MSP58低表達對垂體瘤細胞AtT-20增殖、侵襲和遷移的影響

高海鋒,董秋鋒,姬西團,高大寬,黃 鋼*

(1西北大學(xué)附屬醫(yī)院,西安市第三醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710018;2空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科;*通訊作者,E-mail:qijiazai10692086@163.com)

垂體瘤是起源于腺垂體細胞的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見腫瘤,占顱內(nèi)腫瘤的27%-30%[1]。99.8%的垂體瘤為良性腫瘤,但少數(shù)垂體瘤具有侵襲性生長的惡性腫瘤生物學(xué)特征,能向周圍組織侵襲性生長,破壞鞍區(qū)骨質(zhì)、海綿竇等鞍區(qū)結(jié)構(gòu),手術(shù)治療難以將其完全切除,術(shù)后復(fù)發(fā)率高達30%,死亡率較高,嚴重威脅患者生命健康[2-4]。垂體瘤細胞的侵襲性生長受基因調(diào)控、細胞基質(zhì)降解等多種因素影響,與腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移等過程密切相關(guān)。因此,探討垂體瘤生物學(xué)行為的分子機制,對于垂體瘤治療具有重要意義。核微球蛋白58(nucleolar 58-kD microspherule protein,MSP58)是一個癌基因,可以被癌基因v-jun特異誘導(dǎo)表達,并引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化[5]。既往研究發(fā)現(xiàn),MSP58在胃癌、膠質(zhì)瘤中高表達,與胃癌患者預(yù)后、膠質(zhì)瘤惡性程度密切相關(guān)[6,7],且干涉其表達可抑制肺癌增殖、侵襲等惡性表型[8]。但MSP58對垂體瘤細胞生物學(xué)行為的影響尚缺乏研究,本研究將通過下調(diào)MSP58表達,研究其對垂體瘤細胞AtT-20增殖、侵襲、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人垂體瘤AtT-20、GT1-1、GH3細胞(貨號:XY-XB-2707、ZY-M057、YB-ATCC-4993)購自美國ATCC細胞庫;HP75細胞(貨號:CE23928)購自北京科瑞思搏生物科技有限公司;胎牛血清(貨號:FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司;RPMI-1640培養(yǎng)液(貨號:GNM-31800)購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑盒(貨號:11668019、15596018)購自美國Invitrogen公司;對照siRNA、針對MSP58的特異siRNA與MSP58、β-actin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)試劑盒、MTT溶液(貨號:ALH197-VNA、GL0247-RXS)購自北京百奧萊博科技有限公司;Matrigel基質(zhì)膠(貨號:356234)購自美國BD公司;Transwell小室(貨號:SPL-36224)購自北京孚博生物科技有限公司;結(jié)晶紫(貨號:0528-100G)購自美國Amresco公司;MSP58抗體(貨號:IC186993)購自上海鈺博生物科技有限公司;增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2抗體、MMP-9抗體、三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(貨號:ab18197、ab235167、ab73734、ab181602)購自Abcam公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號:0295G-HRP)購自美國Santa公司;恒溫培養(yǎng)箱(型號:TY10GI2-2)購自美國Shellab公司;熒光定量PCR儀(型號:ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司;酶標(biāo)儀(型號:MODEL550)購自美國Bio-Rad公司;顯微鏡(型號:CX31)購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),每1-2 d換液1次,每3 d離心收集傳代1次。傳代3次后取對數(shù)生長期細胞用于以下實驗。

取生長良好的對數(shù)生長期AtT-20細胞,以2.0×105個/孔接種于96孔或24孔培養(yǎng)板,分為對照組、NC-siRNA組和MSP58-siRNA組,每組3個復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)到細胞融合率達75%,NC-siRNA組和MSP58-siRNA組AtT-20細胞用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染對照siRNA和針對MSP58的特異siRNA。

1.2.2 qRT-PCR法檢測AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達情況 將AtT-20細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h,離心收集細胞,按照TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)程序:37 ℃×15 min,85 ℃×5 s,4 ℃。以cDNA為模板,按照qRT-PCR試劑盒說明書步驟檢測MSP58 mRNA表達水平,結(jié)果以2-ΔΔCt法表示,內(nèi)參基因為β-actin。反應(yīng)程序:95 ℃×5 min;94 ℃×30 s,58 ℃×30 s,72 ℃×1 min,循環(huán)32次。MSP58上游引物:5′-ACGCCCTGCTCTACGAT-3′,下游引物:5′-TCATGCCTGTGATGCTGTC-3′;內(nèi)參β-actin上游引物:5′-GGCGGCAACACCATGTACCCT-3′,下游引物:5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.2.3 MTT法檢測AtT-20細胞增殖情況 設(shè)置空白組(添加不含細胞的RPMI-1640培養(yǎng)基),將空白組及1.2.1中各組細胞轉(zhuǎn)染后分別培養(yǎng)24,48,72 h,加入20 μl MTT試劑,培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng);棄培養(yǎng)基,加150 μl二甲基亞砜,待結(jié)晶完全溶解后,使用酶標(biāo)儀檢測在波長450 nm處的吸光度(optical density,OD)值,計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.4 Transwell法檢測AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲情況 將AtT-20、HP75、GH3、GT1-1及1.2.1中轉(zhuǎn)染后的各組AtT-20細胞用胰酶消化,用無血清培養(yǎng)基配制為1×103個/ml的細胞懸浮液。用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠,向Transwell小室中鋪50 μl,室溫凝固;Transwell小室上室加200 μl細胞懸浮液,下室加500 μl 10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育24 h;取出Transwell小室,用無菌棉簽擦去未穿膜細胞,4%多聚甲醛固定15 min,0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min,200倍鏡下隨機選取6個視野,觀察拍照,統(tǒng)計侵襲細胞數(shù)。

1.2.5 Transwell法檢測AtT-20細胞遷移情況 用胰酶消化轉(zhuǎn)染后的AtT-20細胞,用無血清培養(yǎng)基配制1×103個/ml的細胞懸浮液,向Transwell小室上室加200 μl,下室加500 μl含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育24 h;擦去未穿膜細胞,4%多聚甲醛固定15 min,0.5%結(jié)晶紫染液染色20 min,200倍鏡下隨機選取6個視野,觀察拍照,統(tǒng)計遷移細胞數(shù)。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達情況 將AtT-20細胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h,離心收集細胞,裂解細胞提取總蛋白并進行定量。行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,加入一抗(MSP58抗體、PCNA抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體,均1 ∶800稀釋)孵育過夜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育1 h,顯色、顯影,拍照、分析條帶灰度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲情況

各個垂體瘤細胞系中,AtT-20細胞侵襲細胞數(shù)均高于HP75、GH3、GT1-1細胞(見圖1、表1)。

圖1 AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲情況

表1 AtT-20、HP75、GH3、GT1-1細胞侵襲細胞數(shù)

2.2 各組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達水平相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

表2 各組AtT-20細胞中MSP58 mRNA表達水平比較

2.3 各組AtT-20細胞增殖情況

各個時間點,NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞增殖率相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞增殖率顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

表3 各組AtT-20細胞增殖率比較

2.4 各組AtT-20細胞侵襲情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞侵襲細胞數(shù)相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞侵襲細胞數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2、表4)。

圖2 各組AtT-20細胞侵襲情況

表4 各組AtT-20細胞侵襲細胞數(shù)比較

2.5 各組AtT-20細胞遷移情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞遷移細胞數(shù)相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞遷移細胞數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表5、圖3)。

表5 各組AtT-20細胞遷移細胞數(shù)比較

圖3 各組AtT-20細胞遷移情況

2.6 各組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達情況

NC-siRNA組與對照組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與NC-siRNA組相比,MSP58-siRNA組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表6、圖4)。

表6 各組AtT-20細胞中MSP58、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平比較

3 討論

垂體瘤是一種發(fā)病率僅次于腦膜瘤、腦膠質(zhì)瘤的顱內(nèi)腫瘤,大部分為不會發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的非侵襲性垂體瘤,惡性程度較低[9]。然而,還有少部分垂體瘤為侵襲性垂體瘤,具備與惡性腫瘤類似的生長方式,可向鞍區(qū)周圍的垂體窩、鞍底骨質(zhì)、海綿竇、蝶竇和下丘腦等部位侵襲,造成不同程度的破壞,生長速度快,治療難度大,復(fù)發(fā)性高[10,11]。因此,尋找在腫瘤生長、侵襲等惡性生物學(xué)行為中起重要作用的關(guān)鍵分子,并闡明其相關(guān)機制,對侵襲性垂體瘤治療具有重要價值。本研究在前期實驗中發(fā)現(xiàn)AtT-20細胞侵襲性較其他垂體瘤細胞系(HP75、GH3、GT1-1)強,故本研究僅針對AtT-20細胞的生物學(xué)行為展開實驗。

MSP58又稱為微球蛋白1(MCRS1),在目前研究中被認為是一種癌基因,在核糖體轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細胞增殖、致癌轉(zhuǎn)化等多種細胞過程中起重要作用[12]。Yang等[13]認為,MSP58是與rRNA轉(zhuǎn)錄、細胞增殖相關(guān)的核仁蛋白,通過與各種轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄,在許多細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。尹戰(zhàn)海等[5]研究表明,MSP58基因在骨肉瘤腫瘤組織中過度表達,下調(diào)其表達可抑制骨肉瘤細胞增殖能力。張樹天等[8]研究表明,利用特異性siRNA下調(diào)MSP58基因的表達,能顯著抑制肺癌A549細胞的增殖、侵襲能力,認為MSP58有望成為肺癌治療的新靶點。Zhai等[14]研究發(fā)現(xiàn),下調(diào)MSP58可能通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑抑制了腎細胞癌細胞的增殖和侵襲。但Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn),MCRS1通過抑制端粒酶活性可抑制胃癌患者的淋巴轉(zhuǎn)移,過表達MCRS1可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖,遷移,侵襲過程。垂體瘤細胞的增殖情況可從一定程度上反映腫瘤的惡性程度。本研究通過下調(diào)MSP58在AtT-20細胞中的表達發(fā)現(xiàn),AtT-20細胞中MSP58下調(diào)表達后細胞增殖率顯著降低,提示MSP58參與AtT-20細胞增殖過程,可能通過干預(yù)AtT-20細胞增殖影響腫瘤惡性程度,下調(diào)其表達有助于降低腫瘤惡性,方便治療。

部分垂體瘤具有侵襲性,易導(dǎo)致患者治療后復(fù)發(fā),這是神經(jīng)外科亟待解決的難題,目前通常采用手術(shù)治療、藥物治療、放射治療等治療方式,但都有其局限性,深入了解腫瘤侵襲性生長機制,將有助于推動侵襲性垂體瘤的個體化、精準化治療[16,17]。本研究結(jié)果顯示,成功下調(diào)MSP58在AtT-20細胞中的表達后,AtT-20細胞侵襲、遷移細胞數(shù)顯著降低,提示MSP58表達與AtT-20細胞侵襲、遷移過程有關(guān),針對MSP58表達進行治療可能有助于減少垂體瘤復(fù)發(fā)。PCNA是細胞增殖分裂所必需的蛋白之一,上調(diào)其表達可促進乳腺癌細胞增殖[18]。MMP-2、MMP-9均為MMP家族成員,可以降解許多細胞外基質(zhì)成分,創(chuàng)造有利于腫瘤細胞發(fā)生侵襲、遷移的環(huán)境,在腫瘤侵襲、遷移過程中發(fā)揮重要作用[19,20]。本研究結(jié)果顯示,成功下調(diào)MSP58在AtT-20細胞中的表達后,AtT-20細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平均顯著降低,提示MSP58可影響AtT-20細胞中PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達,并可能通過影響上述蛋白表達,進而參與對AtT-20細胞增殖、侵襲、遷移的調(diào)控。

綜上所述,下調(diào)MSP58表達后,垂體瘤細胞AtT-20的增殖、侵襲、遷移過程均受到明顯抑制,MSP58可能成為垂體瘤治療的新靶點。