關(guān)節(jié)軟骨Osterix蛋白表達強度對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎形態(tài)學變化的影響

郭鳳英，張 晨，李 燕，張晉寧，楊天翔，張博文，陳德勝，Sheraz Hassan(巴基斯坦)

(1.寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院骨科，寧夏 銀川 750004)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是中老年人多發(fā)的關(guān)節(jié)退行性疾病，其特征在于骨贅形成和關(guān)節(jié)軟骨的喪失，軟骨下骨硬化以及不同程度的滑膜組織發(fā)育不良[1-3]。在終末期，患者可出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)屈曲攣縮畸形、內(nèi)外翻畸形等，為常見致殘原因。Osterix蛋白是維持骨代謝平衡的重要轉(zhuǎn)錄因子，也是調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cell，BMSC)向成骨細胞分化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵蛋白，對預(yù)防和治療骨性關(guān)節(jié)炎有著重要意義[4-6]。本研究探討Osterix蛋白在關(guān)節(jié)軟骨的表達強度對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎形態(tài)學變化的影響，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年11月1日至2020年8月31日期間在我院骨科由于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)治療的患者44例，其中男性21例，女性23例；平均年齡(58.62±7.14)歲；平均體重指數(shù)(25.97±5.83)kg/m2。磨損較重的一側(cè)為負重區(qū)(實驗組)，磨損較輕的一側(cè)為非負重區(qū)(對照組)。病例納入標準：①符合骨關(guān)節(jié)炎診斷標準[7]者；②有顯著臨床癥狀且有手術(shù)意愿者；③術(shù)前檢查未見手術(shù)禁忌證者；④無精神、意識障礙者；⑤簽署知情同意書者。排除標準：①膝關(guān)節(jié)畸形、小兒麻痹、滑囊炎等影響膝關(guān)節(jié)軟組織發(fā)育者；②1個月內(nèi)有關(guān)節(jié)內(nèi)藥物注射史者。本研究已經(jīng)寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院科研倫理委員會批準(倫理編號：2015-019)。

1.2 研究方法

1.2.1 采集標本：選取人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中截骨去除的股骨內(nèi)、外髁，經(jīng)肉眼比較后區(qū)分出負重區(qū)與非負重區(qū)，將股骨髁周圍軟組織剪除后，用咬骨鉗將中央磨損嚴重部位裁切成組織塊，大小約1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm。同法剪裁非負重區(qū)軟骨較完整部位。將骨塊置于15%乙二酸四乙酸(EDTA)液中脫鈣處理，期間每3 d更換1次脫鈣液，直至針刺骨組織無明顯阻力感時取出，沖洗、脫水、包埋后切片處理。

1.2.2 蘇木素-伊紅(HE)染色：37 ℃恒溫箱溫育切片12 h，取出后分別采用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及不同濃度乙醇脫蠟入水，然后在蘇木素染液中染色2～3 min，沖洗3遍后置入1%鹽酸乙醇中分化3 s，再次沖洗干凈后伊紅染色3～5 s，自然風干后用中性樹脂予以封固，在顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 免疫組織化學染色：70 ℃烤箱溫育切片12 h后，使用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，再使用蒸餾水、PBS液各漂洗3次。隨后將組織切片浸入煮沸的檸檬酸鈉緩沖液中15 min，0 ℃冷卻，H2O2浸泡10 min，PBS反復(fù)沖洗3次(注意不要將軟骨組織沖掉)，滴加Osterix一抗(批號：ab22552；美國Abcam)，于4 ℃冰箱內(nèi)孵育8 h后用PBS沖洗3次，并滴加二抗山羊抗兔IgG聚合物(批號：6927-100；美國BioVision)孵育15 min，加入DAB顯色液15 s，PBS沖洗干凈后蘇木精復(fù)染5 min。隨后采用蒸餾水沖洗2次，采用1%鹽酸乙醇進行分化。再次使用蒸餾水沖洗2 min，中性樹脂封固。在40倍光鏡下每張切片隨機選取5個視野，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件分析測評不同軟骨細胞中Osterix蛋白的陽性表達率。

1.3 統(tǒng)計學方法 選用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 負重區(qū)與非負重區(qū)軟骨大體觀察 見圖1。由于骨性關(guān)節(jié)炎患者的股骨內(nèi)、外側(cè)髁受力不均勻，導(dǎo)致兩側(cè)軟骨磨損程度不一。大體觀察下，負重區(qū)大量軟骨丟失，標本表面粗糙，軟骨下骨板暴露，色澤灰暗，甚至可見潰瘍灶形成。非負重區(qū)軟骨完整，標本表面光滑富有光澤，呈乳白色，未見潰瘍灶。

圖1 股骨遠端負重區(qū)與非負重區(qū)大體觀察

2.2 負重區(qū)與非負重區(qū)軟骨HE染色結(jié)果 見圖2。鏡下觀察可見負重區(qū)軟骨面殘缺不齊，過渡層出現(xiàn)裂隙，軟骨細胞分布紊亂，潮線不完整，軟骨下骨排列不均，有彌漫性增生；非負重區(qū)軟骨表面較為平整，軟骨細胞數(shù)量多，胞質(zhì)完整均勻。從軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細胞數(shù)量、軟骨基質(zhì)染色以及潮線完整程度等方面對膝關(guān)節(jié)軟骨進行Mankin評分[8]，并據(jù)此將負重區(qū)分為中度磨損組(15例，7～9分)和重度磨損組(29例，10～13分)。

注：藍色剪頭所示為軟骨面

2.3 負重區(qū)與非負重區(qū)軟骨免疫組化染色結(jié)果 見圖3。Osterix蛋白主要在成骨細胞胞漿著色，在非負重區(qū)軟骨中可見呈黃褐色或棕色顆粒，負重區(qū)晚期軟骨組中Osterix蛋白著色表達較少。采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件可以得到非負重區(qū)軟骨組、負重區(qū)中度磨損組、負重區(qū)重度磨損組三組軟骨細胞中Osterix蛋白陽性表達率，分別為(15.16±7.86)%、(11.62±5.87)%和(7.12±4.33)%，三組間兩兩比較結(jié)果顯示，負重區(qū)重度磨損組Osterix蛋白陽性表達率小于中度磨損組，且兩者均小于非負重區(qū)軟骨組(均P<0.05)。

3 討 論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是骨科常見的，侵及關(guān)節(jié)軟骨、滑膜的慢性疾病，隨著病變的發(fā)展，患者晚期可出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)疼痛、畸形以及活動障礙，致使患者的生活質(zhì)量嚴重下降[9]?，F(xiàn)階段，確診膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者多已處于病變中晚期，此時關(guān)節(jié)軟骨已存在嚴重磨損，因此現(xiàn)階段臨床上主要以手術(shù)作為主要的治療手段[10]。我國作為人口大國，老齡化問題突出，隨著膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者數(shù)量的增加，膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的數(shù)量也逐年升高。截止到2019年，我國每年進行的膝關(guān)節(jié)置換術(shù)已超過25萬例，給社會醫(yī)療、經(jīng)濟帶來了巨大壓力[11]。隨著骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制相關(guān)的分子生物學研究的不斷深入，通過生物學標志物早期診斷膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的猜想越來越多，而尋找合適的靶點蛋白也逐漸成為了研究熱點。

Osterix是由Nakshima等[12]首先分離出來的，是Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的下游靶基因，而Runx2 為細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路下游重要的靶基因之一[13]。ERK1/2活化后可激活Runx2，誘使其下游Osterix蛋白在脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸部位發(fā)生磷酸化，從而調(diào)控下游靶基因的表達，發(fā)揮促進成骨細胞分化的作用[14]。Osterix可以調(diào)控多種重要成骨基因的表達，如骨粘素、骨橋素、骨鈣蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等，對骨細胞的分化成熟和軟骨細胞的修復(fù)有重要影響[15-16]，因此越來越多的人將其用于骨性關(guān)節(jié)炎的治療及診斷。Artigas等[17]表示，Osterix蛋白可作為成骨細胞分化能力的標志，其水平下降表明成骨細胞減少或分化能力降低。

膝關(guān)節(jié)軟骨的磨損退化是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的主要病理變化之一，也是導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙變化的原因之一。本研究通過探討不同磨損程度的軟骨與Osterix蛋白表達強度之間的關(guān)系，分析骨性關(guān)節(jié)炎中軟骨退行性變與Osterix蛋白表達的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在長期的負重、受壓過程中，膝關(guān)節(jié)股骨髁軟骨會出現(xiàn)明顯磨損，在負重區(qū)會出現(xiàn)軟骨潰瘍、軟骨色澤及光滑度減弱等病理變化，我們猜測這些病理變化可能是受到靶點調(diào)控的結(jié)果。在通過免疫組化對不同磨損程度軟骨中Osterix蛋白表達強度進行比較后，我們發(fā)現(xiàn)隨著磨損程度的加重，Osterix蛋白在關(guān)節(jié)軟骨的陽性表達強度隨之減弱，二者存在負相關(guān)性，證實了在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨退變的過程中成骨細胞的分化受到了影響。有研究[18-19]也指出，Osterix與間充質(zhì)干細胞成骨分化是存在雙向調(diào)節(jié)的，可能正是由于膝關(guān)節(jié)軟骨中Osterix蛋白的下調(diào)作用致使骨髓間充質(zhì)干細胞成骨化減少，減緩了軟骨細胞的修復(fù)作用，才導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨在處于因積累性磨損、外傷導(dǎo)致的炎性環(huán)境中快速發(fā)生退行性變。

綜上所述，Osterix蛋白參與了關(guān)節(jié)軟骨退行性變的過程，其在軟骨細胞中的表達強度會隨著軟骨磨損程度的增加而減弱，可作為臨床上診斷膝骨性關(guān)節(jié)炎的指標之一。