口服枸杞多糖對小鼠肝纖維化組織基質(zhì)金屬蛋白酶-2及基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑水平影響的實驗研究

韓艷珍，單鐵英，李 偉，劉海平，安曉紅，康瑞靜，儲 媛

(1.河北工程大學附屬醫(yī)院普外科，河北 邯鄲 056002；2.河北工程大學醫(yī)學院，河北 邯鄲 056002；3.邯鄲市中心醫(yī)院護理科，河北 邯鄲 056002；4.邯鄲市雞澤縣醫(yī)院，河北 雞澤 057350；5.五礦邯邢職工總醫(yī)院，河北 邯鄲 056002)

肝纖維化是炎癥因子等有害因子長期作用于肝臟組織，使肝臟組織結(jié)構反應性地出現(xiàn)的一種病理改變。其典型的病變特點為肝組織中有細胞壞死、組織反應性增生。如果此種病變的進程沒有得到及時阻止，肝組織的損傷范圍會擴大，程度會加重，肝臟的質(zhì)地變硬造成肝硬化，再繼續(xù)發(fā)展肝組織會癌變，此時即使采取治療措施也將不會逆轉(zhuǎn)，病情嚴重并且危險性高。因此，尋找能夠及時有效地阻止、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物成為了關鍵所在。目前臨床上干預肝纖維化的藥物大多數(shù)為西藥，就價格和所帶來的不良反應來說，它們的使用人群沒有得到較大范圍的普及。近年來，中草藥的應用得到了人們的重視，它具有不良反應小、取材途徑較多等優(yōu)點。枸杞為較常見的中草藥，枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharide，LBP)為其組成成分里的一種?，F(xiàn)已經(jīng)證實LBP對機體的功效頗多，如增強免疫細胞效能、減少氧化應激的損傷、有效抗擊癌細胞的存活等[1-3]。關于LBP干預肝纖維化的效果及機制目前尚不清楚，本研究通過結(jié)扎小鼠膽總管使其肝組織發(fā)生纖維化，觀察LBP干預后的效果并總結(jié)其機制，為阻止和逆轉(zhuǎn)肝纖維化探索新的防治策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物來源：18只雄性57BL-6小鼠由河北醫(yī)科大學組胚教研室贈送，平均周齡(5.00±1.36)周，平均體重(0.32±0.28)kg。許可證號：SCXK(冀)2019-2-011。

1.1.2 主要試劑：枸杞多糖[衛(wèi)食健字(2000)第0034，武漢廣夏枸杞開發(fā)有限公司]，口服時用三蒸水溶解調(diào)制?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-2抑制劑(Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)第一抗體(批號：CD-109273GM)由武漢純度生物科技有限公司提供。羥脯氨酸試劑盒(批號：FT-T2774)由上海梵態(tài)生物科技有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立肝纖維化病變模型及分組：選12只小鼠從腹中線剪開，無菌環(huán)境中分離并結(jié)扎膽總管，造成小鼠肝組織發(fā)生纖維化病變，然后平均分配入2籠，分別為肝纖維化組和LBP組，再選1籠正常小鼠(6只)為對照組。LBP組服用含LBP 25 μg/L的三蒸水200 ml，對照組和肝纖維化組僅服用三蒸水200 ml，1次/d，連續(xù)服用30 d。第31天抽取各組小鼠的腹主動脈血液，經(jīng)過離心得到血清后冷藏待檢測。

1.2.2 肝功能指標檢測：將各組小鼠的血清放入生物化學儀器中分析谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平。

1.2.3 肝組織切片制備并HE染色：干預完畢后切取約1 cm×1 cm×1 cm肝臟組織塊，浸沒到甲醛液體中以保存其生活狀態(tài)結(jié)構，用酒精置換出組織塊中的水分，用二甲苯溶液增強其透光性，再投入石蠟溶液中，冷卻后上機切割為5 μm薄片，鋪展于載玻片上，晾干。先將粘有組織薄片的載玻片依次浸入二甲苯液、乙醇濃度逐漸降低的溶液中，然后浸入蒸餾水中，最后浸入堿性蘇木精、酸性伊紅里上色，鋪上蓋玻片，晾干。

1.2.4 MMP-2和TIMP-2 Western blot檢測：將每組小鼠的肝組織研為漿液，分離漿液中的蛋白質(zhì)，取出少量的蛋白質(zhì)按照說明書的步驟依次經(jīng)過變性、加入濃縮膠中、放入電泳槽中電泳、分離膠塊、將膠塊中的蛋白條帶轉(zhuǎn)入膜中。膜封閉后，先后用MMP-2和TIMP-2的一抗液、有標記的二抗液孵育，膜清洗后放入暗室中顯影于X線片上并定影，采用圖像軟件分析其灰度值并計算相對表達量[以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)內(nèi)參]。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠肝組織結(jié)構比較 見圖1。正常組肝臟里的每個小葉結(jié)構分界清楚，其中央為中央靜脈。肝纖維化組肝臟中有輕重程度不一、面積大小不同的組織壞死，小葉輪廓不清，只見結(jié)締組織范圍擴大，內(nèi)含數(shù)量較多的小葉間膽管。LBP組肝組織壞死程度減輕，壞死面積也有所減小，結(jié)締組織范圍縮小，其內(nèi)的小葉間膽管數(shù)目變少。

A:正常組 B：肝纖維化組 C:LBP組

2.2 三組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平比較 見表1。與正常組比較，肝纖維化組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均升高(均P<0.05)。與肝纖維化組比較，LBP組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平均下降(均P<0.05)。

表1 三組小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平比較(U/L)

2.3 三組小鼠MMP-2、TIMP-2相對表達量及MMP-2/TIMP-2比較 見表2(圖2)。與正常組相比較，肝纖維化組MMP-2的相對表達量略微上升(P>0.05)，TIMP-2的相對表達量升高明顯(P<0.05)，MMP-2/TIMP-2下降(P<0.05)。與肝纖維化組比較，LBP組MMP-2相對表達量升高，TIMP-2相對表達量下降，MMP-2/TIMP-2上升(均P<0.05)。

表2 三組小鼠MMP-2、TIMP-2相對表達量及MMP-2/TIMP-2比較

圖2 三組小鼠MMP-2與TIMP-2 Western blot檢測

3 討 論

枸杞子屬于一種茄科植物，早已被中國傳統(tǒng)醫(yī)學列為具有滋補功效的中草藥，現(xiàn)已被廣大人群用作滋補保健品。LBP是其成分中的一種水溶性物質(zhì)，不僅含有多種單糖，而且還含有其他的營養(yǎng)物質(zhì)[4]。研究[5-8]表明，LBP具有提高機體中免疫細胞活性、削弱氧化應激造成的組織損傷、拮抗惡性腫瘤細胞在機體中的生存、通過降低炎癥反應部位的生物學因子活性或數(shù)量來阻止損傷作用等多種生物學功效。肝臟纖維化病變的發(fā)生、發(fā)展與炎癥因子的長期不良作用密切相關[9]，因此本研究觀察LBP對肝纖維化損傷是否具有改善作用，并探究其作用機制。

本研究通過結(jié)扎膽總管使膽汁通路受阻，導致肝臟組織出現(xiàn)纖維化病變。因為肝細胞產(chǎn)生的膽汁逐漸增多并淤積在結(jié)扎以上的肝臟中大小不同的膽管里，肝臟期初會反應性地通過擴大膽管管腔和增加其數(shù)量來緩解病情的進展，但是這種緩解能力有限，膽汁的繼續(xù)增多會沖破膽管流入至肝組織中，壓迫組織中的營養(yǎng)血管，使其不能為肝細胞提供營養(yǎng)，進而導致肝細胞缺血、壞死，血液里的炎性細胞會游走到壞死組織中，壞死部位周圍的結(jié)締組織會反應性增生，造成肝組織結(jié)構紊亂不清。此種依靠膽汁通路不暢引起的小鼠肝纖維化病變的實驗操作簡單易行，模型制作的合格率較高[10]。

肝組織由肝細胞缺血、壞死到組織炎癥反應，進而出現(xiàn)肝組織中細胞外間質(zhì)成分增生且含量增多，其中數(shù)量顯著增多的是間質(zhì)中的膠原纖維。健康的肝組織中膠原纖維的分泌與分解保持著平衡穩(wěn)態(tài)，此種穩(wěn)態(tài)主要通過兩種相互拮抗的酶——MMP和TIMP的水平來決定，兩者比值的升高或者降低對間質(zhì)含量起著關鍵性的作用[11-13]。引起肝纖維化病變的關鍵是肝星狀細胞的數(shù)量和活性增加。動物研究[14-15]證明，肝纖維化組織中MMP-2的含量上升，MMP-2可以分解Ⅳ型膠原等間質(zhì)成分，破壞肝血竇的基底膜結(jié)構，也可增加肝星狀細胞的活性，加重肝纖維化的病情。TIMP-2為MMP-2的拮抗劑，可以和MMP-2特異性結(jié)合而降低其活性。

本研究結(jié)果表明，正常肝臟里MMP-2和TIMP-2含量均較少，當肝發(fā)生纖維化病變時MMP-2含量略微增加，而TIMP-2含量增加較明顯，MMP-2/TIMP-2降低。與肝纖維化組比較，LBP組肝臟內(nèi)的MMP-2含量明顯增加，TIMP-2含量明顯減少，且兩者比值明顯升高。從這些數(shù)據(jù)可以看出，衡量肝纖維化病程進展不能僅依賴MMP-2或者TIMP-2含量，而是要看兩者比值。在肝纖維化時，MMP-2/TIMP-2降低，可以說明雖然兩者含量均升高，但TIMP-2升高幅度高于MMP-2，造成間質(zhì)含量增加而纖維化加重。服用LBP后，MMP-2含量繼續(xù)增加而TIMP-2含量有所減少，MMP-2/TIMP-2升高，此時MMP-2的作用才能顯現(xiàn)出來，使間質(zhì)成分降解，減輕纖維化以保護肝組織。