雙酚A熒光檢測方法的建立及應用

汪海洋，江姍姍，徐龍華

（山東農業(yè)大學食品科學與工程學院山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東泰安271018）

雙酚A（Bisphenol A），結構式如圖1 所示，化學式為C15H16O2，學名為2，2-二（4-羥基苯基）丙烷，簡稱二酚基丙烷。

圖1 雙酚A 的結構式Fig.1 Chemical structure of bisphenol A

雙酚A 是一種重要的有機化工原料，主要用于生產環(huán)氧樹脂、聚碳酸酯等多種高分子材料，是目前中國需求量增長最快的化工產品之一[1]，其作為功能單體可以使材料無色透明、輕巧耐用和防沖擊[2]，在合成過程中不完全的聚合反應，及后續(xù)使用過程中的分解，都可能導致雙酚A 單體殘留，進而遷移到環(huán)境和食品中[3]。由于環(huán)境的污染，使得雙酚A 無處不在，從礦泉水瓶、醫(yī)療器械到食品包裝的內里，都有它的身影[4-5]。雙酚A 作為典型的環(huán)境激素類物質，長時間低劑量暴露，會對人體的內分泌系統、神經系統、免疫系統和生殖系統等構成危害，甚至存在誘發(fā)癌癥的風險[6-9]，因此，雙酚A 的檢測倍受關注，推動著其檢測技術的進步與發(fā)展。

目前，雙酚A 的各種檢測方法，如酶聯免疫吸附法[10-12]、熒光分光光度法、電化學分析法[13]、氣相色譜法、高效液相色譜法[14]、氣相色譜串聯質譜聯法[15]、液相色譜串聯質譜法[16-17]均已建立。其中熒光檢測以其操作簡單、靈敏度高、選擇性好、響應時間短等優(yōu)勢，成為開發(fā)雙酚A 快速精準檢測方法的首選。針對雙酚A的熒光檢測方法可以分為兩大類，一類是利用雙酚A自身熒光特性所建立的檢測方法，另一類是通過引入熒光染料、量子點、金納米顆粒等外源性熒光信號物質，基于雙酚A 與外源性物質熒光信號之間的相互作用而建立的檢測方法。

1 基于雙酚A 自身熒光特性建立的檢測方法

1.1 熒光分光光度法

熒光分光光度法是根據物質分子吸收光譜和熒光光譜能級躍遷機理進行物質鑒定和含量測定的方法[18]。雙酚A 分子存在共軛體系，在特定波長光激發(fā)后能產生熒光，從而對其進行定量檢測。唐舒雅等[19]基于在pH 1 的酸性介質中，利用β-環(huán)糊精對雙酚A 熒光強度的增強作用，建立了水樣中雙酚A 殘留檢測的熒光分光光度法，該法的線性范圍為0.4 μg/L ～300.0 μg/L，相對標準偏差為1.3%，檢出限為0.020 μg/L，并應用該方法于聚碳酸酯膜（polycarbonate，PC）浸泡水樣中雙酚A 殘留量測定。余宇燕等[20]采用β-環(huán)糊精包被雙酚A，由于β-環(huán)糊精具有的疏水性內腔可以減少雙酚A分子旋轉自由度及水的松弛效應，避免外界空氣、水、離子對產生的熒光單重態(tài)的干擾，從而使雙酚A 熒光量子產率增大，實現了食品包裝材料中雙酚A 熒光定量檢測，在pH 4，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為282 和318 nm 時，該方法的檢出限為0.2 μg/L，線性范圍為1 μg/L ～10 μg/L，回收率為98%～102%。

1.2 高效液相色譜-熒光檢測法

高效液相色譜是目前有機物分析的常用方法，由于熒光檢測的靈敏度要高于紫外，而雙酚A 本身具有熒光特性，因此高效液相色譜-熒光檢測在雙酚A 定性定量分析中得以廣泛應用。葛宇等[21]以乙腈作為提取液，用超聲輔助提取的方式，采用ZORBAX SB-C18柱分離，熒光檢測器檢測，建立了罐頭食品中雙酚A和6 種雙酚A 二縮水甘油醚衍生物含量的高效液相色譜-熒光檢測法，該方法的檢出限在0.04 mg/L ～0.1 mg/L范圍內。賴紅娟等[22]同樣采用超聲輔助提取，以甲醇-四氫呋喃（70∶30，體積比）作為提取液，建立了一次性紙杯中雙酚A 高效液相色譜-熒光檢測方法，雙酚A在0.5 mg/L～50.0 mg/L 線性范圍內呈現良好的線性關系，相關系數為0.999 8，相對標準偏差為3.10%～5.20%，檢出限為0.05 mg/L。于杰等[23]采用高效液相色譜-熒光法對食品包裝材料中雙酚A 及雙酚S 的遷移量進行測定，該方法在0.001 μg/L～0.100 μg/L 范圍內線性關系良好，并采用此方法研究了不同模擬液對食品包裝材料中雙酚A 和雙酚S 遷移量及遷移特性。Tu等[24]等采用糖化輔助液-液萃取前處理與高效液相色譜-熒光法測定相結合，開發(fā)了復雜基質—蜂王漿中雙酚A 和雙酚B 的同時分析方法，該方法對兩種物質的最低檢出限為16、18 μg/kg，平均添加回收率為88.32%～93.59%、95.14%～97.48%。Li 等[25]設計合成了新型復合材料金屬有機骨架/殼聚糖/聚氧乙烯復合材料并以此作為吸附劑，開發(fā)了渦流輔助固相萃取流程，結合高效液相色譜-熒光檢測方法，實現了塑料包裝的飲料和水中雙酚A 及其結構類似物的檢測，該方法的線性范圍為0.1 mg/L ～20 mg/L，對雙酚A 的檢出限為0.019 μg/L。

此外，通過改進樣品前處理設備，高通量、快速檢測方法也相繼被建立。Guo 等[26]利用DryLab 軟件建立了一種基于高效液相色譜-熒光檢測（high performance liquid chromatography fluorescence detector，HPLC -FLD）方法，對分離孔進行了優(yōu)化設計，快速測定罐頭食品中雙酚A 及其衍生物，在包括平衡時間在內的5 min內實現了充分的分離，雙酚A 檢出限為0.01 μg/kg，分析回收率為70.46%～103.44%。Lopes 等[27]將一種中空纖維再生液膜萃取與96 孔板體系相結合，采用高效液相色譜-熒光和二極管陣列檢測，實現了水樣中雙酚A、4-壬基酚、對辛基苯酚、叔辛基苯酚、對羥基苯甲酸甲酯、羥苯乙酯的高通量分析檢測，其對雙酚A 的檢出限可達8 μg/L。

1.3 熒光光譜與統計學結合分析方法

隨著分析數據日益復雜，傳統的分析手段已經不能滿足復雜分析的需求，熒光光譜技術與化學計量學、統計學相結合成為實現復雜體系中雙酚A 準確分析的重要手段，得到各國學者的廣泛認可。Spagnuolo等[28]將化學計量學二階校正法與激發(fā)-發(fā)射矩陣熒光光譜相結合，采用平行因子法對所得數據進行分析，建立了非分離、簡便、快速的雙酚A 光譜熒光測定方法，實現了聚碳酸酯杯中雙酚A 遷移量的測定，該方法的具有較寬的線性范圍0～720 μg/L。Chen 等[29]也采用激發(fā)-發(fā)射矩陣熒光光譜與化學計量學二階校正方法相結合，實現了聚碳酸酯塑料中雙酚A 和碳酸二苯酯2 種組分的同時測定，該方法對兩種物質的最低檢出限分別為0.04、1.18×103μg/L，平均添加回收率分別為99.35%和83.50%。

1.4 便攜式遠程實時熒光檢測方法

便攜式遠程檢測平臺的搭建，對于環(huán)境及其他介質中雙酚A 污染暴露水平的快速檢測和實時監(jiān)測均具有重要意義。Long 等[30]構建了便攜式、自動化熒光微陣列生物傳感平臺（fluorescence microarray biosensing platform，FMB），通過光纖開關的控制，在時間分辨效應的基礎上，借助激發(fā)光源和光電二極管探測器可實現對于雙酚A 的四通道并行熒光檢測，其檢出限為0.03 μg/L。此外，隨著智能設備的發(fā)展和普及，有研究者將將熒光光譜與智能手機端相結合應用于水樣中雙酚A 的檢測[31]，效果理想。

2 基于外源性熒光物質檢測雙酚A 的方法

利用雙酚A 與外源性熒光物質之間的熒光響應行為，是目前實現雙酚A 熒光檢測的常用手段。隨著材料學的發(fā)展，外源性熒光物質也從最初的熒光染料發(fā)展到現在的量子點、碳點、金納米顆粒、上轉換納米顆粒等，帶動了雙酚A 的熒光檢測技術的不斷發(fā)展和完善。

2.1 基于傳統有機熒光染料的熒光檢測

常用的有機熒光染料標記物是熒光素類以及羅丹明類染料。和熒光素相比，羅丹明類標記物的熒光產率較小，但其發(fā)射波長較長，樣品背景干擾較小[32]。王廣軍等[33]基于酸性介質中雙酚A 對溴酸鉀氧化丁基羅丹明B 熒光猝滅具有抑制作用，建立了抑制動力學熒光法測定痕量雙酚A。方法的線性范圍0.08 mg/L～0.88 mg/L，檢出限為0.005 mg/L，回收率在95%～103%之間。該方法可應用于嬰幼兒奶瓶、假牙和地表水中雙酚A 含量的測定。

為了提高熒光探針對雙酚A 的選擇性，Li 等[7]等使用熒光染料AHN 標記適配體，利用核酸適配體與目標物的高親和力和強特異性，結合磁性納米顆粒的快速分離優(yōu)勢，建立了磁響應核酸適配體熒光探針，應用于實際環(huán)境水樣中雙酚A 的高選擇性靈敏檢測，其檢出限為強特異性0.047 μg/L。Hu 等[34]基于熒光素標記的雙酚A 適配體與磁性氧化石墨烯之間的熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET），開發(fā)了雙酚A 高選擇性“turn-on”型熒光檢測方法。磁性氧化石墨烯（magnetismgrapheneoxide，MGO）可吸附熒光素標記的雙酚A 適配體形成復合物，從而有效地抑制熒光素的熒光。而在雙酚A 存在的情況下，抗雙酚A 適配體會傾向于改變其構型與雙酚A 靶標結合，從而在MGO 表面脫附，然后通過磁分離使體系熒光恢復。該生物傳感器具有較強的抗干擾能力和靈敏度，檢測限為0.071 μg/L，線性范圍為0.2 μg/L ～10 μg/L。

2.2 基于半導體量子點（quantum dots，QDs）的熒光檢測

與傳統有機熒光染料相比，量子點具有明顯優(yōu)勢，如可調的寬吸收光譜、窄而對稱的發(fā)射光譜等，廣泛應用于熒光成像和化學傳感領域。通常采用表面功能化修飾，來提高量子點探針的選擇性和靈敏度，使其可以廣泛的應用于不同需求的領域?；陔p酚A 對探針的熒光猝滅效應，Kuang R 等[35]采用半胱胺修飾CdTe QDs 作為探針，建立了奶瓶中痕量雙酚A 熒光猝滅測定方法；Kadam 等[36]用環(huán)糊精功能化ZnO QDs，用于雙酚A 的選擇性檢測，其檢出限為0.19 μg/L（低于水生生物群的毒性限值），可滿足實際檢測需求；Cao 等[37]制備了殼聚糖修飾的硫化鋅量子點ZnS QDs，建立了水和塑料中雙酚A 的定量檢測方法，該法線性范圍為0.50 μg/L ～300 μg/L，檢出限為0.08 μg/L。此外，采用分子印跡技術替代表面修飾，也成為制備高選擇性和特異性熒光探針的通用方法。Kim 等[38]以分子印跡聚合物包被硒化鎘量子點CdSe QDs 作為熒光探針，借助分子印跡聚合物對目標物分子的特異識別性能，實現了雙酚A 高選擇性傳感檢測，與其結構類似物相比對雙酚A 具有更大的猝滅常數。Zhang 等[39]將羧基功能化的磁性納米顆粒與巰基乙胺包封的Mn2+摻雜的ZnS量子點偶聯，結合分子印跡技術合成了磁性核-殼型熒光探針（FeOx/ZnS@MIPs），對雙酚A 的檢出限為0.362 6 μg/L。

2.3 基于碳點（carbon dots，CDs）的熒光檢測

碳點是人們在碳納米材料中發(fā)現的一種具有量子點特性的球狀顆粒，具有獨特的光學特性、良好的生物相容性、低毒性，易于制備且耐光漂白[40]，因其優(yōu)異的性質近年來得到迅速發(fā)展。在食品檢測領域，通常被用來制作各種熒光探針以及傳感器，任悅等[41]制備了碳點修飾的硅膠顆粒SiO2@CDs，基于雙酚A 對KBrO3氧化碳點而導致熒光猝滅的抑制作用，建立了檢測雙酚A 的方法，檢出限為5.2 μg/L，并成功用于塑料制品中雙酚A 的測定。為了降低基質干擾，實現樣品中雙酚A 的特異性檢測，通常引入分子印跡聚合物來提高方法的選擇性，Liu 等[42]采用原位水熱合成法制備了分子印跡聚合物基體包覆碳點的熒光生物傳感器，并基于此傳感器成功建立了一種雙酚A 的熒光檢測方法，方法檢測限為30 nmol/L，成功應用于河流水樣的檢測。Wang 等[43]基于適配體的特異性識別和AuNPs 對氮摻雜碳點的熒光的抑制作用，建立了一種快速簡便、低成本的雙酚A 檢測方法，方法檢出限為3.3 nmol/L，并成功應用于自來水樣品中的雙酚A檢測。氮摻雜碳點對環(huán)境友好、經濟有效，具有優(yōu)異的光致發(fā)光性能，通過摻雜和功能化能夠改變其光學性質，提高量子產率，同樣可應用于雙酚A 檢測領域[44]。

2.4 基于上轉換納米顆粒的熒光檢測

傳統的下轉換熒光材料的發(fā)光過程是將高頻激發(fā)光轉為低頻發(fā)射光，發(fā)出的能量小于吸收的能量，可能會導致發(fā)光效率低、靈敏度低等問題，為了解決這些問題，可以制備具有強熒光效率的上轉換納米粒子來替代傳統的熒光粒子，而且上轉換納米粒子可以進行定量修飾，更加拓寬了它的應用范圍。Li 等[45]采用了一種修飾了的上轉換納米顆粒（up conversion nanoparti cles，UCNPs）與四甲基羅丹明之間的熒光共振能量轉移效應，建立了一種用于痕量雙酚A 檢測的超靈敏傳感器，在最佳檢測條件下，547 nm 處UCNPs 的峰值強度與雙酚A 濃度的對數呈線性關系，檢測限為0.05 ng/mL，自來水、河水和一次性紙杯水的回收率一般在91.0%～115.0%之間。為了進一步縮短檢測時間，簡化操作步驟，Sheng 等[46]使用抗雙酚A 抗體偶聯羧基功能化的上轉換發(fā)光納米顆粒作為信號探針，包被抗原共軛羧基功能化的磁性聚苯乙烯微球作為捕獲探針，建立了一種靈敏的熒光免疫分析法來檢測桶裝飲用水以及瓶裝礦泉水中的雙酚A，水樣中雙酚A 的檢出限為0.02 μg/L。

2.5 基于雙發(fā)射熒光檢測

目前，大多數熒光探針都是通過單發(fā)射信號的熒光響應變化來達到檢測的目的，但這種單一的信號變化很容易受到外部因素的干擾，所以近年來一些熒光校正的方法得到了快速的發(fā)展，比如利用探針的雙發(fā)射熒光可對比的特性進行校正，Xiang 等[47]提出了一種簡單有效的熒光納米傳感器的設計方法，在染料摻雜的二氧化硅納米顆粒表面涂覆碳點，制備了雙酚A 雙發(fā)射納米傳感器。雙發(fā)射二氧化硅納米粒子的熒光在鹽酸中被溴酸鉀氧化猝滅（雙酚A 抑制KBrO3氧化，導致雙發(fā)射二氧化硅納米顆粒的比色熒光反應），基于此效應，建立了一種雙酚A 熒光檢測方法，其檢出限為0.80 ng/mL，該方法已成功應用于不同塑料制品浸出液中雙酚A 的測定。比色熒光傳感器的構建往往涉及繁瑣的制備過程或者復雜的修飾過程，雙發(fā)射熒光納米粒子的出現則大大簡化了傳感器的制備過程及修飾過程，Lu 等[48]研究了一種基于雙發(fā)射納米顆粒（dual emission nanoparticles，D-NPs）的比率熒光分子印跡傳感器用于雙酚A 的檢測，該納米顆粒由碳點和金納米團簇組成，提高了傳感器的靈敏度，其檢測限為29 nmol/L，并成功用于水樣、罐頭食品以及塑料制品中雙酚A 的檢測。

3 展望

現有雙酚A 常用的檢測分析方法雖然精準化、多樣化，但是在簡便性和快捷性方面還有待進一步提高，比如實驗室多用色譜法來檢測雙酚A，但色譜法需要繁瑣的前處理過程，檢測周期較長，檢測成本較高，且不適用于現場快速檢測。熒光檢測方法使用儀器簡單，檢測靈敏度高、選擇性好、響應時間短，是一種經濟有效的檢測方法，現有的熒光檢測技術慢慢突破了傳統熒光技術的限制，如上轉換納米材料可以將低能光轉化為高能光，與下轉換熒光納米材料相比，解決了發(fā)光效率低、靈敏度低等問題；雙發(fā)射熒光的此消彼長特性可以進行熒光的自我校正，大大降低了外部因素對熒光信號的干擾，其他熒光檢測方法的有效改進也在穩(wěn)步進行，相信熒光檢測法在雙酚A 的檢測領域中會有巨大的發(fā)展前景。