采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs，以8×103個(gè)/孔種板。同時(shí)周邊孔加入等體積PBS，避免邊緣化效應(yīng)。培養(yǎng)箱放置24 h后，棄去原培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基溶解DB，設(shè)置濃度梯度為1、3、10、30、100、300、1 000 μmol/L，同時(shí)加入1 μmol/L血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)增殖模型，每個(gè)孔加總?cè)芤毫?00 μL,培養(yǎng)24 h，后棄去，每孔加MTT液100 μL，孵育4 h。隨后吸出培養(yǎng)液，每個(gè)孔加入150 μL二甲亞砜(DMSO)，搖床上避光震搖10 min，在酶標(biāo)儀上570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

1.5 EdU檢測(cè)VSMCs增殖

采用EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長(zhǎng)階段，分為6組(處理細(xì)胞24 h)：對(duì)照組(高糖培養(yǎng)基)、AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ)、姜黃素(curcumin,Cur)+AngⅡ組(5 μmol/L Cur)、DB+AngⅡ組(分別用3、10、30 μmol/L DB處理)。加入100 μL/孔的50 μmol/L EdU標(biāo)記細(xì)胞4 h。去除培養(yǎng)液，100 μL/孔的4%多聚甲醛細(xì)胞固定15 min。去除固定液，每孔用1 mL洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次3～5 min。去除洗滌液，每孔加100 μL通透液0.3% Triton X-100孵育10～15 min。去除通透液，每孔用100 μL洗滌液洗1～2次，每次3～5 min。每孔加入100 μL Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板。室溫避光孵育30 min。吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3～5 min。吸除洗滌液后，每孔加Hoechst 33342溶液100 μL，室溫避光孵育10 min。吸除Hoechst 33342溶液。用洗滌液洗滌3次，每次3～5 min。然后進(jìn)行熒光檢測(cè)，倒置熒光顯微鏡(Olympus)圖像獲取及分析。

1.6 免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期VSMCs，以1×104個(gè)/孔接種于24孔板，按相應(yīng)分組(同1.5)處理24 h。細(xì)胞吸干液體，用4%甲醛固定細(xì)胞15 min。吸干固定液，用1×PBS漂洗3次，每次5 min。在封閉緩沖液中封閉60 min。在抗體稀釋緩沖液中配制一抗TOP2a(1∶1 000)。吸去封閉緩沖液，加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。用抗體稀釋緩沖液將熒光物質(zhì)標(biāo)記的二抗稀釋(1∶500)，室溫下避光孵育1 h。使用DAPI染色10 min，用PBS漂洗3次，每次5 min。倒置熒光顯微鏡(Olympus)獲取圖像。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

VSMCs以1×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，用含0.3%FBS的培養(yǎng)基同步化處理24 h。接著分為5組處理24 h：對(duì)照組(高糖培養(yǎng)基)、AngⅡ組(1 μmol/L AngⅡ處理)、DB+AngⅡ組(分別用3、10、30 μmol/L DB處理)。將無(wú)水乙醇-20 ℃預(yù)冷，然后用預(yù)冷的PBS配成75%乙醇固定液，分裝于2 mL EP管，置冰上備用。將細(xì)胞中的培養(yǎng)基倒掉，用預(yù)冷的PBS洗3遍。用0.25%胰酶消化細(xì)胞。在6孔板中加入含10%FBS的培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液。900 r/min,離心5 min,棄上清，加入2 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，再次900 r/min,離心5 min，棄上清。用離心管殘留的PBS吹打細(xì)胞成懸液，然后加入到預(yù)冷的75%乙醇固定液中，吹打均勻。用封口膜將EP管封口，置于4 ℃冰箱固定24 h。送至維爾生物科技公司做流式檢測(cè)。

1.8 WB法檢測(cè)蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞以5×108個(gè)/L接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%后，按相應(yīng)分組(同1.5)處理24 h。裂解收集細(xì)胞蛋白，使用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒配置10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠；上樣孔加樣20 μL。電泳100 V、100 min，將PVDF膜置于膠上濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，電流300 mA，時(shí)間2 h。PVDF置入含5%脫脂奶粉的TBS-T中，常溫45 min；TBS-T洗滌5 min×3次，孵育一抗，一抗和一抗稀釋液比例為1∶2 000，在4℃孵育12 h；利用TBS-T洗滌10 min×3次；二抗山羊抗兔IgG(H+L)與TBS-T比例為1∶5 000，室溫孵育1 h；用TBS-T洗滌10 min×3次；顯影液均勻滴加在PVDF膜上，曝光30 s、顯影定影；采用Alpha Imager 2200灰度掃描軟件進(jìn)行密度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 ChemMapper數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果

在ChemMapper數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)DB的靶標(biāo)蛋白預(yù)測(cè)評(píng)分>0.8，得到4個(gè)靶標(biāo)，分別是兔來(lái)源的糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,PYGM)、綿羊來(lái)源的環(huán)氧合酶1(cyclooxygenase 1,PTGS1)，以及人來(lái)源的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2a(topoisomerase 2a,TOP2a)和凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-xL(apoptosis regulator Bcl-xL,BCL-xL)(表1)。

表1 ChemMapper數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DB靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.2 iGEMDOCK分子對(duì)接結(jié)果

iGEMDOCK對(duì)接靶標(biāo)蛋白與DB，其中TOP2a(圖1A)、BCL-xL(圖1B)、PYGM(圖1C)、PTGS1(圖1D)能量值分別為-84.7 kJ/mol、-70.9 kJ/mol、-63.6 kJ/mol、-79.5 kJ/mol。圖1表示DB與相關(guān)蛋白氨基酸殘基的連接位點(diǎn)，能量值越低表示對(duì)接越穩(wěn)定，選取TOP2a作為后續(xù)研究靶點(diǎn)。

圖1 4種靶標(biāo)蛋白與DB分子對(duì)接結(jié)果A為DB與TOP2a對(duì)接圖；B為DB與BCL-xL對(duì)接圖；C為DB與PYGM對(duì)接圖；D為DB與PTGS1對(duì)接圖。

2.3 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白結(jié)果

在STRING預(yù)測(cè)結(jié)果，TOP2a與10種蛋白之間存在相互作用，節(jié)點(diǎn)數(shù)為11，邊數(shù)為47，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)8.55，P<0.001。在Cytoscape中分析關(guān)鍵靶點(diǎn)，TOP2a在網(wǎng)絡(luò)中為調(diào)控相關(guān)蛋白的關(guān)鍵靶點(diǎn)(圖2A)。

TOP2a相關(guān)蛋白的靶基因GO分析，排名前5的生物過(guò)程分別為有絲分裂細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、有絲分裂細(xì)胞周期過(guò)程、核分裂、染色體分離。分子功能具有三磷酸腺苷結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性、作用于蛋白質(zhì)的催化活性、細(xì)胞周期素依賴(lài)性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。細(xì)胞中的定位在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)合物、核、細(xì)胞器、主軸、微管組織中心(圖2B)。

TOP2a相關(guān)蛋白的靶基因在KEGG通路分析中作用在泛素介導(dǎo)的蛋白水解、p53信號(hào)傳導(dǎo)途徑、孕酮介導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、細(xì)胞周期(圖2C)。

GO分析與KEGG通路分析顯示，TOP2a作為關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂過(guò)程，因此，TOP2a參與細(xì)胞的周期與增殖。

2.4 DB對(duì)VSMCs活性和增殖率的影響

MTT結(jié)果顯示，DB對(duì)VSMCs沒(méi)有細(xì)胞毒性。與對(duì)照組比較，AngⅡ可以促進(jìn)VSMCs活性(P<0.01)。與AngⅡ組比較，3～1 000 μmol/L DB+AngⅡ組VSMCs的活性均降低，可見(jiàn)DB對(duì)VSMCs的細(xì)胞活性具有明顯抑制作用，并具有濃度依賴(lài)性(表2)。EdU結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AngⅡ可以提高VSMCs的增殖率(P<0.01)。與AngⅡ組比較，Cur與DB對(duì)VSMCs增殖率具有明顯抑制作用(表2)。

圖2 TOP2a相關(guān)蛋白GO與KEGG分析A為T(mén)OP2a相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖；B為T(mén)OP2a相關(guān)蛋白GO富集分析圖；C為T(mén)OP2a相關(guān)蛋白KEGG通路分析圖。

表2 DB對(duì)VSMCs 活性和增殖率的影響(n=6)

2.5 DB對(duì)VSMCs周期的影響

與對(duì)照組比較，AngⅡ組VSMCs中G1期細(xì)胞明顯降低，S期細(xì)胞明顯升高(P<0.05)。與AngⅡ組比較，不同濃度(3、10、30 μmol/L)DB+AngⅡ組G1期細(xì)胞明顯升高(P<0.05)，S期細(xì)胞明顯降低(P<0.05)，DB可能阻滯VSMCs的G1期向S期合成，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖(圖3，表3)。

2.6 DB對(duì)TOP2a蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，AngⅡ組VSMCs中TOP2a明顯上調(diào)，與AngⅡ比較，Cur+AngⅡ組與不同濃度(3、10、30 μmol/L)DB+AngⅡ組下調(diào)VSMCs中TOP2a的表達(dá)(圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)DB對(duì)VSMCs周期的影響

表3 DB對(duì)VSMCs周期的影響(n=3)

圖4 DB對(duì)TOP2a蛋白表達(dá)的影響(n=3)A為Western blot法測(cè)TOP2a蛋白表達(dá)的變化;B為免疫熒光法測(cè)TOP2a蛋白表達(dá)的變化(200×)。1為對(duì)照組;2為AngⅡ組;3為Cur+AngⅡ組；4為DB(3 μmol/L)+AngⅡ組；5為DB(10 μmol/L)+AngⅡ組；6為DB(30 μmol/L)+AngⅡ組。a為P<0.05，與對(duì)照組比較；b為P<0.05，與AngⅡ組比較。

3 討 論

本文嘗試用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的方式來(lái)探究DB潛在的生物活性靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DB具有抑制VSMCs增殖的作用。VSMCs在動(dòng)脈粥樣硬化形成中具有積極與消極的雙重影響，VSMCs可以維持斑塊的穩(wěn)定性[11]，同時(shí)當(dāng)VSMCs表型轉(zhuǎn)換為合成型時(shí)促進(jìn)泡沫細(xì)胞的生成以及動(dòng)脈壁的狹窄[12]?？刂芕SMCs的異常增殖對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化具有積極的意義。

DB預(yù)測(cè)靶點(diǎn)中，TOP2a參與細(xì)胞DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和有絲分裂等重要的生命過(guò)程，根據(jù)iGEMDOCK分子對(duì)接結(jié)果，能量值越低表示對(duì)接越穩(wěn)定，選擇TOP2a作為后續(xù)研究對(duì)象。GO分析中，可見(jiàn)TOP2a相關(guān)蛋白在生物過(guò)程參與細(xì)胞分裂與細(xì)胞周期，KEGG分析中，TOP2a相關(guān)蛋白調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂通路，結(jié)合關(guān)鍵靶點(diǎn)分析，推測(cè)TOP2a作為關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂過(guò)程，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

在脊椎動(dòng)物中，TOP2a蛋白的產(chǎn)生和降解與細(xì)胞周期、增殖功能相關(guān)，尤其在快速增殖期細(xì)胞中含量較高[13]。TOP2a表達(dá)水平在有絲分裂中期增加，在有絲分裂完成后迅速下降[14]。在復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中，TOP2a改變DNA的超螺旋性和解開(kāi)雙鏈DNA片段，正螺旋的DNA具有較好的作用[15]，通過(guò)識(shí)別DNA序列，以共價(jià)鍵的方式將酪氨酸(Tyr)與DNA 5′斷端的磷酸基結(jié)合，改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而催化DNA分子鏈的連接[16]。

本文結(jié)果顯示，DB抑制VSMCs增殖具有顯著效果，Western blot結(jié)果表明DB下調(diào)蛋白TOP2a表達(dá)水平。流式結(jié)果顯示，DB可能阻滯VSMCs的G1期向S期合成，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖。DB可能通過(guò)下調(diào)TOP2a表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期，抑制VSMCs的增殖。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)，Hela細(xì)胞中過(guò)表達(dá)TOP2a，p-Akt表達(dá)升高，促進(jìn)細(xì)胞的增殖與遷移。Zhang等[18]研究表明，結(jié)腸癌細(xì)胞中敲除TOP2a，Akt的磷酸化水平降低，顯著抑制細(xì)胞的增殖與遷移。因此推測(cè)DB下調(diào)TOP2a表達(dá)并可能抑制Akt的磷酸化。

有研究顯示，替尼泊甙作為T(mén)OP2a的抑制劑，可以激活巨噬細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1的表達(dá)和游離膽固醇流出，表明TOP2a抑制劑可能表現(xiàn)出抗動(dòng)脈粥樣硬化的特性[19]。Wang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，替尼泊甙通過(guò)調(diào)節(jié)p53-骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogehetic protein 2,BMP2)信號(hào)通路而減少血管鈣化，提示抑制TOP2a具有抗動(dòng)脈粥樣硬化性。但是，TOP2a抑制劑普遍具有一定的心臟毒性作用[21]，那么篩選出抑制TOP2a的化合物并無(wú)心臟毒性，對(duì)TOP2a抑制劑在心血管與癌癥應(yīng)用中具有積極意義。目前，DB并無(wú)毒性作用的報(bào)道，其在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中均無(wú)溶血現(xiàn)象[22]，具有一定的安全性。

綜上所述，DB可能抑制TOP2a表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)而抑制VSMCs的增殖，DB在抗動(dòng)脈粥樣硬化應(yīng)用中具有一定的潛力。