HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性患者血清HBV-DNA含量檢測(cè)對(duì)隱匿性乙型肝炎病毒感染的檢出價(jià)值

劉曉紅，單 穎，孫朝慶，紀(jì)玉紅，郭 靜

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.朝陽(yáng)市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 朝陽(yáng) 122000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)包含正嗜肝DNA病毒屬和禽嗜肝DNA病毒屬，其中正嗜肝DNA病毒屬可引起人體HBV感染。乙型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen，HBsAg)是目前臨床判斷HBV感染的主要乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物。血清HBsAg陽(yáng)性可確診HBV感染，若持續(xù)6個(gè)月以上陽(yáng)性可確診慢性HBV感染。乙型肝炎核心抗體(Hepatitis B core antibody，HBcAb)是人體HBV感染后最早出現(xiàn)的一種病毒抗體，單項(xiàng)HBcAb陽(yáng)性提示既往HBV感染，HBsAg轉(zhuǎn)陰和HBcAb出現(xiàn)提示HBV清除和乙型肝炎痊愈，且病毒清除后HBcAb仍會(huì)長(zhǎng)期存在。隨著熒光定量PCR的逐漸開展，發(fā)現(xiàn)HBsAg檢測(cè)陰性但肝臟或血清HBV DNA含量陽(yáng)性的現(xiàn)象并不少見，在排除HBV窗口期感染后可明確隱匿性乙型肝炎病毒感染(Occult hepatitis B virus infection，OBI)。既往研究[1-2]指出，依據(jù)血清是否存在HBcAb和乙型肝炎表面抗體(Hepatitis B surface antibody，HBsAb)，OBI患者的血清學(xué)可分為血清學(xué)陽(yáng)性(HBcAb陽(yáng)性，HBsAb陽(yáng)/陰性)和血清學(xué)陰性(HBcAb、HBsAb均為陰性)，其中前者約占78%，后者約占22%，由此可見HBcAb陽(yáng)性與OBI可能存在緊密關(guān)聯(lián)。鑒于此，本研究對(duì)HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性血清采用PCR儀進(jìn)一步行HBV DNA含量檢測(cè)，并對(duì)OBI檢出結(jié)果進(jìn)行探討分析，為臨床診斷OBI和降低OBI所致乙型肝炎病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集朝陽(yáng)市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科2019年9月至2020年8月期間1138例經(jīng)化學(xué)發(fā)光免疫分析法(CLIA)檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物(HBV-M)且篩查結(jié)果提示HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性的患者。其中，男性729例(64.06%)，女性409例(35.94%)；年齡18～73歲，其中18～29歲132例(11.60%)，30～59歲704例(61.86%)，60歲及以上302例(26.54%)，平均年齡(47.62±10.25)歲。所有患者既往均無(wú)肝腫瘤放化療或手術(shù)史，排除HBV窗口期感染，均積極配合相關(guān)檢測(cè)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

1.2.1 血清樣本采集：采集靜脈血4 ml，3000 r/min離心10 min，收集血清置于冰箱-60 ℃保存，48 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2.2 HBV-M檢測(cè)：采用雅培ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑盒對(duì)HBsAg、乙肝病毒e抗原(Hepatitis B virus e antigen，HBeAg)、HBsAb、乙肝病毒e抗體(Hepatitis B virus e antibody，HBeAb)、HBcAb進(jìn)行檢測(cè)。HBsAg、HBeAg、HBsAb、HBeAb、HBcAb試劑盒批號(hào)分別為07395FN00、10267BE00、06440FN00、09197BE00、09542BE00，均購(gòu)自雅培公司。根據(jù)CLIA定量分析結(jié)果判定HBV-M檢測(cè)項(xiàng)目陽(yáng)/陰性。

1.2.3 HBV-DNA含量檢測(cè)：采用美國(guó)ABI 7500熒光定量PCR儀對(duì)HBV-DNA含量進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒(批號(hào)：MF20160102)購(gòu)于上海浩源科技有限公司。HBV-DNA含量值最低檢出限為10 IU/ml。

1.2.4 肝功能檢查：明確HBV-M檢測(cè)結(jié)果后均建議進(jìn)一步做肝功能檢查，其中596例在我院接受肝功能檢查。采用羅氏Cobas 8000生化分析儀及配套試劑檢測(cè)血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和總膽紅素(TBIL)水平。三者正常值范圍依次為5～40 U/L、7～40 U/L和3～22 μmol/L，且AST/ALT值越高表示肝功能損傷越嚴(yán)重。由資深肝病醫(yī)師綜合判定肝損傷情況，必要時(shí)進(jìn)行肝穿刺活檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。根據(jù)研究需要對(duì)受檢樣本進(jìn)行分組，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 1138例患者不同HBV-M模式間HBV-DNA陽(yáng)性情況比較 見表1。經(jīng)PCR檢測(cè)，1138例患者中35例為OBI，檢出率3.08%。根據(jù)CLIA檢測(cè)結(jié)果將1138例患者HBV-M檢出模式分成模式A組(HBcAb陽(yáng)性)、模式B組(HBcAb、HBeAb陽(yáng)性)、模式C組(HBcAb、HBsAb陽(yáng)性)和模式D組(HBcAb、HBeAb、HBsAb陽(yáng)性)。HBV-DNA陽(yáng)性檢出率由高到低依次為模式C組、模式A組、模式B組和模式D組，其中模式A、B、C組HBV-DNA陽(yáng)性率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)；模式C組HBV-DNA陽(yáng)性率明顯高于模式D組(P<0.05)；模式A、B組與D組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表1 1138例患者不同HBV-M模式間HBV-DNA陽(yáng)性情況比較

2.2 1138例患者不同HBcAb反應(yīng)性間HBV-DNA陽(yáng)性情況及分布比較 見表2。根據(jù)血清樣本HBcAb吸光度/臨界值(S/Co值)將1138例患者分為反應(yīng)性A組(1.0≤S/Co值<5.0)、反應(yīng)性B組(5.0≤S/Co值<10.0)和反應(yīng)性C組(S/Co值≥10.0)，并將S/Co值≥10.0定義為高反應(yīng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性A、B、C組的HBV-DNA陽(yáng)性率依次升高，且反應(yīng)性C組HBV-DNA陽(yáng)性率明顯高于反應(yīng)性A、B組，反應(yīng)性B組HBV-DNA陽(yáng)性率又明顯高于反應(yīng)性A組(均P<0.05)。HBV-DNA載量分布：<20 IU/ml者25例，占71.43%(25/35)；20～100 IU/ml者7例，占20.00%(7/35)；≥100 IU/ml者3例，占8.57%(3/35)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性A、B、C組HBV-DNA分布比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。

表2 1138例患者不同HBcAb反應(yīng)性間HBV-DNA陽(yáng)性情況及分布比較[例(%)]

2.3 596例患者不同肝功能間HBV-DNA陽(yáng)性情況及HBcAb反應(yīng)性比較 見表3。根據(jù)有無(wú)肝損傷將接受肝功能檢查的596例患者分為正常組(459例)和肝損傷組(137例)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝損傷組HBV-DNA陽(yáng)性率、HBcAb高反應(yīng)性均明顯高于正常組(均P<0.05)。

表3 596例患者不同肝功能間HBV-DNA陽(yáng)性情況、HBcAb反應(yīng)性比較[例(%)]

3 討 論

近年來(lái)HBV相關(guān)研究和感染傳播的防控工作取得長(zhǎng)足進(jìn)步，但HBV感染在世界范圍內(nèi)仍屬于嚴(yán)重的公共衛(wèi)生難題。HBV感染相關(guān)流行病學(xué)報(bào)道[3-4]指出，我國(guó)人群HBV感染呈高發(fā)流行特征，地區(qū)分布差異顯著，HBV攜帶者高達(dá)10%，每年新增約50萬(wàn)人，且每年因HBV感染所致肝硬化、肝癌而死亡的人數(shù)高達(dá)26萬(wàn)。由此可見，HBV感染可造成沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)，已成為居民死亡的常見病因，對(duì)HBV感染防控和相關(guān)診治工作提出了更高的要求[5]。

自1978年醫(yī)學(xué)界首次提出OBI以來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，相關(guān)研究已取得較大進(jìn)步，認(rèn)知水平明顯提高。目前將OBI定義為：排除HBV感染急性窗口期以后，經(jīng)嚴(yán)格檢測(cè)明確HBsAg陰性，血清和(或)肝組織中HBV-DNA陽(yáng)性，且HBV-DNA載量<200 IU/ml。既往報(bào)道[6]指出，HBsAg陰性獻(xiàn)血者、隱匿性慢性肝炎、慢性丙型肝炎和原發(fā)性肝癌等均有OBI檢出。但OBI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未完全明確，給臨床診治及預(yù)防帶來(lái)諸多困難，多猜測(cè)與HBV基因突變、HBV表觀遺傳變異、合并丙型肝炎病毒(HCV)以及宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)等有關(guān)[7]。李奇等[8]對(duì)10359份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，OBI檢出率為0.191%，檢出9種HBV-S基因主要親水區(qū)(MHR)突變類型，且部分突變類型具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的生物學(xué)特征，提示OBI可能增加肝細(xì)胞癌的進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)。報(bào)道[9]發(fā)現(xiàn)，單純HCV感染患者和HCV/OBI共感染患者的分子流行病學(xué)特征并無(wú)明顯差異，也可能是導(dǎo)致部分OBI漏檢的原因。HBcAb是臨床評(píng)估HBV感染的標(biāo)志性抗體，HBcAb陽(yáng)性表示既往HBV感染，單項(xiàng)HBcAb陽(yáng)性多見于急性HBV感染窗口期、HBcAb陽(yáng)性孕婦所生新生嬰兒和接受輸血者等群體。由于OBI的流行病學(xué)特征極其復(fù)雜，不同地區(qū)、族群、性別、年齡的人群OBI發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)存在諸多困難，加上目前檢測(cè)技術(shù)存在差異，因此關(guān)于OBI的潛在影響尚存在一定爭(zhēng)議，如OBI潛在傳染性評(píng)估、是否增加肝細(xì)胞癌的罹患風(fēng)險(xiǎn)等還未形成統(tǒng)一觀點(diǎn)。筆者在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性者并不少見，作為OBI患者的常見血清學(xué)特征，血清HBcAb水平可明顯升高。

本研究收集的1138例HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性患者的血清樣本均經(jīng)CLIA篩查明確。與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)比較，CLIA所需配套儀器和試劑成本提高，但檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，而且靈敏度和特異度更高，因此應(yīng)用廣泛。此外，雖然時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)(TRFIA)也具備較好的檢測(cè)效果，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且標(biāo)本消耗量大，檢測(cè)技術(shù)要求較高，并未廣泛應(yīng)用。進(jìn)一步行PCR檢測(cè)顯示，共檢出35例OBI患者(HBV-DNA陽(yáng)性)，檢出率為3.08%，此結(jié)果明顯高于報(bào)道[10]中的0.90%，原因可能在于血清樣本存在差異。35例OBI患者HBV-DNA載量均≤200 IU/ml，其中<20 IU/ml、20～100 IU/ml、≥100 IU/ml分別占71.43%、20.00%和8.57%，符合OBI的HBV低水平復(fù)制特征。不同HBV-M模式中，模式C組(HBcAb、HBsAb陽(yáng)性)OBI檢出率最高(4.11%)，其次為模式A組(HBcAb陽(yáng)性)，模式D組(HBcAb、HBeAb、HBsAb陽(yáng)性)檢出率最低(1.61%)，分析原因與HBeAb陽(yáng)性時(shí)體內(nèi)HBV復(fù)制相對(duì)靜止有關(guān)[11]。

本研究根據(jù)HBcAb反應(yīng)性(S/Co值)進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)隨著S/Co值升高，HBV-DNA陽(yáng)性檢出率也明顯升高，HBsAg陰性伴高反應(yīng)性HBcAb(S/Co值≥10.0)患者的OBI發(fā)病率高達(dá)14.29%，與既往報(bào)道[12]相符，提示CLIA篩查明確HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性者若血清HBcAb水平異常偏高，OBI風(fēng)險(xiǎn)可能增加。有研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)HBcAb陽(yáng)性作為OBI的常見血清學(xué)形式，血清HBcAb水平與肝組織中共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)水平緊密相關(guān)，也在一定程度上支持本研究觀點(diǎn)，但OBI患者cccDNA水平的影響因素復(fù)雜，血清HBcAb水平的影響作用途徑尚未完全明確[15]。本研究顯示反應(yīng)性A組、B組和C組HBV-DNA分布比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HBcAb反應(yīng)性對(duì)OBI患者HBV-DNA分布無(wú)明顯影響，但需后續(xù)研究擴(kuò)大樣本深入探討。

本研究中596例患者接受常規(guī)肝功能檢查，肝損傷者137例(22.99%)，結(jié)果顯示肝損傷組HBV-DNA陽(yáng)性率、HBcAb高反應(yīng)性均明顯高于正常組，結(jié)合上述討論，提示HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性患者可存在肝損傷，肝損傷亦提示較高OBI可能。因此，對(duì)存在OBI風(fēng)險(xiǎn)人群，建議定期進(jìn)行肝功能檢查。OBI患者必要時(shí)行肝穿刺活檢，對(duì)評(píng)估肝損傷意義更大，若提示纖維化或炎癥，則需積極接受抗病毒治療[16]。但肝損傷原因除HBV感染因素外，還與患者飲酒、自身免疫性疾病、遺傳代謝性、肥胖等因素有關(guān)，對(duì)結(jié)果可能造成一定偏倚，這也是本研究存在的不足之處。

綜上所述，常規(guī)檢測(cè)HBsAg陰性伴HBcAb陽(yáng)性提示存在OBI可能，且OBI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨HBcAb反應(yīng)性S/Co值升高而升高，應(yīng)進(jìn)一步行HBV-DNA含量檢測(cè)判斷OBI，降低OBI漏診和臨床HBV傳播風(fēng)險(xiǎn)。