脂多糖通過(guò)NOD樣受體蛋白3炎癥小體通路誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷實(shí)驗(yàn)研究

黃 珊，寧佐偉，王國(guó)正，李 洋，羅曉英，金思一

(1.廣東省婦幼保健院內(nèi)科重癥監(jiān)護(hù)室，廣東 廣州 511400；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化科，廣東 廣州 510515)

近年來(lái)膿毒癥造成的肝損傷逐漸引起醫(yī)生的關(guān)注[1]。肝臟在膿毒癥發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，其介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)既能清除體內(nèi)細(xì)菌與毒素，又可能導(dǎo)致炎癥放大、免疫抑制與器官損傷，而肝臟正是膿毒癥最常見的損傷器官[2]。膿毒癥造成肝損傷，而肝損傷又會(huì)加劇膿毒癥的嚴(yán)重程度，因此探究膿毒癥相關(guān)肝損傷的病理生理機(jī)制將有助于從相應(yīng)信號(hào)通路著手研究治療膿毒癥的新策略。

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌表達(dá)的內(nèi)毒素。既往研究[3]已表明，LPS會(huì)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，造成線粒體結(jié)構(gòu)紊亂，導(dǎo)致肝細(xì)胞變性壞死，但其具體的分子機(jī)制仍有待深入探討。炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合體，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的組成部分，能夠識(shí)別外來(lái)病原微生物與內(nèi)源性損傷等信號(hào)，從而激活下游相關(guān)靶信號(hào)，調(diào)控炎癥反應(yīng)，抵抗病原體感染與應(yīng)激損傷，但其在過(guò)度活化的狀況下會(huì)導(dǎo)致組織器官產(chǎn)生炎癥損傷[4]。NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)是近年來(lái)臨床研究的熱點(diǎn)炎癥小體之一，目前對(duì)于NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體的研究較為深入，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種病原體及其成分均可活化NLRP3炎性復(fù)合體[5]。本研究采用不同濃度LPS刺激大鼠及肝原代細(xì)胞，探討其對(duì)肝組織的影響，并以NLRP3炎癥小體相關(guān)基因的表達(dá)情況為觀察指標(biāo)，分析LPS造成急性肝細(xì)胞損傷的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK(粵)2019-0192，平均體重為200～300 g，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為14～16 ℃。本研究符合一般動(dòng)物學(xué)倫理要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：LPS(L2630)購(gòu)自美國(guó)sigma公司；Hoechst 33342細(xì)胞凋亡染色試劑盒購(gòu)自Sigma公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自南京固與生物；胎牛血清與DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；抗NLRP3抗體(ab214185)、抗凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)抗體、抗白介素-1β(IL-1β)抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白(IgG)購(gòu)自Abcam公司；PH0722兔抗體免疫組化試劑盒購(gòu)自福州飛凈生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷：將6只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與LPS組，各3只。LPS組腹腔注射LPS(10 mg/kg)，對(duì)照組注射等量生理鹽水。注射24 h后抽取外周靜脈血測(cè)定肝丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。取血后對(duì)所有大鼠行腹腔麻醉，取肝左葉組織以10%中性甲醛固定，脫水后以石蠟包埋切片，HE染色后置于顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組化測(cè)定蛋白表達(dá)：將1.2.1中肝組織石蠟切片進(jìn)行脫蠟處理，抗原修復(fù)后以3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10 min，PBST沖洗3次，每次3 min。以10%山羊血清室溫孵育30 min，標(biāo)本放于濕盒中，添加1∶100稀釋后的一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBST沖洗3 min×3次。添加生物素標(biāo)記的二抗37 ℃孵育1 h，PBST沖洗3 min×3次。DAB顯色劑顯色，PBST沖洗3 min×3次。蘇木素浸泡標(biāo)本3 min，去離子水沖洗3 min，脫水，透明，封片劑封片，置于顯微鏡下觀察。

1.2.3 肝原代細(xì)胞提取：取健康SD大鼠，將其麻醉后分離肝門靜脈，置入留置針，以15 ml/min速度灌注37 ℃預(yù)熱前灌液10 min。分離肝臟后灌液以5 ml/min速度灌注15 min。肝臟浸入分散液，剪去肝臟包膜，37 ℃水浴20～30 min。以70 μm篩去除雜質(zhì)，留下肝細(xì)胞懸液，離心純化后得到肝原代細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組實(shí)驗(yàn)：將1.2.3中的肝原代細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2、濕度飽和的恒溫培養(yǎng)箱中，以含有20%胎牛血清的DEME培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞分為空白對(duì)照組、L-LPS組與H-LPS組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。空白對(duì)照組、L-LPS組與H-LPS組細(xì)胞在饑餓后分別在含0、100、1000 ng/ml LPS的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)，以下每種實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.4.1 增殖與凋亡測(cè)定：將各組細(xì)胞取出，每孔加入10 μl CCK試劑，于37 ℃孵育2 h，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(OD)，細(xì)胞增殖活力=各組OD值/對(duì)照組OD值。收集各組細(xì)胞，PBS洗滌3次后加入4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌后加入10 μg/ml Hoechst 33342避光孵育15 min，PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用Image J軟件計(jì)算每張圖片在相同放大倍數(shù)下的總細(xì)胞數(shù)和Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡率。凋亡率=Hoechst陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4.2 mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定：以TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，以分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度與濃度，純度合格后取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，以2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)含量。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定：分別提取各組細(xì)胞內(nèi)總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳結(jié)束后將其電轉(zhuǎn)至PVDF膜，完成后取出PVDF膜并以5%脫脂牛奶封閉，添加一抗(1∶1000)于4 ℃過(guò)夜，再使用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育1 h，清洗PVDF膜后加入顯色液，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，軟件計(jì)算灰度值作為蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠ALT與AST水平比較 見表1。LPS組大鼠腹腔注射LPS 24 h后，ALT、AST水平均較對(duì)照組明顯升高(均P<0.05)。

表1 兩組大鼠ALT與AST水平比較(U/L)

2.2 兩組大鼠肝組織HE染色結(jié)果 見圖1。對(duì)照組中肝細(xì)胞形態(tài)正常，組織結(jié)構(gòu)正常。LPS組大鼠腹腔注射LPS 24 h后，肝臟HE染色可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹、局灶壞死，提示LPS刺激可導(dǎo)致大鼠急性肝細(xì)胞損傷。

圖1 對(duì)照組(左)與LPS組(右)大鼠肝組織染色結(jié)果(HE染色，×100)

2.3 兩組大鼠肝組織NLRP3與ASC蛋白表達(dá)情況 見圖2。LPS組大鼠肝組織細(xì)胞質(zhì)被染成黃褐色，表示NLRP3、ASC蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而對(duì)照組幾乎未見染色陽(yáng)性細(xì)胞，提示LPS可能通過(guò)NLRP3炎癥小體通路導(dǎo)致急性肝細(xì)胞損傷。

A：對(duì)照組NLRP3；B：LPS組NLRP3；C：對(duì)照組ASC；D：LPS組ASC

2.4 三組肝原代細(xì)胞增殖與凋亡情況比較 見表2。與空白對(duì)照組相比，LPS刺激后肝原代細(xì)胞增殖率均有所降低，凋亡率均有所升高，且H-LPS組細(xì)胞增殖率低于L-LPS組，細(xì)胞凋亡率高于L-LPS組(均P<0.05)。

表2 三組肝原代細(xì)胞增殖與凋亡情況比較(%)

2.5 三組肝原代細(xì)胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 見表3。與空白對(duì)照組相比，LPS組肝原代細(xì)胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均增加，且H-LPS組均高于L-LPS組(均P<0.05)。

表3 三組肝原代細(xì)胞NLRP3、ASC、IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.6 三組肝原代細(xì)胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 見表4。與空白對(duì)照組相比，LPS組肝原代細(xì)胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達(dá)量均明顯增加，且H-LPS組均高于L-LPS組(均P<0.05)。

表4 三組肝原代細(xì)胞NLRP3、ASC、IL-1β蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

炎癥是機(jī)體對(duì)病原菌感染與組織損傷產(chǎn)生的一類快速應(yīng)激反應(yīng)，屬于機(jī)體先天免疫過(guò)程中的一項(xiàng)保護(hù)措施，對(duì)于控制感染、適應(yīng)性免疫、修復(fù)受損組織、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)均有著十分重要的意義。但它也可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良后果，如免疫功能障礙、組織損傷、器官衰竭甚至死亡，膿毒癥肝損傷便是炎癥反應(yīng)過(guò)度造成的[6]。NLRs炎癥小體是炎癥反應(yīng)中的重要組成部分，其中NLRP3炎癥小體信號(hào)通路是近年來(lái)臨床研究的熱點(diǎn)。既往研究[7-8]表明NLRP3在感染性疾病、自身免疫疾病、代謝紊亂、神經(jīng)退行性疾病等均表現(xiàn)為過(guò)度激活狀態(tài)，能被多種刺激激活，包括環(huán)境因素、外源性微生物及內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)等。

本研究通過(guò)采用不同濃度革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素LPS分別刺激大鼠及肝細(xì)胞，探討LPS所致肝細(xì)胞損傷與NLRP3炎癥小體通路相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系，以期為膿毒癥肝損傷的治療提供新的靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，大鼠注射LPS 24 h后血液中轉(zhuǎn)氨酶含量明顯升高，肝組織HE染色可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫脹、局灶壞死，提示LPS刺激可導(dǎo)致大鼠急性肝損傷；LPS組大鼠肝組織細(xì)胞質(zhì)被染成黃褐色，表示NLRP3、ASC蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而對(duì)照組幾乎未見染色陽(yáng)性細(xì)胞，提示LPS可能通過(guò)NLRP3炎癥小體通路導(dǎo)致急性肝損傷。

本研究進(jìn)一步采用LPS刺激肝原代細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，LPS處理的兩組細(xì)胞增殖率均有所降低，凋亡率均有所升高，且NLRP3、ASC、IL-1β mRNA與蛋白表達(dá)量均明顯增加，且H-LPS組細(xì)胞增殖率低于L-LPS組，細(xì)胞凋亡率高于L-LPS組，同時(shí)H-LPS組NLRP3、ASC、IL-1β蛋白表達(dá)量高于L-LPS組。相關(guān)研究[9]表明，病原微生物來(lái)源物與內(nèi)源性損傷信號(hào)分子刺激均可能誘導(dǎo)炎性復(fù)合體裝配。當(dāng)LPS刺激肝原代細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了一系列改變(如溶酶體破裂，細(xì)胞器滲透入細(xì)胞質(zhì)導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性喪失，細(xì)胞氧化還原平衡被打破等)，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活了NLRs信號(hào)[10-11]。NLRs信號(hào)活化后，NLRP3炎癥小體與銜接分子ASC結(jié)合成復(fù)合物，首先募集半胱氨酸蛋白酶前體并使其發(fā)生水解成為具有生物活性的成熟的半胱氨酸蛋白酶[12]。半胱氨酸蛋白酶不具備直接調(diào)控凋亡作用，但在炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可通過(guò)對(duì)促炎因子前體pro-IL-1β進(jìn)行剪切，使其成為成熟IL-1β并釋放，進(jìn)一步放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞死亡[13]。潮蓉等[14]采用小鼠構(gòu)建酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P2X7、NLRP3、ASC、IL-1β表達(dá)明顯升高，使用P2X7特異性阻斷劑A438079后上述基因表達(dá)明顯降低，因此酒精誘導(dǎo)的肝損傷可能與P2X7R-NLRP3信號(hào)通路有關(guān)。Wang等[15]從不同角度揭示了細(xì)菌感染誘發(fā)肝損傷的可能機(jī)制，指出腸肝軸可能通過(guò)膽汁酸代謝連接了肝臟與腸道，膽汁酸失調(diào)導(dǎo)致腸道失調(diào)，革蘭陰性細(xì)菌等腸源性病原菌可通過(guò)門靜脈進(jìn)入肝臟，從而激活NLRP3炎性小體，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，引發(fā)肝臟炎癥。本研究結(jié)果與上述研究具有一致性。

綜上所述，LPS刺激大鼠后造成急性肝損傷，肝酶水平急劇上升，且肝組織出現(xiàn)明顯炎癥與壞死，大鼠肝組織免疫染色及肝細(xì)胞蛋白凝膠電泳檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體蛋白表達(dá)量上升，表明其誘發(fā)肝損傷可能是通過(guò)上調(diào)肝組織中NLRP3炎癥小體通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。