pH值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱凝膠特性及體外消化性的影響

陳艾霖，劉曼曼，周春霞，洪鵬志

（廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心，廣東湛江524088）

中國羅非魚養(yǎng)殖規(guī)模大，2018 年產(chǎn)量高達162.45萬噸，養(yǎng)殖總產(chǎn)量居世界首位[1]。魚分離蛋白（fish protein isolate，F(xiàn)PI）營養(yǎng)價值高，易消化[2]，是優(yōu)質(zhì)動物蛋白的主要來源。酸堿提取法蛋白質(zhì)提取率高，分離到的魚分離蛋白除了含有大部分肌原纖維蛋白外，還含有水溶性肌漿蛋白[3]。與傳統(tǒng)魚糜相比，魚分離蛋白具有脫脂、脫臭、脫色的優(yōu)勢[4]，可作為高檔魚糜制品的蛋白配料。但水產(chǎn)蛋白凝膠在食品應(yīng)用過程中因其凝膠強度低，難凝膠化而受到限制[5]。大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）理化及功能特性突出[6]，是一種具有可持續(xù)性、高營養(yǎng)價值、優(yōu)良風味的食品添加材料。近年來含有優(yōu)質(zhì)的動植物雙蛋白食品成為人們關(guān)注的焦點，這種食品優(yōu)化國民的膳食結(jié)構(gòu)，被列入“健康中國2030”規(guī)劃綱要及最新頒布的國民營養(yǎng)計劃（2017 年～2030 年）中[7]。有研究表明，混合蛋白尤其是動植物蛋白混合可避免單一蛋白的營養(yǎng)不足，提高產(chǎn)品的安全性和營養(yǎng)價值，降低動物蛋白的成本[8]。

蛋白質(zhì)混合方式主要有化學混合和物理混合。化學混合是指將蛋白原料進行一定比例混合后，重新提取出一種新混合蛋白[9]。物理混合是指兩種或兩種以上蛋白直接混合，這種混合在食品加工方面具有方便快捷的優(yōu)勢?；旌系鞍字g相互作用形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或交聯(lián)結(jié)構(gòu)，可改善食品的感官和功能特性[10]。有研究表明，添加1%黑豆和綠豆分離蛋白，可以抑制沙丁魚魚糜中內(nèi)源性蛋白酶水解肌原纖維蛋白，增強凝膠強度[11]；添加花生分離蛋白能夠提高肌原纖維蛋白凝膠的持水性、凝膠強度和彈性，使凝膠結(jié)構(gòu)更緊湊[12]。pH值會影響氨基酸側(cè)鏈電荷的數(shù)量及分布情況，改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)間的疏水相互作用，進而改變蛋白質(zhì)功能特性。為此，本研究利用動植物蛋白功能互補的優(yōu)勢，探討不同pH 值條件對羅非魚蛋白-大豆蛋白（FPI∶SPI=1∶1，質(zhì)量比）混合體系熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響，旨在改善食品加工過程中魚蛋白的凝膠特性，為新型雙蛋白凝膠制品在食品加工中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚：湛江水產(chǎn)市場；大豆低溫脫脂豆粕[粗蛋白含量為（43.75±0.06）%]：湖北荊州三菱湖小漁村；胃蛋白酶（15 000 U/g）、胰蛋白酶（350 000 U/g）：阿拉丁試劑公司；戊二醛、三氯甲烷（均為分析純）：西隴科學股份有限公司。

Avanti J-26sxp 落地高速冷凍離心機：美國Beckman 公司；VAP-450 自動凱氏定氮儀：德國Gerhardf公司；NAI-CCQ-150s 索氏抽提器：上海那艾精密儀器有限公司；NS810 分光測色儀：深圳市三恩時科技有限公司；TMS-PRO 物性分析質(zhì)構(gòu)儀：美國FTC 公司；MARSIII 模塊化高級流變儀：德國HAKKE 公司；JEM-7610-F 掃描電子顯微鏡：日本JEOL 公司。

1.2 方法

1.2.1 FPI 的制備

取鮮活羅非魚背部白肉絞碎，按照料液比1∶9（g/mL）與冰蒸餾水混合均質(zhì)3 min，調(diào)節(jié)pH 值至11.0，攪拌提取15 min 后離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃），上清液pH 值調(diào)至5.5，再離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃）。冰蒸餾水分散沉淀，pH 值調(diào)至7.0，透析后冷凍干燥備用。FPI 的蛋白質(zhì)含量為（90.02±1.07）%。

1.2.2 SPI 的制備

豆粕經(jīng)粉碎后過篩（100 目），按照料液比1∶10（g/mL）與冰蒸餾水混合均質(zhì)3 min，調(diào)節(jié)pH 值至11.0，攪拌提取2 h 后離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃），上清液pH值調(diào)至4.5 后，再離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃），冰蒸餾水分散沉淀，pH 值調(diào)至7.0，透析后冷凍干燥備用。SPI 的蛋白質(zhì)含量為（80.85±0.65）%。

1.2.3 動態(tài)黏彈性的測定

參考Buamard 等[13]的方法并作修改。將一定量的冰蒸餾水分別加入FPI、SPI、FPI∶SPI=1∶1（質(zhì)量比）中分散，固定蛋白濃度12%，調(diào)節(jié)不同pH 值為6.0、6.5、7.0、7.5，使用模塊化高級流變儀，取上述樣品約3 mL于平板上，平板四周加入液體石蠟密封防止該過程中水分蒸發(fā)，主要參數(shù)為：平板夾具直徑35 mm，探頭型號P35 TIL，狹縫間隙1 mm，升溫范圍25 ℃～95 ℃，降溫范圍95 ℃～25 ℃，掃描速率2 ℃/min，頻率0.1 Hz。

1.2.4 凝膠的制備

將一定量的冰蒸餾水分別加入FPI、SPI、FPI∶SPI=1∶1（質(zhì)量比）中分散，固定蛋白濃度為12%，調(diào)節(jié)pH 值為6.0、6.5、7.0、7.5，采用二段式加熱法（40 ℃熱處理1 h，90 ℃熱處理40 min），冰水浴冷卻30 min，4 ℃放置過夜備用。

1.2.5 凝膠質(zhì)構(gòu)的測定

參考Zhou 等[14]方法并略作改動。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)定：圓柱形探頭直徑為5 mm，量程為1 000 N，形變量為75%，起始力為0.5 N，以60 mm/min 的速度連續(xù)兩次壓縮樣品，間隔為5 s，測定凝膠強度、硬度、彈性值。凝膠強度按如下公式計算。

1.2.6 凝膠持水性的測定

按1.2.4 制備凝膠，參考Wu 等[15]的方法并略作改動。稱總質(zhì)量記W1（g），經(jīng)離心（5 000 r/min，15 min）除去水分，再稱質(zhì)量記W2（g），持水性根據(jù)下面公式計算。

1.2.7 凝膠白度的測定

參照Niu 等[16]的方法并略作修改。用色差儀測定凝膠，分別記錄L*（亮度），a*（紅色/綠色），b*（黃色/藍色），凝膠白度值按如下公式計算[17]。

1.2.8 掃描電鏡觀察

參考林端權(quán)[18]的方法并略作修改。掃描電鏡凝膠切片厚度為5 mm，用2.5%pH 6.8 的戊二醛固定12 h，磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）浸泡洗滌15 min，重復(fù)3次。接著分別用50%、70%、80%、90%乙醇各浸泡10 min，無水乙醇浸泡15 min，重復(fù)3 次。三氯甲烷脫脂1 h，乙醇∶叔丁醇1∶1（體積比）混合液浸泡15 min，100%叔丁醇溶液置換15 min，真空冷凍干燥。樣品采用離子濺射鍍膜法對樣品噴金后進行電鏡掃描，觀察其微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.9 體外消化特性

參考Menezes 等[19]的方法并略作修改，體外消化的測定模擬人體胃液和腸液的消化過程。按1.2.4 制備凝膠，稱適量攪碎的凝膠放入100 mL HCl 溶液（0.1 mmol/L，pH 2.0），使得溶液中的蛋白質(zhì)含量為3 mg/mL，添加0.33 g 胃蛋白酶，37 ℃條件下水浴振蕩1.5 h。用1.0 mol/L NaOH 中和至pH 7.0。加入等體積10 mg/mL 胰蛋白酶-磷酸鹽緩沖溶液，37 ℃水浴振蕩反應(yīng)3 h，加入碳酸鈉中止反應(yīng)，利用考馬斯亮藍法測定消化后蛋白含量?？偟鞍缀渴峭ㄟ^凱氏定氮法測定凝膠的蛋白含量。體外消化率的計算公式如下。

式中：Ct為消化前的總蛋白含量，mg/mL；Cp為消化后的蛋白含量，mg/mL。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Origin 9.0 軟件進行繪圖，數(shù)據(jù)間的顯著性采用SPSS Statistics 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 值對混合蛋白凝膠流變特性的影響

pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合體系熱誘導(dǎo)儲能模量的影響見圖1。

圖1 pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合體系熱誘導(dǎo)凝膠儲能模量的影響Fig.1 Effect of pH on heat-induced dynamic elastic modulus of tilapia protein-soy protein mixtures

如圖1 所示，F(xiàn)PI 初始的儲能模量值較大，SPI 溶解性好，在起始階段加熱溫度低，變性程度低，初始儲能模量值小[20]，混合蛋白體系的初始儲能模量值介于FPI 與SPI 之間。隨著溫度的上升，蛋白質(zhì)發(fā)生變性，水產(chǎn)蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)受到破壞，分子間的流動性增大[21]，F(xiàn)PI 的儲能模量G′值下降，之后緩慢上升，分子結(jié)構(gòu)展開后聚集，當溫度高于48 ℃，G′值開始明顯增加，魚糜凝膠有序的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被固定，凝膠強度和彈性增強；SPI 的7S 和11S 的變性溫度分別在75 ℃和90 ℃[16]，當溫度從95 ℃開始下降，7S 和11S 充分變性后，弱酸條件下混合蛋白質(zhì)亞基之間的連接和相互作用增強，G′值快速增大，明顯高于FPI，凝膠特性增強?；旌系鞍左w系在41 ℃之前，凝膠形成松散的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；41 ℃～46 ℃，蛋白質(zhì)開始變性，部分肽鏈解螺旋，增加了蛋白的黏性，同時不同程度上破壞了蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致凝膠劣化[22]；46 ℃～95 ℃時兩種蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開，分子間作用增強，形成強凝膠?；旌系鞍啄z在pH 6.5 時的G′值大于在pH 6.0 時的G′值。有研究表明，pH 5.5～6.0，大豆蛋白11S 往往不能發(fā)生變性和結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)之間的相互作用有限[23]。弱酸條件能增強混合蛋白質(zhì)的凝膠特性，且pH 6.5 時混合蛋白的凝膠特性最好。

2.2 pH 值對混合蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響見圖2。

圖2 pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig.2 Effect of pH on the texture properties of heat-induced gel from tilapia protein-soy protein mixtures

如圖2 所示，在試驗范圍內(nèi)，F(xiàn)PI 凝膠的凝膠強度、彈性、硬度、膠黏性和咀嚼性均隨pH 值的增大而減??；SPI 凝膠的硬度隨pH 值的增大而減小，且SPI凝膠的凝膠強度、彈性均小于FPI；對于混合蛋白熱凝膠，pH 值對凝膠強度和彈性的影響不大（P＞0.05），而pH值偏酸性時混合蛋白熱凝膠的彈性、膠黏性、咀嚼性和硬度整體上都顯著高于中性和弱堿性條件（P＜0.05），這個結(jié)果與流變特性的結(jié)果一致，弱酸條件下混合蛋白熱凝膠的G′值較高，對應(yīng)的質(zhì)構(gòu)特性得到了改善。當pH 6.5 時，混合蛋白熱凝膠的硬度和膠黏性相比FPI，都得到提升。說明pH 6.5 的條件下，添加同濃度的大豆蛋白能顯著提高FPI 的硬度和膠黏性（P＜0.05）。

2.3 pH 值對混合蛋白凝膠持水性的影響

pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠持水性的影響見圖3。

圖3 pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠持水性的影響Fig.3 Effect of pH on water holding capacity of heat-induced gel from tilapia protein-soy protein mixtures

持水性反映凝膠中蛋白質(zhì)與水分的結(jié)合程度[24]。如圖3 所示，F(xiàn)PI 凝膠的持水性比SPI 凝膠持水性弱（P＜0.05），凝膠水分和蛋白質(zhì)之間結(jié)合程度較低。隨著pH 值上升，F(xiàn)PI 凝膠的持水性逐漸增強（P＜0.05）。FPI 和SPI 混合后，pH6.0 ～7.0 時，體系的凝膠持水性明顯高于FPI 凝膠的持水性（P＜0.05）?？赡苁荢PI的側(cè)鏈反應(yīng)基團促進肌原纖維蛋白和SPI 之間的相互作用，氫鍵增加，水分與蛋白質(zhì)結(jié)合程度增強，形成一個連續(xù)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[25]。pH 6.5 時，羅非魚-大豆混合蛋白熱凝膠持水性相比其它pH 值條件下混合蛋白熱凝膠持水能力強，達到最大值為84.02%。可能是pH 值會使蛋白質(zhì)分子的離子化作用和凈電荷值發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)與水分子的結(jié)合能力[26]。

2.4 pH 值對混合蛋白凝膠白度的影響

pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠白度的影響見圖4。

圖4 pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠白度的影響Fig.4 Effect of pH on the whiteness of heat-induced gel from tilapia protein-soy protein mixtures

如圖4 所示，SPI 及FPI-SPI 混合蛋白熱凝膠的白度值均低于FPI 凝膠的白度，這可能與大豆分離蛋白本身的顏色有關(guān)。大豆分離蛋白顏色偏黃，將SPI 添加到FPI 中制成凝膠，其白度下降，這個結(jié)果與王博等[27]的結(jié)果一致，SPI 的添加會降低肌原纖維蛋白凝膠的白度值。對于混合體系的熱凝膠，pH 6.0 時白度值顯著高于其它pH 值條件下的白度值。有研究表明，pH 值會影響蛋白質(zhì)分子間作用力[28]，從而影響蛋白質(zhì)的變性，而凝膠的白度與蛋白質(zhì)的變性息息相關(guān)，蛋白質(zhì)的變性程度越大，白度值越高。凝膠的動態(tài)黏彈性、質(zhì)構(gòu)特性的結(jié)果是pH 6.5 時蛋白質(zhì)變性程度最大，形成的凝膠性能最好，而白度值的結(jié)果是pH 6.0 時白度值最大，這是由于白度不僅取決于蛋白質(zhì)變性、聚合程度，還取決于表面的光學特性[29]，致密的蛋白質(zhì)凝膠基質(zhì)可能導(dǎo)致更多的光從凝膠表面反射，從而導(dǎo)致顏色略顯明亮，這可能與混合蛋白的微觀結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.5 pH 值對混合蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響

pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響見圖5。

FPI 凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)松散，凝膠微觀孔隙較大。而SPI 溶解性較好，較強的分子間相互作用促進熱處理過程中分子間的締合作用，形成凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為連續(xù)且孔洞小[30]，因此，SPI 凝膠孔徑比FPI 凝膠小，分布均勻。FPI 和SPI 混合凝膠與FPI 凝膠相比，孔隙減小，致密均勻，更加平整?？赡苁菬崽幚硎勾蠖骨虻鞍纂逆溋呀?，反應(yīng)基團暴露[31]，肌原纖維蛋白通過疏水作用力和二硫鍵與大豆分離蛋白分子聚集更加緊密，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)孔洞小，均勻?qū)ΨQ。這種結(jié)構(gòu)使蛋白和水之間的作用力更強，形成凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。相比其它pH 值條件下，混合蛋白熱凝膠在pH 值為6.0 時其凝膠結(jié)構(gòu)為多孔的致密網(wǎng)狀，凝膠基質(zhì)中水分更多釋放到凝膠表面，持水能力差，促進光散射作用，進而會增加凝膠白度[32]，這個結(jié)果進一步驗證了pH 6.0 時白度值最大的結(jié)論。其它pH 值條件下混合蛋白熱凝膠表面呈片狀少孔，其中pH 6.5 條件下混合蛋白凝膠光滑平整，致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更好鎖住凝膠內(nèi)部水分。

圖5 pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠掃描電鏡圖（×10 000）的影響Fig.5 Effect of pH on scanning electron micrograph（×10 000）of heat-induced gel from tilapia protein-soy protein mixtures

2.6 pH 值對混合蛋白凝膠體外消化性的影響

pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合蛋白凝膠體外消化性的影響見圖6。

食物的微觀和宏觀結(jié)構(gòu)以及聚集體的形態(tài)，都會對其消化程度產(chǎn)生影響[33]。如圖6 所示，F(xiàn)PI 熱凝膠的消化率明顯高于SPI 熱凝膠的消化率（P＜0.05），這可能與凝膠的結(jié)構(gòu)有關(guān)，從掃描電鏡的結(jié)果可以看出SPI 凝膠結(jié)構(gòu)比FPI 凝膠的結(jié)構(gòu)更加致密，降低與消化酶的反應(yīng)，從而降低了SPI 凝膠的消化率，有研究顯示SPI 為氨基酸間相聯(lián)結(jié)形成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，緊密的分子結(jié)構(gòu)能夠?qū)γ附庾饔卯a(chǎn)生較強的抵抗力[34]。pH 值為6.0、6.5 時，F(xiàn)PI 和SPI 兩種蛋白混合后凝膠的消化率明顯比SPI 熱凝膠的消化率高（P＜0.05）。當pH 值為6.5 時，羅非魚-大豆混合蛋白熱凝膠的消化率達91.57%，高于其它pH 值下的消化率，這可能是由于FPI 和SPI 混合蛋白在該pH 值下蛋白質(zhì)分子中的非共價相互作用（氫、離子和疏水鍵），從而影響二級和三級結(jié)構(gòu)[35]。二級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著的變化，熱誘導(dǎo)凝膠的蛋白質(zhì)β-折疊含量會降低，無規(guī)則卷曲的含量會提高[36]，蛋白質(zhì)的無規(guī)則卷曲的含量與體外消化率成正相關(guān)，隨著無規(guī)則卷曲含量的升高，體外消化率也有所提高。

圖6 pH 值對羅非魚蛋白-大豆蛋白混合熱誘導(dǎo)凝膠體外消化性的影響Fig.6 Effect of pH on in vitro digestibility of heat-induced gel from tilapia protein-soy protein mixtures

3 結(jié)論

本研究探討不同pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5）對羅非魚-大豆混合蛋白熱凝膠特性和體外消化特性的影響。結(jié)果表明添加SPI 使得混合蛋白形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密，持水性增強，在弱酸條件混合體系的凝膠特性、膠黏性和硬度整體上都顯著高于中性和弱堿性條件（P＜0.05），體外消化率明顯優(yōu)于SPI 的消化率（P＜0.05）。pH 值為6.5 時，混合蛋白的凝膠質(zhì)構(gòu)最好；持水性比SPI 高14.8%～39.6%；體外消化性優(yōu)于其它pH 值條件下的混合蛋白凝膠。綜上，羅非魚分離蛋白和大豆分離蛋白混合制備的熱凝膠特性以及體外消化特性得到明顯的改善，且pH 6.5 時凝膠質(zhì)構(gòu)、持水性、微觀結(jié)構(gòu)、體外消化特性最好?？傊p蛋白凝膠特性及消化性的相關(guān)研究還需要進一步探討兩種蛋白混合比例，可通過調(diào)節(jié)pH 值提高混合蛋白凝膠的加工品質(zhì)和營養(yǎng)價值，為新型雙蛋白凝膠制品在食品加工應(yīng)用提供借鑒與指導(dǎo)。