無創(chuàng)假陰性2家系研究*

陳運春，黃盱寧，孔嫦瑛，胡建東

1.海南省?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院檢驗科，海南?？?570216；2.海南省海口市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，海南?？?570216；3.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，海南?？?570311；4.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南?？?570311

無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測技術(shù)(NIPT)通過采集孕婦靜脈血來檢測胎兒是否患3種常見胎兒染色體非整倍體異常：21-三體綜合征(Down綜合征)、18-三體綜合征(愛德華氏綜合征)、13-三體綜合征(Patau綜合征)。先天性心臟病(CHD)是一種常見的先天畸形，是由原發(fā)性胚胎發(fā)育異常所致的心臟和胸腔內(nèi)大血管結(jié)構(gòu)異常，其發(fā)病率在活產(chǎn)新生兒中占0.5%～1.0%，在死胎中可高達(dá)3.0%[1]。本文對2例無創(chuàng)檢查陰性伴CHD的先證者及父母進(jìn)一步行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，進(jìn)行觀察性研究分析，探討其成因及對策。

1 資料與方法

1.1一般資料 對2例無創(chuàng)檢查陰性伴CHD的先證者及父母進(jìn)一步行細(xì)胞遺傳學(xué)檢查，本研究經(jīng)患者本人知情同意，未違反醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則。

1.1.1病例1 先證者B超檢查：中晚孕Ⅲ級產(chǎn)科(系統(tǒng)超聲)，子宮增大，宮內(nèi)見單胎，頭位。胎兒測量參數(shù)，雙頂徑51 mm，頭圍185 mm，腹圍174 mm，股骨長度36 mm，胎兒體質(zhì)量估測(447±65)g。胎頭橢圓形，顱骨環(huán)完整。顱內(nèi)結(jié)構(gòu)兩側(cè)對稱，腦中線居中，腦室無增寬。小腦半球大小形態(tài)正常。頸項皮層厚約8 mm。胎兒上唇皮膚連續(xù)，雙眼玻璃體，鼻可見。胎兒脊柱邊緣連續(xù)。胎兒胸腔未見明顯異常液區(qū)，心胸增大，以右心增大明顯。心臟四腔心切面可顯示，左右心腔不對稱，三尖瓣均可見開放及關(guān)閉運動，二尖瓣未見開放、關(guān)閉運動。右室流出道切面可顯示，左室流出道未顯示，三血管切面僅見1條大動脈回聲，胎心率138次/分，律齊。胎兒腹腔未見異常液性區(qū)。胃泡和膀胱可顯示。雙腎臟可顯示，形態(tài)飽滿，雙腎回聲彌漫性增強。胎兒上肢肱骨、尺骨及橈骨可顯示；雙手呈外翻狀，姿勢固定無變化，胎兒下肢股骨、脛骨及腓骨可顯示。胎盤附著于子宮前壁，厚26 mm，成熟度0級，下緣覆蓋宮頸口。臍帶入口位于胎盤邊緣。羊水最大深度 47 mm，透聲好，臍動脈一條，未見臍帶繞頸。臍動脈S/D=2.72。確診CHD后于外院行引產(chǎn)術(shù)。

1.1.2病例2 先證者A型血，RhD陽性，RhC陽性，RhE陽性。乙型肝炎病毒血清學(xué)標(biāo)志物5項檢測：抗-HBc陽性，余陰性。丙型肝炎病毒陰性，人免疫缺陷病毒陰性，梅毒螺旋體抗體(TPPA)陰性。血常規(guī)正常。孕36+2周順產(chǎn)出生，出生1 d住院診斷：CHD、房間隔缺損、室間隔缺損、隱睪、新生兒視網(wǎng)膜病變。查體：出生體質(zhì)量1.8 kg，簡易胎齡評分：足底紋理2分+乳頭形成1分+指甲1分+皮膚組織2分+27分=33周。查血常規(guī)：白細(xì)胞計數(shù)12.14×109/L，血紅蛋白175 g/L，血小板計數(shù)158×109/L。

彩色多普勒超聲檢查，超聲測值：主動脈瓣環(huán)4 mm，主動脈竇部7 mm，升主動脈7 mm，肺動脈10 mm，降主動脈5 mm；左房前后徑11 mm，室間隔3 mm，左室舒張末期14 mm，左室舒張末期14 mm，左室后壁5 mm，右室前后徑8 mm。2D及M型特征：心房正位，心室右襻，房室連接及大血管連接關(guān)系正常，左心稍大，右心房腔內(nèi)徑正常；右室壁增厚約3 mm，室壁運動收縮幅度尚正常；室間隔主動脈瓣下回聲中斷約7 mm，房間隔中部回聲中斷約7 mm，各瓣膜形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，啟閉尚可；降主動脈與肺動脈之間可見異常通道，寬約5 mm；心包腔內(nèi)未見異?；芈暋２噬邦l譜多普勒特征：瓣口流速M/S，二尖瓣1.0，三尖瓣0.9，主動脈1.1，肺動脈瓣1.8；房水平可見左向右為主的雙向分流，室水平可見左向右為主的雙向分流，流速均約1.0 m/s；降主動脈與肺動脈之間異常通道內(nèi)似可見右向左藍(lán)色血流，二尖瓣少量反流，三尖瓣少量反流，峰值流速約3.1 m/s；峰值壓差約38 mm Hg，估測肺動脈收縮壓約43 mm Hg；心內(nèi)余瓣口未見異常彩色湍流信號。

1.2儀器與試劑 二氧化碳培養(yǎng)箱，北昂(BEION)染色體核型分析系統(tǒng)，張氏培養(yǎng)基，人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(廣州拜迪生物醫(yī)藥有限公司)、低滲液(0.075 mol/L的KCl溶液)、10 μg/mL的秋水仙素、固定液(甲醇、冰醋酸)、磷酸鹽緩沖液、胰蛋白酶、吉姆薩染液。

1.3方法 取肝素抗凝外周血1.5 mL，接種含30%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，37 ℃經(jīng)72 h培養(yǎng)，收獲，G顯帶。羊水離心后取沉淀加張氏培養(yǎng)基5 mL混勻，接種25 cm2培養(yǎng)瓶，二氧化碳培養(yǎng)箱開放式培養(yǎng)，8～10 d收獲，G顯帶。北昂(BEION)染色體核型分析系統(tǒng)計數(shù)30個分裂相，分析3～5個核型，視異常情況進(jìn)一步加大計數(shù)100個分裂相、全基因組測序。核型描述參考人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名國際體制(ISCN2016)。

2 結(jié) 果

2.1病例1 先證者羊水染色體核型46，XY，der(8)t(6;8)(q23;p23)pat，1qh+pat。父母體健，非近親結(jié)婚，無遺傳病史，孕1產(chǎn)0。父母備孕前均未做染色體檢查，遵孕期要求，做過無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測結(jié)果為陰性。父親，男，33歲，表型正常，染色體核型:46，XY，t(6；8)(q23；p23)，1qh+，經(jīng)《中國人類染色體異常核型數(shù)據(jù)庫》鑒定專家組鑒定，查詢《Cytogenetics Database》《中國人類染色體異常核型數(shù)據(jù)庫》均未見相關(guān)報道，收錄入《中國人類染色體異常核型數(shù)據(jù)庫》，數(shù)據(jù)庫編號：4058。母親表型正常，染色體核型:46，XX。

2.2病例2 先證者染色體核型為46，XY，der(6)t(6；22)(p25；q11.2)pat。父母體健，非近親結(jié)婚，無遺傳病史，母親孕期服藥史不詳，孕2產(chǎn)1。父母備孕前均未做染色體檢查，遵孕期要求，做過無創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測結(jié)果為陰性?；純焊赣H染色體結(jié)果為46，XY，t(6；22)(p25；q11.2)，母親染色體結(jié)果為46，XX。

先證者全基因組測序結(jié)果：未發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體變異及與受檢者臨床表型相關(guān)的已知的、致病性明確的100 kb以上的微缺失/微重復(fù)變異。經(jīng)過與臨床診斷對照，患兒的心臟缺陷有可能與第6號染色體短臂部分(63810-251901)片段缺失有關(guān)，房間隔缺損有可能與第17號染色體長臂部分(34434626-34628911)片段重復(fù)有關(guān)，如果要明確診斷還需要做進(jìn)一步的檢測確診。

2.32家系情況對比結(jié)果 見表1。

表1 2個家系情況對比表

3 討 論

NIPT通過采集孕婦靜脈血，利用新一代DNA測序技術(shù)對母體外周血漿中的游離DNA片段(包含胎兒游離DNA)進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果進(jìn)行生物信息分析，可以從中得到胎兒的遺傳信息，從而檢測胎兒是否患三大染色體病。無創(chuàng)DNA產(chǎn)前檢測不是一個診斷性試驗，導(dǎo)致不一致結(jié)果發(fā)生的主要原因是由于循環(huán)游離DNA(cfDNA)主要來自于胎盤絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞，后者并不總是能夠代表胎兒情況，在真正的嵌合體(TFM)中，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞核型正常，而胎兒本身則為異常核型，胎兒胎盤嵌合是cfDNA檢測結(jié)果與實際情況不符的主要生物學(xué)原因之一，這將導(dǎo)致NIPT假陰性結(jié)果。

CHD的發(fā)病機制不甚清楚，可能與染色體異常、基因突變、病毒感染及環(huán)境因素等有關(guān)。有研究認(rèn)為，早期對先天性心臟畸形胎兒染色體異常作出診斷，對產(chǎn)前預(yù)測繼續(xù)妊娠或下次妊娠的風(fēng)險至關(guān)重要[2-4]。胎兒先天性心臟畸形以復(fù)雜畸形多見，合并心外畸形的發(fā)生率很高，染色體異常的發(fā)生率亦較高，且以18-三體綜合征為主。多項研究認(rèn)為，21-三體綜合征可能是中國人群CHD胎兒染色體異常的常見類型[5-8]，而本文2例CHD病均伴以衍生染色體，臨床少見，且衍生染色體均來自其父，由于其遺傳物質(zhì)的不平衡，而表現(xiàn)出較嚴(yán)重的臨床癥狀，智力低下或伴多發(fā)畸形。

盡管胎兒超聲檢查的廣泛應(yīng)用可以獲得相應(yīng)的胎兒產(chǎn)前影像學(xué)資料，但這不是確診的標(biāo)準(zhǔn)。由染色體異常引起的CHD約占5%，進(jìn)一步進(jìn)行遺傳學(xué)檢測及遺傳咨詢是必需的。張婧等[9]研究顯示，WHO將預(yù)防措施分為三級預(yù)防:(1)一級預(yù)防，即孕前預(yù)防，針對導(dǎo)致CHD的原因及可能的危險因素，在孕前采取各種有效措施；(2)二級預(yù)防，提高產(chǎn)前診斷技術(shù)，選擇性終止妊娠，減少CHD的發(fā)生(如病例1)；(3)三級預(yù)防，對出生后患兒的各種畸形進(jìn)行積極、及早的治療，提高生存質(zhì)量(如病例2)。

通過對本文2家系的情況進(jìn)行研究分析提示，臨床工作中要注意掌握NIPT適應(yīng)證，父母有染色體異常攜帶其本身是NIPT的不適用人群，不應(yīng)該行NIPT，而應(yīng)直接行核型的產(chǎn)前診斷。故建議要強調(diào)行婚前體檢的染色體檢查，及早檢出染色體異常，對父母為染色體畸變核型攜帶者提前干預(yù)，可直接選擇做第3代試管嬰兒，選擇性生育，避免缺陷患兒出生，避免家庭陷入巨大的精神和經(jīng)濟壓力。