卷曲蛋白8在胃癌BGC823細胞中的表達及其對胃癌細胞遷移、侵襲的影響

宋香妮，陳瑤莉，楊 劍，穆金姬

(銅川市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 銅川 727000)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重影響人們的身心健康[1-3]。近年來科學技術的進步、手術方法的改進、免疫治療及新輔助化療的廣泛應用大大提高了胃癌患者的預后，但是胃癌患者術后5年生存率仍然較低[4-7]。胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的主要原因[1]，因此了解胃癌發(fā)生與發(fā)展的分子機制對胃癌的治療及預后非常重要。卷曲蛋白8(Frizzled 8，F(xiàn)ZD8)是Wnt家族的受體之一，是一種7次跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)類似于G蛋白偶聯(lián)型受體。FZD8參與體內(nèi)多種生理和病理過程，在人類肺癌、口腔癌、急性淋巴細胞白血病、前列腺癌等多種腫瘤中參與細胞增殖及惡性轉(zhuǎn)移[8-10]。Demirci等[11]使用qRT-PCR方法檢測到FZD8在胃癌組織中高表達，并與胃癌的轉(zhuǎn)移相關。但FZD8在胃癌中的作用機制尚未完全闡明。本研究旨在檢測FZD8在人胃癌細胞株BGC823細胞中的表達水平，并通過沉默人胃癌細胞株BGC823細胞中的FZD8來評價其對BGC823細胞遷移和侵襲的影響，總結(jié)其潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞：人胃癌細胞BGC823細胞和人胃黏膜上皮細胞GES1購于中國科學院上海細胞庫，在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，細胞進入對數(shù)生長期即可收割用于實驗。

1.1.2 主要試劑：Trizol試劑購自上海碧云天生物技術研究所；慢病毒(批號：JRR041B)購自中國吉凱生物有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：DCR048A)購自日本Takara公司；電化學發(fā)光(ECL)系統(tǒng)購自康為世紀生物有限責任公司；兔抗人FZD8、β-actin抗體和羊抗兔熒光素標記的IgG抗體購自美國Santa公司；基質(zhì)膠購自美國 BD Biosciences公司；Transwell小室購自美國Corning公司；BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀生物有限責任公司。

1.2 實驗方法 用慢病毒介導的shRNA轉(zhuǎn)染BGC823細胞，建立穩(wěn)定的FZD8基因敲減細胞(shFZD8)[12]，采用Western blot和實時熒光定量PCR驗證，并進行Transwell遷移和侵襲實驗。

1.2.1 實時熒光定量PCR檢測mRNA水平：用TrIzol試劑提取細胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR循環(huán)擴增，內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。GAPDH基因上游引物序列為5’-AGCDACTCCTCCACCTTTG-3’，下游引物序列為5’-CACAACCCTGTTGCTGTAT-3’。FZD8基因上游引物序列為5’-TCGCAGCCTCCGGGTG-3’，下游引物序列為5’-TGTCTGTGCTCATAGCCTGG-3’[13]。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達水平：蛋白質(zhì)裂解緩沖液裂解提取細胞總蛋白質(zhì)。按照BCA蛋白定量試劑盒的標準操作進行蛋白定量，并稀釋到相同濃度。各組蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合后，100 ℃下煮沸10 min，加入到配置好的10%和5% SDS-PAGE中進行電泳。電泳結(jié)束后，100 V電壓濕轉(zhuǎn)1 h，切膠，蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人FZD8抗體(1∶1000稀釋)和兔抗人β-actin抗體(1∶1000稀釋)，4 ℃孵育過夜，并用TBST清洗3次，每次10 min，羊抗兔熒光素標記的IgG(1∶10000稀釋)室溫孵育1 h，TBST清洗3次。采用電化學發(fā)光系統(tǒng)顯影，用Bio-Rad成像系統(tǒng)采集圖像并對圖像進行灰度分析。

1.2.3 Transwell遷移實驗：收集對數(shù)生長細胞，PBS洗滌2次。用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，進行細胞計數(shù)，然后稀釋濃度至1×105/ml，用移液器給每孔加200 μl細胞懸液到Transwell小室的上室，下層小室加入0.5 ml 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。每組設3個重復孔。37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后取出Transwell小室，PBS輕輕淋洗3遍，用棉簽輕輕拭去小室上室中的細胞，95%乙醇固定5 min，用滴管加入4 g/L結(jié)晶紫染色10 min。PBS輕輕淋洗3遍，顯微鏡下觀察穿過膜的細胞并隨機取8個視野計數(shù)。實驗重復3次。

1.2.4 Transwell侵襲實驗：將基質(zhì)膠和無血清培養(yǎng)基按照1∶8比例稀釋并混合，加入到Transwell小室中，每孔50 μl，于37 ℃培養(yǎng)箱中固化。其余步驟同遷移實驗。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BGC823和GES1細胞FZD8蛋白及mRNA表達水平比較 見圖1。與GES1細胞相比，BGC823細胞FZD8 mRNA和蛋白的表達水平均明顯增高(t=6.379、7.972，均P<0.01)，分別約為前者的2.8倍和2.4倍。

注：與BGC823細胞比較，*P<0.01

2.2 BGC823細胞FZD8基因沉默驗證 見圖2。Western blot和PCR檢測結(jié)果顯示，相比于對照組(未沉默F(xiàn)ZD8基因的BGC823細胞)，shFZD8組細胞中FZD8蛋白及mRNA表達水平均明顯降低(t=6.366、5.803，均P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.01

2.3 沉默F(xiàn)ZD8基因?qū)GC823細胞侵襲、遷移能力的影響 見圖3。Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示，對照組穿膜細胞數(shù)分別為(110.7±12.4)個和(121.6±13.8)個，shFZD8組穿膜細胞數(shù)分別為(42.3±10.2)個和(56.4±9.6)個。與對照組相比，shFZD8組穿膜細胞數(shù)明顯減少(t=4.668、9.500，均P<0.01)。

注：與對照組比較，*P<0.01

3 討 論

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一。近年來，內(nèi)鏡檢查的普及與早癌診療技術的開展大大提高了早期胃癌患者的生存率，但胃癌早期癥狀并不典型，大多數(shù)胃癌患者被診斷時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，導致中晚期胃癌具有較高的死亡率[14-15]。因此，探究胃癌早期病變指標，探討胃癌發(fā)生、發(fā)展的相關機制，對改善胃癌患者預后尤為重要。

FZD8是Wnt家族的受體之一，為一種7次跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)類似于G蛋白偶聯(lián)型受體。FZD8參與多種人體生理過程，如參與胚胎時期形態(tài)發(fā)生，維持原始造血干細胞靜息狀態(tài)下的功能[16-17]。同時，F(xiàn)ZD8在包括腫瘤、耐藥等病理過程中發(fā)揮著重要作用[9-10,17]。張煥新[12]研究發(fā)現(xiàn)FZD8在費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病細胞中表達，而在正常人外周單核細胞中并未發(fā)現(xiàn)FZD8表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)FZD8通過非經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路來實現(xiàn)白血病細胞對化療藥的耐藥。Yang等[8]報道FZD8在腎細胞癌組織中高表達，并通過非經(jīng)典Wnt信號通路促進腎癌細胞異常增殖及轉(zhuǎn)移。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，過表達FZD8可以促進腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)移，并且通過激活經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號促進前列腺癌骨轉(zhuǎn)移。

FZD8也可以作為分子靶點在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Liu等[18]報道m(xù)iRNA-99b-5p通過直接作用FZD8激活Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。編碼轉(zhuǎn)錄因子基因ERG可以直接作用于FZD8，從而促進前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。Demirci等[11]使用qRT-PCR方法檢測胃癌和癌旁組織中FZD8的表達，發(fā)現(xiàn)其在胃癌組織中高表達，胃癌轉(zhuǎn)移組FZD8表達明顯高于非轉(zhuǎn)移組，提示FZD8可能是胃癌的新生標志物。但FZD8的表達水平是否影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其機制尚不明確。

本研究首先檢測人胃癌BGC823細胞和人胃黏膜上皮GES1細胞FZD8表達水平，通過篩選出能夠穩(wěn)定敲減FZD8的BGC823 細胞株探討FZD8敲減對人胃癌BGC823細胞侵襲及遷移能力的影響。結(jié)果顯示，人胃癌BGC823細胞中FZD8 mRNA及蛋白表達水平明顯高于人胃黏膜上皮GES1細胞。沉默F(xiàn)ZD8的BGC823細胞中FZD8 mRNA及蛋白表達含量明顯低于對照組，提示敲減FZD8后的BGC823細胞可以穩(wěn)定地下調(diào)FZD8的表達，能夠用于后續(xù)實驗研究。Transwell遷移實驗和侵襲實驗結(jié)果顯示shFZD8組細胞的遷移和侵襲能力顯著低于對照組，說明沉默F(xiàn)ZD8基因能夠顯著抑制人胃癌BGC823細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，F(xiàn)ZD8在胃癌細胞中高表達，敲減人胃癌細胞株BGC823細胞中的FZD8可以抑制BGC823細胞的遷移和侵襲能力。FZD8作為促癌基因，對其結(jié)構(gòu)及功能的認識有望為胃癌的防治及預后提供新思路。但是，本研究只是初步探索了FZD8在BGC823細胞中的作用，在后續(xù)的研究工作中，我們還需要完善其他生物學功能檢測(細胞周期、增殖、凋亡、耐藥等)，并且從細胞水平和動物水平探索FZD8在胃癌中的具體作用機制。