急性肝衰竭大鼠模型構(gòu)建實驗研究

張榮臻，呂 超，石清蘭，陳月橋，黃雪霞，毛德文

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023)

急性肝衰竭(Acute liver failure，ALF)是由多種因素誘發(fā)的肝細(xì)胞大塊壞死或急劇彌漫性肝細(xì)胞變性、肝功能嚴(yán)重?fù)p害導(dǎo)致的臨床綜合征，以急性發(fā)病、黃疸急劇加深、肝臟迅速縮小、不同部位出血、短期內(nèi)出現(xiàn)腹水以及神經(jīng)精神狀態(tài)改變?yōu)橹饕卣?。由于患者突然大量出血、敗血癥、低血糖和腎衰竭，ALF病死率高達(dá)70%～90%，為給肝細(xì)胞再生提供充足時間，將各種并發(fā)癥減少到最低限度是治療的關(guān)鍵[1]。

建立高效、穩(wěn)定的動物肝衰竭模型是進(jìn)一步開展臨床藥物研究的重要前提。本研究主要是采用SD大鼠作為實驗動物來構(gòu)建急性肝衰竭模型。課題組經(jīng)查閱文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，目前肝再生研究的肝衰竭動物模型主要是90%肝切除大鼠模型，該模型首先由Johannes Gaub創(chuàng)建，隨后經(jīng)Emond等進(jìn)行了完善。該模型能造成極度的肝功能損害，完美復(fù)制肝衰竭，多用來檢驗相應(yīng)治療措施的療效。但也有報道指出該模型死亡率較高，可以通過降低肝切除比例來確定最佳的肝衰竭模型。為保證快速建立符合要求的ALF大鼠模型，課題組經(jīng)過不斷摸索，最終確定切除大鼠60%比例肝臟組織，術(shù)后腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)和脂多糖(LPS)來構(gòu)建ALF大鼠模型，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：2月齡SPF級SD雄性大鼠(動物生產(chǎn)許可證號：SCXK湘2014-0011)30只，體重190～240 g，購自湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)和實驗均在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗中心完成。動物飼養(yǎng)環(huán)境遵循實驗中心條件，溫度控制在24 ℃左右，光照時間按照12 h間隔，保持充足飼料和飲水，定期清理排泄物。整個實驗周期大鼠生長正常，無疾病及感染發(fā)生。

1.1.2 試劑和儀器設(shè)備：主要試劑包括戊巴比妥鈉注射液、生理鹽水、葡萄糖氯化鈉液、脂多糖(批號：L8880；Sigma)和D-氨基半乳糖(批號：G7219；Ruibio)。主要儀器包括電子計量天平、超凈工作臺、蒸汽滅菌鍋和無菌手術(shù)工具包。

1.1.3 D-氨基半乳糖+脂多糖混合溶液配制：稱取4.0 g D-GalN和2.0 mg LPS溶于80 ml生理鹽水，用pH6.8氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，用生理鹽水調(diào)節(jié)容積至100 ml。采用0.22 μm過濾膜過濾除菌并保存。配制成每毫升含40 mg D-GalN和20 μg LPS的混合液。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性肝衰竭模型構(gòu)建：30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、手術(shù)組及模型組，每組10只。對照組常規(guī)飼養(yǎng)，不予手術(shù)處理。手術(shù)組及模型組均行60%肝切除術(shù)，術(shù)前12 h禁食，6 h禁水。1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)臺上，腹部備皮。操作人員戴無菌手套，鋪無菌孔巾，碘伏消毒液擦拭手術(shù)部位消毒。用手術(shù)刀沿大鼠腹中線從劍突下1 cm處切開，傷口長3～4 cm，仔細(xì)分離肝臟周圍韌帶，將大鼠肝葉(中葉、左葉、右葉、尾頁)暴露在視野中。輕撥肝臟，將各頁肝蒂露出，使用1個0號絲線結(jié)扎含肝右葉靜脈的肝蒂，切斷肝右葉(肝右葉占全部肝臟的60%)。手術(shù)操作過程中未發(fā)生大出血、死亡等情況。完成手術(shù)后縫合切口，再次消毒后用無菌紗布包扎，予以消毒棉保暖，重新放置于動物房飼養(yǎng)室中。待大鼠蘇醒后，將配置好的D-GalN及LPS混合液按0.5 ml/100 g進(jìn)行腹腔注射，后續(xù)予以糖鹽水和飼料喂食。

1.2.2 標(biāo)本收集與處理：對照組、手術(shù)組、模型組在造模后24、48 h分別靜脈采血，分裝好后于-80 ℃保存。兩個時間點分別處死3～4只大鼠，分離大鼠肝臟，在距離肝臟邊緣0.5 cm處取肝組織小塊，PBS沖洗后置入10%甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色。血清樣本采用貝克曼庫爾特AU5800全自動生化分析儀進(jìn)行分析，檢測肝功能指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)及總膽紅素(TBIL)水平。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠一般情況 造模期間，對照組大鼠表現(xiàn)活潑，毛發(fā)有光澤，進(jìn)食正常，大小便正常；手術(shù)組大鼠活動度尚可，精神一般，反應(yīng)減弱，毛發(fā)較稀疏，食欲尚可，二便少；模型組大鼠行動遲緩，反應(yīng)遲鈍，肢體蜷縮，毛發(fā)枯黃，食欲差，二便少。

2.2 三組大鼠生存情況 對三組造模后大鼠進(jìn)行生存情況統(tǒng)計，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在造模后48 h內(nèi)死亡3只，48 h生存率為70%，對照組及手術(shù)組無死亡。

2.3 三組大鼠肝功能指標(biāo)比較 見表1。造模后24、48 h，手術(shù)組與模型組大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于對照組，模型組大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于手術(shù)組(均P<0.05)。

表1 三組大鼠肝功能指標(biāo)比較

2.4 三組大鼠造模后肝組織HE染色結(jié)果 見圖1。手術(shù)組大鼠造模后24 h肝組織HE染色結(jié)果顯示肝細(xì)胞彌漫性水腫，肝組織結(jié)構(gòu)尚正常，有點狀壞死；造模后48 h，肝細(xì)胞呈片狀壞死，結(jié)構(gòu)紊亂，可見炎性細(xì)胞片狀浸潤。模型組造模后24 h HE染色結(jié)果顯示肝細(xì)胞呈灶狀壞死，結(jié)構(gòu)紊亂，可見肝細(xì)胞水腫；造模后48 h，肝細(xì)胞呈大塊狀壞死，結(jié)構(gòu)紊亂，相比造模后24 h壞死區(qū)域面積擴(kuò)大，達(dá)到肝衰竭模型標(biāo)準(zhǔn)。

3 討 論

ALF是由肝炎病毒、藥物、肝毒性物質(zhì)、手術(shù)損傷等多種因素誘發(fā)的肝細(xì)胞大塊壞死或急劇彌漫性肝細(xì)胞變性、肝功能嚴(yán)重?fù)p害造成的臨床綜合征。目前仍缺乏特效治療藥物，患者自然死亡率高達(dá)70%～90%[1-3]。因此，建立高效的ALF動物模型對臨床研究、診療均有著重要意義。由于大鼠的生理及代謝特點與人類相似，而且基因組同源性也較高，因此成為重要的實驗對象。另外，對于大鼠基因組的研究目前較為透徹，因此用大鼠建立ALF動物模型十分必要。

誘導(dǎo)大鼠ALF模型的方法很多，但機(jī)制不同，病理生理改變及臨床診療方式也不盡相同。腹腔注射刀豆蛋白A[4]、D-GalN+LPS[5]、硫代乙酰胺[6]，酒精[7]、四氯化碳[8-9]灌胃，肝部分切除術(shù)[10]均可引起ALF，這些方式分別會引起免疫性肝損害、肝細(xì)胞凋亡、肝細(xì)胞膜通透性改變、肝細(xì)胞纖維化、肝細(xì)胞脂肪性病變、肝臟缺血再灌注等肝細(xì)胞損害，從而形成肝衰竭模型。治療肝衰竭的根本方法是肝移植術(shù)，而明晰其免疫和再生機(jī)制是提高肝移植存活率的關(guān)鍵。理想肝切除術(shù)模型的建立對研究肝再生、肝移植、肝癌切除術(shù)、肝衰竭預(yù)后以及降低致死率都有著十分重要的意義。Johannes Gaub創(chuàng)建的90%肝切除大鼠模型可完美復(fù)制ALF，但操作難度大，大鼠死亡率高，不利于實驗觀察。課題組通過降低肝切除比例來確定合適肝衰竭模型，最終建立了切除大鼠60%肝臟組織，術(shù)后腹腔注射D-GalN+LPS混合溶液來構(gòu)建ALF大鼠模型的方法。

肝臟缺血再灌注損傷(IRI)是肝移植術(shù)后肝衰竭的主要原因。IRI可分為由肝細(xì)胞損傷引起的熱IRI及由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)損傷和微循環(huán)障礙引起的冷IRI。兩種類型IRI均通過肝臟Kupffer細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活、細(xì)胞因子和趨化因子產(chǎn)生、活性氧釋放誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷，引發(fā)肝衰竭[11-13]。D-GalN、LPS聯(lián)用可加劇肝細(xì)胞損傷，激活Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生各種炎性因子[14]，并激活Caspase酶、啟動子Caspase-8和Caspase-9等多種凋亡信號，從而激活效應(yīng)細(xì)胞Caspase-3，裂解細(xì)胞底物聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)，觸發(fā)凋亡程序，導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死[15]，加劇肝衰竭形成。

90%肝切除模型大鼠死亡率過高，藥物觀察時間窗較短，不利于療效觀察，因此從觀察肝再生角度來看，ALF最佳動物模型造模方式是手術(shù)聯(lián)合藥物。本研究中，60%肝切除+20 mg/100 g D-GalN+10 μg/100 g LPS腹腔注射構(gòu)建大鼠ALF模型后24、48 h檢測血清肝功能指標(biāo)并對肝組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示手術(shù)組與模型組大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于對照組，模型組大鼠ALT、AST、TBIL水平均高于手術(shù)組；手術(shù)組24、48 h HE染色結(jié)果與ALF病理特征吻合度不高，但模型組HE染色結(jié)果顯示造模后24 h大部分區(qū)域細(xì)胞已經(jīng)壞死，造模后48 h壞死區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大，達(dá)到了ALF要求。

在構(gòu)建急性肝衰竭大鼠模型中，筆者體會如下：①應(yīng)掌握熟練的操作技巧，以避免因手術(shù)操作不當(dāng)導(dǎo)致大鼠失血過多而死亡；②嚴(yán)格無菌操作，以避免因細(xì)菌感染加重大鼠病情，導(dǎo)致大鼠死亡；③嚴(yán)格按照大鼠體重及藥物濃度計算藥物劑量，以避免因藥物劑量不足或過多導(dǎo)致造模失?。虎軕?yīng)避免藥物注入大鼠血管及腸道內(nèi)而導(dǎo)致大鼠死亡；⑤造模過程應(yīng)注重預(yù)實驗，依據(jù)大鼠型號及藥物制定適宜的造模方法。